木薯干旱脅迫響應(yīng)基因MeGSTU7自然變異分析

鄧德力　王斌　曾長英　郭鑫　彭明

摘 要 在2個(gè)木薯品種中檢測MeGSTU7基因在不同干旱脅迫階段的表達(dá)量變化，并克隆測序了60個(gè)木薯品種的基因區(qū)DNA序列，分析基因核苷酸多態(tài)性及其自然變異，并將核苷酸多態(tài)性與干旱脅迫表型關(guān)聯(lián)分析，挖掘優(yōu)等位變異。結(jié)果表明，干旱脅迫條件下，2個(gè)品種的MeGSTU7的表達(dá)量均上調(diào)。MeGSTU7基因區(qū)核苷酸變異豐富，共有23個(gè)SNP位點(diǎn)，A/G突變?yōu)橹?；外顯子區(qū)總計(jì)10個(gè)同義突變，12個(gè)非同義突變；外顯子區(qū)在品種資源群體中有4種主要單倍型，所有的單倍型分為兩大類，分子進(jìn)化分析表明，MeGSTU7的外顯子區(qū)的兩端受到很強(qiáng)的正選擇作用；Q+K+MLM混合線性模型關(guān)聯(lián)分析結(jié)果表明，1個(gè)Indel和2個(gè)SNP與干旱脅迫下地上部鮮重耐旱系數(shù)顯著關(guān)聯(lián)，并篩選得到了優(yōu)等位變異。

關(guān)鍵詞 谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶；MeGSTU7；木薯；抗旱；自然變異；單倍型

中圖分類號(hào) S533 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract Glutathione-S-transferase（GST）plays an important role in glutathione conjugation reaction and involves in many physiological and biochemical reaction in plants including stress resistance， primary metabolism and cellular signal transduction. MeGSTU7 codes GST in cassava（Manihot esculenta crantz）. In order to research the function of MeGSTU7 in drought-resisting， the expression quantity of MeGSTU7 was detected in two cassava varieties which are tolerant and sensitive to water stress in different degrees of drought stress. MeGSTU7 was cloned from 60 cassava varieties and sequenced. Sequceces were analyzed to study the single nucleotide polymorphism（SNP）and the natural variation. Correlation analysis between single nucleotide polymorphism and drought phenotype was made to select the excellent allelic variations. The results indicated that the expression of MeGSTU7 in two cassava varieties were up-regulated under drought stress. Nucleotide polymorphism in the gene regions of MeGSTU7 was abundant with 23 SNP among which the A/G mutation type was the major. There were 10 synonymous changes and 12 replacement changes in exon regions. All of the haplotypes were divided into two types among which 4 haplotypes were the major in population. Molecular evolution showed that intense positive selection function at the ends of the exon in MeGSTU7. By Q+K+MLM mixed linear model， one Indel and 2 SNP were significantly associated with the fresh weight of aerial parts in the stress of drought and excellent allelic variations were selected. In conclusion， this paper lays a good foundation for further research of the function of MeGSTU7 in drought resistant and the selection of excellent allelic variations.

Key words Glutathione-S-transferase； MeGSTU7； Cassava； Drought-resisting； Natural variation； Haploidtype

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.11.011

谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（glutathione-S-transferase， GST）在谷胱甘肽（glutathione， GSH）結(jié)合反應(yīng)時(shí)起到關(guān)鍵作用，催化谷胱甘肽結(jié)合反應(yīng)的起始。植物中，所有GSTs蛋白都是由2個(gè)25 ku亞基組成的蛋白二聚體，每一個(gè)GST亞基包含獨(dú)立的催化位點(diǎn)[1]。谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶超家族（GST）可根據(jù)蛋白序列相似性以及基因結(jié)構(gòu)分為六大類：phi（F）、tau（U）、theta（T）、zeta（Z）、lambda（L）和dehydroascorbate reductase（DHAR）[2]。MeGSTU7蛋白屬于tau（U）類，該類型谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶是植物中所特有的[3]。

1.2.8 基因結(jié)構(gòu)分析 在JGI數(shù)據(jù)庫phytozome10（http：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）的木薯基因組序列，獲得木薯品種AM560的MeGSTU7基因的CDS序列（coding sequence）以及DNA序列（genomic sequence），用NCBI的Spidey（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/IEB/Research/Ostell/Spidey/）分析其基因結(jié)構(gòu)，并用DNAMAN軟件繪制基因結(jié)構(gòu)圖。

