響應(yīng)面法優(yōu)化脫脂米糠球蛋白提取工藝

范馨文　翟愛華

摘要 [目的]確定脫脂米糠球蛋白的最佳提取工藝。[方法]采用響應(yīng)面分析法，優(yōu)化由Osboren法提取出米糠球蛋白的提取條件，研究提取溫度、料液比、提取時間和NaCl濃度對米糠球蛋白純度的影響。[結(jié)果]試驗(yàn)表明，提取米糠球蛋白的最佳條件為料液比1∶12.06 g/ml、提取溫度40.40 ℃、提取時間3.44 h、NaCl濃度2.04%。[結(jié)論] 研究可為今后米糠產(chǎn)品的深度開發(fā)和利用提供理論參考。

關(guān)鍵詞 Osboren法；米糠球蛋白；響應(yīng)面分析

中圖分類號 S509.9 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2015）20-255-04

Abstract [Objective] To determine the optimal extraction technique for defatted rice bran globulin. [Method] Using response surface analysis method， the extraction conditions for rice bran globulin was optimized with Osboren method， the effects of extraction temperature， solidliquid ratio， time and NaCl concentration on purity of rice bran globulin were studied. [Result] Results indicated that the best process conditions of globulin of defatted rice bran were the 1∶12.06 g/ml ratio of liquor to material， 40.40 ℃ extract temperature，3.44 h extract time and 2.04% NaCl concentration. [Conclusion] The study can provide theoretical reference for deep development and utilization of bran products in the future.

Key words Osboren method； Rice bran globulin； Response surface analysis

米糠蛋白的特性是高營養(yǎng)、低過敏性，因此成為一種優(yōu)質(zhì)植物蛋白質(zhì)資源。米糠蛋白組分中主要含有清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白4種蛋白，各種分離蛋白的性質(zhì)和功能特性各不相同，因此人們可以根據(jù)各種分級蛋白的不同性質(zhì)加以利用，這樣不但可以增加可利用的植物蛋白種類，又可增加米糠的附加值，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。在米糠分級蛋白中，清蛋白和球蛋白是由單鏈組成的低分子量蛋白質(zhì)，它為代謝活性蛋白質(zhì)，含有很多生理活性蛋白質(zhì)，在稻谷發(fā)芽早期可迅速啟動進(jìn)行生理作用[1]。近些年，國內(nèi)外對其他物質(zhì)的分級蛋白有大量的研究，研究表明，采用Osboren法對麥胚蛋白[2]進(jìn)行分級提取，最終得到麥胚清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白；對燕麥麩[3]進(jìn)行分級提取時，最終得出燕麥麩的4種分級蛋白并對蛋白進(jìn)行分類；更進(jìn)一步的研究是對每種蛋白的SDSPAGE電泳分析[4]，經(jīng)電泳分析得出，每一種分離蛋白質(zhì)亞基均小于53 kD，屬于小分子量范圍。

目前國內(nèi)外對米糠蛋白組分研究的較少，并未見對其結(jié)構(gòu)測定的報道，因此筆者參照Osboren方法對米糠中球蛋白進(jìn)行提取，確定最佳提取工藝，以期對今后米糠產(chǎn)品的深度開發(fā)和利用提供現(xiàn)實(shí)的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料和試劑。米糠，黑龍江省北大荒米業(yè)有限公司提供。試驗(yàn)用水為蒸餾水，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 主要儀器。超臨界萃取設(shè)備（HA12150），南通華安超臨界CO2萃取有限公司；自動凱氏定氮儀，北京三品科創(chuàng)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 脫脂米糠的制備。將新鮮米糠放入CO2超臨界萃取裝置中進(jìn)行脫脂，分離得出的脫脂米糠放入冰箱中冷藏備用。

