江勝德　郭蘭　王鄺佳等

摘要 [目的]研究L谷氨酸對(duì)白芨組培苗生長(zhǎng)生理的影響。[方法]從葉綠素生物合成機(jī)理、礦質(zhì)元素吸收機(jī)理出發(fā)，在MS培養(yǎng)基中添加不同濃度的L谷氨酸，測(cè)定不同處理的白芨組培苗葉綠素含量、礦質(zhì)元素的含量及生物量。[結(jié)果]當(dāng)谷氨酸濃度為200 mg/L時(shí)，白芨組培苗對(duì)礦質(zhì)元素P、Mg的吸收量最大，同時(shí)生物量和葉片葉綠素含量達(dá)到最大。[結(jié)論]在培養(yǎng)基中添加L谷氨酸對(duì)白芨組培苗生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用。

關(guān)鍵詞 L谷氨酸；白芨組培苗；葉綠素；礦質(zhì)元素；生長(zhǎng)；影響

中圖分類號(hào) S567 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2015）20-143-03

Abstract [Objective] The research aimed to study the effects of Lglutamic acid on the growth physiology of tissue culture seedlings of Bletilla striata. [Method]Starting from the chlorophyll biosynthesis mechanisms and absorption mechanism of mineral elements，adding different concentrations of L glutamic acid in the MS medium，the chlorophyll content，mineral elements content and biomass of different treatments from tissue culture seedlings of Bletilla striata were measured.[Result]When the glutamate concentration of 200 mg/L，the absorptive amount of mineral elements P and Mg from tissue culture seedlings of Bletilla striata were maximum，the biomass and chlorophyll content reached the maximum at the same time.[Conclusion]Lglutamic acid was added in the culture medium，which had a promoting effect on the growth of tissue culture seedlings of Bletilla striata.

Key words Lglutamic acid；Tissue culture seedlings of Bletilla striata；Chlorophyll；Mineral elements；Growth；Effects

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)植物組培技術(shù)發(fā)展迅速。在植物組織培養(yǎng)過(guò)程中，植物體的生長(zhǎng)方式主要分為靠培養(yǎng)基中的糖提供的碳源生長(zhǎng)（異養(yǎng)）和靠自身光合作用進(jìn)行自然生長(zhǎng)（自養(yǎng)）2種。傳統(tǒng)的組培方式必須在培養(yǎng)基中添加糖以提供碳源，但組培苗長(zhǎng)期靠異養(yǎng)進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖就會(huì)出現(xiàn)葉片小、氣孔開(kāi)閉功能差等影響組培苗的光合作用，最終導(dǎo)致植株失去自養(yǎng)的能力[1]。因此在組織培養(yǎng)中必須提高組培苗的自養(yǎng)能力，而提高自養(yǎng)能力就是要提高組培苗自身的光合作用，葉片中葉綠素的含量是決定組培苗進(jìn)行光合作用的關(guān)鍵。提高葉綠素含量，有利于植物光合作用的進(jìn)行，促進(jìn)碳水化合物的積累，從而促進(jìn)植物生長(zhǎng)[2-4]。L谷氨酸是其他氨基酸的合成前體，也是合成蛋白質(zhì)的重要物質(zhì)，為植物的生長(zhǎng)提供能量物質(zhì)[5-6]。同時(shí)，L谷氨酸也是植物葉綠素合成的起始物質(zhì)，提高植物體內(nèi)L谷氨酸的含量有利于促進(jìn)葉綠素的生物合成，從而提高植物光合作用能力[2，7]。另外，L谷氨酸的添加可以促使植物對(duì)P、Zn、Mg、Cu等礦質(zhì)元素的吸收。

白芨（Bletilla striata（Thunb.）Reichb.f.）花色艷麗、花型優(yōu)雅、葉態(tài)美觀，其干燥的塊莖主要做藥用，具有消腫生肌、改善皮膚營(yíng)養(yǎng)狀況的功效，因此，白芨具有極高的觀賞價(jià)值和藥用價(jià)值[8-10]。由于野生白芨瀕危，現(xiàn)在國(guó)內(nèi)生產(chǎn)大多采用組織培養(yǎng)的方式進(jìn)行快速繁殖以滿足人們的需求，該研究從葉綠素生物合成機(jī)理出發(fā)，在MS培養(yǎng)基中添加不同濃度的L谷氨酸，研究L谷氨酸對(duì)白芨組培苗葉片葉綠素合成及礦質(zhì)元素吸收的影響，以期優(yōu)化白芨組培培養(yǎng)基，對(duì)白芨組培苗的生產(chǎn)及保護(hù)白芨種質(zhì)資源具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