1.2.9 序列多樣性分析 利用MEGA4.0軟件進(jìn)行序列比對(duì)，對(duì)齊序列之后輸出.MEG格式文件，然后導(dǎo)入DnaSPv5.0軟件[21]分析MeGSTU7基因DNA序列的核苷酸多樣性，包括SNP和Indel的數(shù)目及其在外顯子，內(nèi)含子，保守結(jié)構(gòu)域的分布，同義突變和非同義替換。并統(tǒng)計(jì)氨基酸的極性變換及對(duì)蛋白質(zhì)理化性質(zhì)的影響。

1.2.10 外顯子區(qū)單倍型分析 根據(jù)NCBI的Spidey工具分析的MeGSTU7基因的基因結(jié)構(gòu)，使用BioEdit軟件[22]批量去除5′-UTR和3′-UTR序列以及內(nèi)含子序列，獲得MeGSTU7的CDS序列之后，導(dǎo)入DnaSPv5.0軟件進(jìn)行sliding windows單倍型分析，windows長度設(shè)為45 bp，step長度設(shè)為3 bp，并導(dǎo)出NRF文件。使用Network軟件（Fluxus Technology， Ltd）繪制單倍型網(wǎng)絡(luò)。

1.2.11 SNP與干旱表型的關(guān)聯(lián)分析 使用31對(duì)隨機(jī)分布于木薯基因組上的多態(tài)性SSR標(biāo)記對(duì)60個(gè)品種的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增PCR程序參照Lin等[23]的方法，毛細(xì)管電泳檢測，片段統(tǒng)計(jì)方法參照Wang等[18]的方法。最終得到83個(gè)多態(tài)性片段。將SSR基因型數(shù)據(jù)導(dǎo)入Structure軟件[18]進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)分析，burnin和MCMC分別設(shè)為100 000和100 000，K值從1到10，每個(gè)K值重復(fù)3次，根據(jù)隨著K值的變化，LnP（D）值大小及△K的拐點(diǎn)判斷K=6，然后用CLUMPP軟件[24]合并K=6對(duì)應(yīng)的3個(gè)Q值矩陣，輸出結(jié)果作為協(xié)方差導(dǎo)入TASSEL2.1軟件進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。同時(shí)利用31個(gè)SSR標(biāo)記的基因型信息導(dǎo)入TASSEL軟件計(jì)算Kinship矩陣。

單個(gè)SNP位點(diǎn)與干旱表型導(dǎo)入TASSEL軟件，利用SSR分型的數(shù)據(jù)計(jì)算家系效應(yīng)和群體結(jié)構(gòu)將兩者作為協(xié)方差進(jìn)行Q+K+MLM的關(guān)聯(lián)分析，分析結(jié)果參照Benjamin的方法[18]進(jìn)行P值糾正，糾正后的P值<0.05時(shí)，就表示該SNP位點(diǎn)是與干旱表型顯著關(guān)聯(lián)。SNP位點(diǎn)優(yōu)等位變異表型值的計(jì)算參照文自翔等[25]的方法。單倍型間干旱表型的方差分析使用SPSS18.0軟件進(jìn)行分析。將MeGSTU7基因區(qū)的SNP數(shù)據(jù)導(dǎo)入TASSEL，利用Q+K+MLM混合線性模型進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，剔除MAF<5%的SNP位點(diǎn)，并將P值用FDR方法糾正。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因結(jié)構(gòu)與蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析

JGI收錄的MeGSTU7基因區(qū)全長985 bp，該基因含有2個(gè)外顯子和1個(gè)內(nèi)含子，2個(gè)外顯子被1個(gè)87 bp的內(nèi)含子隔開。其CDS序列長度為702 bp，編碼233個(gè)氨基酸。本研究克隆的DNA序列包括20 bp 5′-UTR、23 bp 3′-UTR和2個(gè)外顯子區(qū)及1個(gè)內(nèi)含子，總長為832 bp。利用NCBI保守結(jié)構(gòu)域網(wǎng)站對(duì)其氨基酸序列進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析，MeGSTU7所編碼蛋白總長為233個(gè)氨基酸，含有3個(gè)保守結(jié)構(gòu)域（表2），是一個(gè)典型的tau類的GST家族蛋白成員，包括了2個(gè)GST亞基。

2.2 表達(dá)模式

干旱脅迫條件下，兩個(gè)木薯品種的MeGSTU7基因表達(dá)量如圖1所示。干旱脅迫條件下，MeGSTU7基因表達(dá)量均上調(diào)表達(dá)，且在同一干旱脅迫時(shí)間點(diǎn)，MeGSTU7基因在2個(gè)木薯品種表達(dá)量RQ值相近。在干旱14 d并復(fù)水24 h后，MeGSTU7基因在2個(gè)木薯品種中的表達(dá)量迅速下調(diào)，回復(fù)到與對(duì)照組表達(dá)量相當(dāng)?shù)乃健＿@表明：MeGSTU7響應(yīng)干旱脅迫信號(hào)，可能參與了木薯干旱脅迫響應(yīng)信號(hào)途徑。