1.2.2 蛋白質(zhì)含量的測定。蛋白質(zhì)含量測定采用凱氏定氮法（GB/T 5511）[5]。

1.2.3 米糠球蛋白的制備。工藝路線：脫脂→水溶浸提→離心分離→取殘?jiān)}提→離心→上清液→等電點(diǎn)沉淀→清洗→冷凍干燥→米糠球蛋白粉。

1.2.3.1 蛋白純度的測定。采用GB/5511-1985方法進(jìn)行[6]蛋白純度的測定。

1.2.3.2 米糠球蛋白提取工藝的單因素試驗(yàn)。試驗(yàn)以蛋白純度為研究指標(biāo)，研究料液比、提取時間、提取溫度、NaCl濃度對蛋白純度的影響，對米糠球蛋白提取工藝進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

提取溫度的確定： 稱取20份殘?jiān)?，?%料液比為1∶10 g/ml的NaCl溶液溶解，設(shè)定提取溫度為35、40、45、50、55 ℃，設(shè)定提取時間為2 h，進(jìn)行試驗(yàn)，離心提取上清液，測定上清液的米糠球蛋白純度。液料比的確定：用2%的NaCl溶液溶解沉淀，在料液比1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14 g/ml，45 ℃的條件下提取2 h，離心后對上清液進(jìn)行米糠球蛋白純度的測定。提取時間的確定：用2%料液比為1∶10 g/ml的NaCl溶液溶解沉淀，在45 ℃條件下提取1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 h，離心測定上清液的米糠球蛋白純度。NaCl溶液濃度的確定：料液比為1∶10 g/ml，NaCl溶液的濃度在1%、2%、3%、4%、5%，在45 ℃條件下提取2 h，離心后對上清液進(jìn)行米糠球蛋白純度測定。

1.2.3.3 優(yōu)化米糠球蛋白蛋白提取工藝。

以提取時間（A）、溫度（B）、料液比（C）、NaCl濃度（D）4個因素的單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用二次旋轉(zhuǎn)回歸正交組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以蛋白提取率為響應(yīng)值，按照表1的試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行試驗(yàn)，采用4因素5水平的響應(yīng)面分析，利用DesignExpert8.0.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和回歸分析，建立蛋白提取率與各因素關(guān)系的數(shù)學(xué)模型，最后通過對模型分析得出最佳提取工藝條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溫度對米糠球蛋白純度的影響

由圖1可知，米糠球蛋白純度在50 ℃時達(dá)到最大值，在50 ℃之前，米糠球蛋白純度隨提取溫度的升高逐漸增大，而后隨溫度的繼續(xù)升高緩慢下降。這可能是由于溫度過高，使得米糠球蛋白得性質(zhì)發(fā)生了變化，比如糊化等因素，因此提取的溫度最好在50 ℃以內(nèi)。

2.2 料液比對米糠球蛋白純度的影響

由圖2可以看出，在料液比為1∶10 g/ml時米糠球蛋白的純度最大，繼續(xù)增加料液比，蛋白純度則呈現(xiàn)降低趨勢。這可能是與蛋白分解以及提取液的蛋白濃度降低有關(guān)。與清蛋白相比，球蛋白的最佳料液比相對減少了很多，分析原因可能是由于經(jīng)過清蛋白提取后，原料已吸收一部分水分，再提取球蛋白時，料液比明顯降低[7]。

2.3 提取時間對米糠球蛋白純度的影響

由圖3可知，球蛋白純度在2.0 h處達(dá)到最大值，隨著溫度的增加，純度逐漸下降。分析原因可能是隨提取時間延長使得米糠球蛋白發(fā)生了部分水解，使蛋白質(zhì)得率降低從而影響蛋白純度。

2.4 NaCl濃度對米糠球蛋白純度的影響

由圖4可以看出，當(dāng)NaCl濃度達(dá)到3%時，米糠球蛋白的純度達(dá)到最大值，而后呈現(xiàn)下降趨勢。分析原因可能是由于高濃度的鹽使得溶液的黏度增大，影響蛋白的溶解，并殘留一些雜質(zhì)，從而影響米糠球蛋白的純度。

2.5 米糠球蛋白純度回歸方程的建立與檢查

采用4因素5水平的響應(yīng)面法進(jìn)行米糠清蛋白質(zhì)提取工藝的優(yōu)化，結(jié)果見表2。

由復(fù)相關(guān)系數(shù)R=0.979 1，以及方差分析結(jié)果P<0.000 1，所以建立的四元二次回歸方程非常顯著，與試驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合很好。