采用蘭科植物白芨為試驗(yàn)材料，在組培室內(nèi)進(jìn)行繼代培養(yǎng)4～5代，選取大小一致的組培苗接種于接種瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)。

1.2 試驗(yàn)方法

以L谷氨酸200、400、600、800 mg/L的濃度梯度分別添加到MS基本培養(yǎng)基中，并加入瓊脂7 g/L、蔗糖30 g/L，且以未添加L谷氨酸為空白對(duì)照組（CK），構(gòu)成5種培養(yǎng)基，每組10次重復(fù)，具體培養(yǎng)基分別為1（MS+0.2 mg/L NAA+2 mg/L 6BA+200 mg/L L谷氨酸）、2（MS+0.2 mg/L NAA+2 mg/L 6BA+400 mg/L L谷氨酸）、3（MS+0.2 mg/L NAA+2 mg/L 6BA+600 mg/L L谷氨酸）、4（MS+0.2 mg/L NAA+2 mg/L 6BA+800 mg/L L谷氨酸）、CK（MS+0.2 mg/L NAA+2 mg/L 6BA+0 mg/L L谷氨酸）。

1.3 培養(yǎng)條件

培養(yǎng)室內(nèi)溫度為恒溫25 ℃，光照強(qiáng)度為2 000～3 000 lx，每天光照12 h，培養(yǎng)時(shí)間為60 d。

1.4 數(shù)據(jù)測(cè)定

1.4.1 組培苗葉片葉綠素含量的測(cè)定。利用便攜式葉綠素儀SPAD502進(jìn)行白芨組培苗葉片葉綠素含量的測(cè)定[11-15]。

1.4.2 組培苗礦質(zhì)元素含量的測(cè)定。

將培養(yǎng)后稱重組培苗在105 ℃殺青20 min后，然后85 ℃恒溫烘干至恒重備用。每組分別取0.1～0.2 g烘干樣品粉碎研磨，并利用H2SO4-H2O2消煮法進(jìn)行消煮，消煮完成得到消煮液，利用釩鉬黃比色法在分光光度計(jì)上測(cè)定P元素；利用火焰光度計(jì)法在火焰光度計(jì)上測(cè)定K元素；每組分別取0.25 g烘干樣品裝入瓷干鍋中在馬弗爐中進(jìn)行灰化處理，灰化溫度525 ℃，燒至灰分近于白色為止，大約1～2 h，灰化結(jié)束后，利用HCl溶解灰分，純水定容至100 ml，冷卻后過(guò)濾，濾液經(jīng)稀釋后利用原子吸收光譜儀測(cè)定Mg元素[16]。

1.4.3 組培苗生物量變化的測(cè)定。

將裝有培養(yǎng)基的接種瓶滅菌冷卻以后，用電子天平稱重計(jì)數(shù)，在超凈工作臺(tái)上將白芨組培苗接種于接種瓶?jī)?nèi)，接種后同樣稱重計(jì)數(shù)，稱重得出的質(zhì)量差即組培苗的初始質(zhì)量；在培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)60 d后，將組培苗取出，用吸水紙將表面水分吸干后稱重計(jì)數(shù)，即培養(yǎng)后組培苗質(zhì)量，培養(yǎng)后組培苗質(zhì)量與初始質(zhì)量的差即組培苗的生物量變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 L谷氨酸對(duì)白芨組培苗葉片葉綠素含量的影響 對(duì)添加L谷氨酸的白芨組培苗葉片葉綠素含量進(jìn)行方差分析，通過(guò)F檢驗(yàn)，葉綠素相伴概率P值為0.044，小于顯著水平0.05，因此，谷氨酸的添加對(duì)白芨組培苗葉綠素含量的變化有顯著性影響。除了600 mg/L處理葉綠素含量低于對(duì)照組（CK），其他處理均高于對(duì)照組（CK）葉綠素含量，且200 mg/L處理葉綠素含量最高。