2.3 單核苷酸多態(tài)性分析

測序區(qū)間覆蓋了20 bp的5′-UTR區(qū)和23 bp的3′-UTR區(qū)，共有27個(gè)單核苷酸多態(tài)性變異位點(diǎn)（SNP），和2個(gè)Indel變異，其中MAF>5%的SNP位點(diǎn)有11個(gè)，稀有SNP有16個(gè)。Indel變異全部位于5′-UTR區(qū)?？傮w27個(gè)SNP位點(diǎn)中，5個(gè)位于UTR區(qū)，內(nèi)含子中只含有1個(gè)SNP位點(diǎn)。SNP類型以A/G突變?yōu)橹鳎浯问荂/T，顛換突變有20個(gè)，轉(zhuǎn)換突變有6個(gè)。在起始密碼子ATG的第24個(gè)核苷酸處，有A/T/G 3種堿基變異（表3）。使用DnaSPv5.0軟件的Sliding windows方法分析MeGSTU7基因核苷酸多樣性，結(jié)果如圖2所示，外顯子區(qū)Pi值在100 bp前后、200 bp前后、550 bp前后、720 bp前后和800 bp達(dá)到較高值，其余部分均在較低水平。這些高Pi值區(qū)域均分布在外顯子區(qū)域，其中前2個(gè)在外顯子1上，后3個(gè)區(qū)域分布在外顯子2上（圖2）。

2個(gè)外顯子區(qū)總計(jì)10個(gè)同義突變，12個(gè)非同義突變。保守結(jié)構(gòu)域包括6個(gè)同義突變和5個(gè)非同義突變（表3）?？傮w11個(gè)2種堿基變異的SNP位點(diǎn)導(dǎo)致10個(gè)氨基酸變異，SNP24有3種堿基變異，導(dǎo)致其所在的密碼子編碼3種不同的氨基酸。總體12個(gè)氨基酸位置的氨基酸變異中，8個(gè)位置的氨基酸種類發(fā)生變異，但不改變氨基酸的極性；4個(gè)位置的氨基酸存在種類變異和極性差異，保守結(jié)構(gòu)域內(nèi)有4個(gè)氨基酸變異，其中1個(gè)氨基酸種類和極性變異位于其tau類GST C端保守結(jié)構(gòu)域內(nèi)，其余3個(gè)僅氨基酸種類發(fā)生變異，并不改變氨基酸的親水性。2個(gè)氨基酸的座位有3種氨基酸種類變異。

2.4 外顯子區(qū)單倍型分析及其分子進(jìn)化分析

對(duì)60份干旱處理木薯品種的MeGSTU7基因進(jìn)行單倍型分析，結(jié)果表明60個(gè)品種共分為28種單倍型，包括4種主要單倍型（P>0.05）（圖3和表4），分為兩大類TypeⅠ和TypeⅡ。TypeⅠ包括Hap7、Hap15及其衍生的9種單倍型；TypeⅡ包括Hap1、Hap2及其衍生的15種單倍型。Hap2、Hap15、Hap7和Hap1包括的品種數(shù)占總體群體大小的比例分別為48.3%、20%、16.7%和15%。4種主要單倍型之間存在4個(gè)SNP變異，其中3個(gè)同義突變，1個(gè)非同義突變。60個(gè)木薯品種的MeGSTU7基因包括2種單倍型雜合和僅1種單倍型的品種數(shù)各占總體的50%。對(duì)單倍型的兩大類型進(jìn)行分子進(jìn)化分析（Ka/Ks），結(jié)果如圖4所示，在MeGSTU7的cDNA的5′端40～45 bp堿基處和3′端679～687 bp堿基處均檢測到Ka/Ks>>1，說明在這兩個(gè)位置，受到極顯著的正選擇作用。

2.5 MeGSTU7基因區(qū)SNP與干旱表型關(guān)聯(lián)分析

經(jīng)關(guān)聯(lián)分析得到了1個(gè)Indel標(biāo)記和2個(gè)SNP標(biāo)記與地上部鮮重的耐旱系數(shù)顯著關(guān)聯(lián)。結(jié)果如表5所示，Indel10是位于5′-UTR區(qū)的單堿基插入/缺失多態(tài)性位點(diǎn)，其對(duì)表型變異解釋率達(dá)到了12.0%，優(yōu)等位變異為A單堿基插入，其表型值為0.139；SNP93位于第1外顯子的A/T變異，但是該位點(diǎn)的SNP為同義突變，不導(dǎo)致氨基酸變異。SNP93對(duì)表型變異解釋率為11.26%，優(yōu)等位變異為A，其表型值為0.047；SNP525位于第2外顯子，該位點(diǎn)為非同義突變，編碼氨基酸為谷氨酰胺/組氨酸，對(duì)表型變異解釋率為10.25%，優(yōu)等位變異為G，其表型值為0.06。本研究還比較了4種主要單倍型，發(fā)現(xiàn)4種主要單倍型的平均值不存在顯著性差異，方差分析和多重比較均未達(dá)到顯著性水平。