由方差分析可知，回歸方程顯著性檢驗(yàn)F=27.63>F0.01（14，16）=3.45極顯著，說明所建立的回歸模型預(yù)測值和實(shí)際值的吻合較好，模型成立。一次項(xiàng)、交互項(xiàng)和二次項(xiàng)F值都大于0.01，說明各個因素之間的交互作用對米糠球蛋白的純度有顯著性的影響。一次項(xiàng)除D不顯著外，其他都極顯著，二次項(xiàng)都是極顯著，交互差項(xiàng)只有AB、BC極顯著，其他都是不顯著。由此可知，影響米糠球蛋白純度的因素的主要次序?yàn)榱弦罕?、提取溫度、提取時間、NaCl濃度。

提取溫度和料液比的相互作用對米糠球蛋白的純度影響響應(yīng)面分析如圖5。

由圖5可知，隨著提取溫度和料液比的不斷升高，米糠球蛋白純度不斷增加，直到達(dá)到最高點(diǎn)；當(dāng)提取的溫度和料液比繼續(xù)增加時，蛋白質(zhì)的純度反而開始下降。由此可知，提取溫度和料液比過高或過低，都會對米糠球蛋白的純度造成影響，不能使蛋白純度達(dá)到最大值。

料液比和提取時間的相互作用對米糠球蛋白的純度影響響應(yīng)面分析如圖6。

由圖6可知，當(dāng)液料比不斷增加時，米糠球蛋白的純度開始先增加，而后逐漸減?。划?dāng)提取時間不斷增加時，米糠球蛋白的純度先升高后降低。這說明，只有當(dāng)液料比和提取時間共同升高，并且達(dá)到一定的程度時，米糠球蛋白的純度才會達(dá)到最高值。因此，這2種因素存在著交互作用的關(guān)系。

2.6 提取工藝參數(shù)的優(yōu)化組合及結(jié)果驗(yàn)證

通過DesignExpert 8.0.5統(tǒng)計(jì)軟件響應(yīng)面分析模擬得出的米糠球蛋白的純度最大值為96.528 4%，其優(yōu)化組合為A=0.040、B=0.516、C=0.941、D=-0.480，即最佳的提取工藝參數(shù)為：料液比為1∶12.06 g/ml、提取溫度為40.40 ℃、提取時間為3.44 h、NaCl濃度2.04%。由最優(yōu)組合的預(yù)測值得出的驗(yàn)證結(jié)果顯示，蛋白純度為94.79%。預(yù)測值與實(shí)際值基本一致，說明預(yù)測條件與實(shí)際的測定情況比較符合。

3 結(jié)論

該試驗(yàn)利用Osbron法提取出米糠球蛋白，通過單因素試驗(yàn)、數(shù)據(jù)優(yōu)化和響應(yīng)面分析得到以下結(jié)論：以米糠球蛋白的純度為響應(yīng)值，建立回歸模型方程為Y=91.18+2.58A+10.74B+4.39C-1.90D-1.35AB-1.66AC-0.391AD+2.39BC-0.50BD-3.14CD-6.33A2-12.76B2-3.76C2-5.33D2（R2=0.979 1）。

米糠球蛋白純度的主要影響因素順序是料液比、提取溫度、提取時間、NaCl濃度。

由二次旋轉(zhuǎn)回歸正交組合的設(shè)計(jì)，確定出提取米糠球蛋白的最佳工藝條件為料液比為1∶12.06 g/ml、提取溫度為40.40 ℃、提取時間為3.44 h、NaCl濃度2.04%，在這種條件下，可以得到理論的蛋白純度為96.64%，試驗(yàn)中所測得的蛋白純度為94.79%。

參考文獻(xiàn)

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[7] 王艷玲，張敏.脫脂米糠中清蛋白和球蛋白的提取工藝及氨基酸組成分析[J/OL].（2012-11-06）http：//www.cnki.net/kcms/detail/11.1759.TS.20121106.1501.007.html.