2.2 L谷氨酸對(duì)白芨組培苗吸收礦質(zhì)元素（P、K、Mg）的影響

測(cè)定培養(yǎng)后白芨組培苗中P、K、Mg的含量，并對(duì)其進(jìn)行方差分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，P、Mg的相伴概率P值分別為0.042、0。K的相伴概率P值則為0.221，可見(jiàn)針對(duì)L谷氨酸的添加，對(duì)白芨組培苗吸收P、Mg有顯著影響，但對(duì)K的吸收無(wú)顯著影響。其中，對(duì)Mg的吸收，各處理組均與空白對(duì)照組（CK）差異顯著，且400 mg/L處理與800 mg/L處理差異顯著；而對(duì)P的吸收，僅200 mg/L處理和600 mg/L處理與空白對(duì)照組（CK）差異顯著（表1）。

2.3 L谷氨酸對(duì)白芨組培苗生物量變化情況的影響

白芨組培苗接種后在培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)60 d，取出稱重計(jì)數(shù)并進(jìn)行方差分析。F檢驗(yàn)表明，其相伴概率P值接近0，表明培養(yǎng)基中L谷氨酸的濃度對(duì)白芨組培苗的生長(zhǎng)有顯著性影響。除400 mg/L處理與800 mg/L處理之間無(wú)顯著差異以外，其余各組處理之間以及各處理與空白對(duì)照組（CK）之間均差異顯著。此外，200 mg/L處理與600 mg/L處理白芨組培苗生物量變化較大，其中200 mg/L處理生物量變化最大，較空白對(duì)照組（CK）重0.99 g（表2）。

3 討論

（1）葉綠素是植物進(jìn)行光合作用的色素，在一定范圍內(nèi)葉綠素含量與光合速率呈正比關(guān)系，即隨著葉綠素含量增加，光合速率隨之增加，因此，植物葉片中葉綠素的含量直接影響植物進(jìn)行光合作用的能力。在培養(yǎng)基中添加L谷氨酸可以促進(jìn)白芨組培苗葉片葉綠素的合成。合成葉綠素的起始物質(zhì)是L谷氨酸[1]，白芨組培苗通過(guò)培養(yǎng)基將L谷氨酸吸收到體內(nèi)，使合成葉綠素的原料增加，促進(jìn)合成葉綠素的反應(yīng)正向進(jìn)行，進(jìn)而提高白芨組培苗葉片內(nèi)葉綠素的含量。很多學(xué)者的研究也證明L谷氨酸可以促進(jìn)植物葉片葉綠素的合成這一觀點(diǎn)[1，7]，如李宗菊等在研究無(wú)糖組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基中添加L谷氨酸，結(jié)果表明，當(dāng)L谷氨酸濃度低于10 mg/L時(shí)，L谷氨酸的添加量與植物葉片葉綠素含量呈正比關(guān)系，即L谷氨酸濃度越大，植物葉綠素含量越高，凈光合速率也隨之升高；但當(dāng)L谷氨酸濃度高于10 mg/L時(shí)，葉綠素的含量會(huì)隨L谷氨酸濃度的升高而降低，當(dāng)L谷氨酸濃度>500 mg/L時(shí)，表現(xiàn)出明顯的抑制作用[1]。此次試驗(yàn)表明，當(dāng)L谷氨酸濃度為200 mg/L時(shí)，白芨組培苗葉片葉綠素含量達(dá)最高，比空白對(duì)照組（CK）高4.966 mg/g，此次試驗(yàn)并未表現(xiàn)出在一定程度范圍內(nèi)，L谷氨酸的濃度與葉綠素含量呈正比關(guān)系，可能是由于不同植物對(duì)L谷氨酸吸收利用率不同。