3 討論與結(jié)論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示MeGSTU7蛋白包含了一個(gè)C端tau類谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶α螺旋結(jié)構(gòu)域；一個(gè)N端硫氧還蛋白折疊結(jié)構(gòu)域。2006年， 楊海靈等[26]對(duì)谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了總結(jié)，C端的谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶α螺旋結(jié)構(gòu)域和N端的硫氧還蛋白折疊結(jié)構(gòu)域正是谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶的典型三級(jí)結(jié)構(gòu)。由此可知，木薯MeGSTU7基因是一個(gè)典型的谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶編碼基因。

本研究熒光定量PCR結(jié)果表明MeGSTU7基因響應(yīng)干旱脅迫，且對(duì)水分信號(hào)十分敏感，在復(fù)水24 h后其表達(dá)量迅速下調(diào)。說明了MeGSTU7的表達(dá)受逆境誘導(dǎo)，與前人研究結(jié)果相符[10]。而復(fù)水24 h后其表達(dá)量迅速下調(diào)至正常水平的原因，可能是因?yàn)閺?fù)水過后木薯生理生化反應(yīng)改變，體內(nèi)自由基等有害物質(zhì)減少，從而刺激信號(hào)傳導(dǎo)，引起內(nèi)源調(diào)節(jié)基因?qū)eGSTU7表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)。2012年，梁明[27]的研究顯示，桑樹干旱復(fù)水后，體內(nèi)主要保護(hù)酶如超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）的活性回復(fù)到正常澆水水平。MeGSTU7基因表達(dá)的響應(yīng)機(jī)理有可能如上述所說。2000年，Loyall等[6]的研究顯示，GSTs可作為脅迫信號(hào)蛋白，在植物受到脅迫時(shí)起到信號(hào)傳導(dǎo)作用。因此，對(duì)于MeGSTU7基因在木薯干旱復(fù)水后表達(dá)量迅速下調(diào)回復(fù)到正常澆水水平的另一種可能的解釋是MeGSTU7在木薯受到干旱脅迫時(shí)是作為脅迫信號(hào)蛋白行使功能。但確切的解釋和內(nèi)在機(jī)制有待進(jìn)一步的研究。

MeGSTU7基因變異豐富，SNP位點(diǎn)多且主要集中在CDS序列兩端的外顯子上。非同義突變?cè)诳係NP位點(diǎn)中所占比例大，可能會(huì)影響到所編碼蛋白的理化性質(zhì)及高級(jí)結(jié)構(gòu)，從而對(duì)酶活性產(chǎn)生影響。MeGSTU7基因在60份木薯品種中存在4種主要單倍型，4種主要單倍型之間只有4個(gè)SNP的差異，其中兩個(gè)SNP與干旱脅迫下木薯地上部鮮重耐旱系數(shù)顯著關(guān)聯(lián)，但是在4種主要單倍型之間，地上部鮮重耐旱系數(shù)平均值差異不顯著。4種主要單倍型分為兩大類，分子進(jìn)化分析顯示，在這兩大類單倍型基因區(qū)兩端會(huì)受到正向選擇作用，人們?cè)谂嘤呖购敌阅臼磉^程中，對(duì)表型的篩選可能會(huì)將這些優(yōu)等位基因變異固定下來。在所有SNP中，只有2個(gè)SNP和一個(gè)Indel與干旱表型有關(guān)聯(lián)。Indel位于5′UTR區(qū)，可能是無意義的關(guān)聯(lián)，也可能是由于與其他功能SNP處于單倍型之中，也可能是具有功能的插入/缺失突變，但具體的原因需要重復(fù)實(shí)驗(yàn)和基因功能方面的研究證據(jù)。2個(gè)關(guān)聯(lián)SNP有1個(gè)是同義突變，1個(gè)非同義突變，SNP93可能是與SNP525處于強(qiáng)連鎖不平衡狀態(tài)，所以被一起檢測到。SNP525是位于第二外顯子區(qū)的非同義突變，并且位于C端GST亞基上，可能是具有功能的SNP突變位點(diǎn)?？傊?，本研究的結(jié)果為進(jìn)一步研究MeGSTU7基因自然變異與木薯抗旱的關(guān)系，深入研究堿基變異與基因表達(dá)和功能之間的聯(lián)系提供了證據(jù)。

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