（2）植物光合作用除受光照、溫度等生態(tài)因子影響外，礦質(zhì)元素的影響也是不容忽視的[17]。礦質(zhì)元素是植物生理代謝的必需元素，對(duì)植物光合作用起至關(guān)重要作用。P元素對(duì)植物代謝活動(dòng)起著重要作用，參與蛋白質(zhì)、碳水化合物的形成與相互轉(zhuǎn)化，且直接參與植物光合作用的同化和光合磷酸化[18]；Mg元素是植物進(jìn)行光合作用的必須元素之一，是植物葉綠素組成成分，其主要作用是維持葉綠體類囊體膜的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，保證對(duì)光能的有效吸收、傳遞和轉(zhuǎn)化[19-23]。所以說(shuō)，增加白芨組培苗對(duì)礦質(zhì)元素P、Mg的吸收就可以提高白芨組培苗的光合作用，進(jìn)而促進(jìn)白芨組培苗快速生長(zhǎng)發(fā)育。在培養(yǎng)基中添加L谷氨酸可以促進(jìn)白芨組培苗對(duì)礦質(zhì)元素的吸收[24]，這是因?yàn)長(zhǎng)谷氨酸分子結(jié)構(gòu)中帶有2個(gè)負(fù)電荷的R基氨基酸可以與P、Mg等金屬陽(yáng)離子絡(luò)合。白芨組培苗在培養(yǎng)基中吸收營(yíng)養(yǎng)的同時(shí)將L谷氨酸絡(luò)合物一并吸收到體內(nèi)，在組培苗體內(nèi)經(jīng)過(guò)生化反應(yīng)，P、Mg等金屬離子得以釋放，進(jìn)而參與到其他生化反應(yīng)過(guò)程中去。此外，在培養(yǎng)基中添加不同濃度的L谷氨酸，組培苗吸收礦質(zhì)元素的效果也不同。

（3）植物生物量的變化可以形象地反映出植物光合作用能力的強(qiáng)弱，在添加不同濃度L谷氨酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)白芨組培苗方式試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)L谷氨酸濃度為200 mg/L時(shí)，白芨組培苗的長(zhǎng)勢(shì)最好，莖粗壯、葉片濃綠有光澤，說(shuō)明適當(dāng)濃度的L谷氨酸可以促進(jìn)白芨組培苗的生長(zhǎng)發(fā)育，分析原因可能有以下幾點(diǎn)：首先，L谷氨酸的添加增加了白芨組培苗對(duì)礦質(zhì)元素的吸收，被吸收的礦質(zhì)元素在植物體內(nèi)經(jīng)過(guò)一系列復(fù)雜的生化反應(yīng)可以合成植物生長(zhǎng)必須的有機(jī)物質(zhì)，如磷會(huì)在植物體內(nèi)合成為核酸、酶類、維生素以及多種重要化合物，磷直接參與碳水化合物、脂肪、蛋白質(zhì)的形成和轉(zhuǎn)；氮可以在植物體內(nèi)合成蛋白質(zhì)、葉綠素、激素等有機(jī)化合物，是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)；鎂是構(gòu)成葉綠素的主要成分；其他未能轉(zhuǎn)化成有機(jī)化合物的礦質(zhì)元素在植物體內(nèi)也以不同的方式協(xié)調(diào)各生理生化反應(yīng)，提高植物本身生物機(jī)能，從而促進(jìn)植物茁壯生長(zhǎng)。另外，L谷氨酸的添加會(huì)促進(jìn)白芨組培苗葉片葉綠素的含量，而葉綠素的含量直接決定植物光合作用的強(qiáng)弱，也就是說(shuō)，L谷氨酸的添加會(huì)促進(jìn)植物進(jìn)行光合作用合成自身生長(zhǎng)的必需有機(jī)物，同時(shí)L谷氨酸促進(jìn)植物吸收的礦質(zhì)元素也可以促進(jìn)植物光合作用，植物的光合作用能力增強(qiáng)，進(jìn)而會(huì)促進(jìn)植物的生長(zhǎng)發(fā)育。

4 結(jié)論

為了研究L谷氨酸對(duì)白芨組培苗生理的影響，該試驗(yàn)從白芨組培苗對(duì)葉片葉綠素的含量變化、礦質(zhì)元素P、K、Mg的吸收情況以及白芨組培苗生物量的變化3個(gè)指標(biāo)來(lái)研究L谷氨酸對(duì)白芨組培苗生理影響。結(jié)果表明，L谷氨酸對(duì)白芨組培苗生理機(jī)能有促進(jìn)作用，且當(dāng)L谷氨酸濃度為200 mg/L時(shí)，是白芨培養(yǎng)基的最佳濃度。因此，在培養(yǎng)基中添加適量的L谷氨酸可以增強(qiáng)白芨組培苗的自養(yǎng)能力，降低培養(yǎng)基中糖的添加量，從而實(shí)現(xiàn)白芨組培苗的減糖甚至無(wú)糖培養(yǎng)。

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