楊明星 申磊 文嘉瑜 唐倩 石蘭平 劉艷艷 楊晟 胡炯 劉彩玲 吳楊 何水林

摘 要 促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）在植物生長(zhǎng)、發(fā)育和適應(yīng)環(huán)境中起著十分重要的作用，但對(duì)該家族多數(shù)成員的表達(dá)調(diào)控機(jī)制認(rèn)識(shí)仍十分有限。前期實(shí)驗(yàn)已分離獲得辣椒一個(gè)MAPK家族成員CaMAPK7，并發(fā)現(xiàn)該基因的表達(dá)受病原菌、高溫等逆境的誘導(dǎo)，但其表達(dá)調(diào)控機(jī)制仍不清楚。本研究進(jìn)一步分離了CaMAPK7的啟動(dòng)子序列（pCaMAPK7），發(fā)現(xiàn)其TATA框位于-165 bp與-170 bp之間，此外還發(fā)現(xiàn)W-box，HSE，TCA，LTR，ERE等多種與生物及非生物逆境脅迫應(yīng)答相關(guān)的順式作用元件。通過(guò)構(gòu)建該啟動(dòng)子與報(bào)告基因GUS融合表達(dá)載體pCaMAPK7：：GUS，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的本氏煙草葉片瞬間表達(dá)系統(tǒng)分析發(fā)現(xiàn)pCaMAPK7可應(yīng)答青枯菌接種及水楊酸（SA）、茉莉酸甲酯（MeJA）、油菜素內(nèi)酯（BR）、脫落酸（ABA）和乙烯（ET）等外源激素處理，表明CaMAPK7應(yīng)答青枯菌、外源激素處理主要是通過(guò)該啟動(dòng)子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)實(shí)現(xiàn)的。

關(guān)鍵詞 辣椒；啟動(dòng)子；煙草瞬間表達(dá)系統(tǒng)

中圖分類號(hào) S641 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

MAPK（促分裂原活化蛋白激酶）聯(lián)結(jié)一般由MAPKKK、MAPKK 和MAPK組成，廣泛存在于真核生物中，參與介導(dǎo)細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育、分裂、分化及凋亡等多種生物學(xué)過(guò)程的調(diào)節(jié)，并與生長(zhǎng)素、脫落酸、乙烯和細(xì)胞分裂素等信號(hào)通路有關(guān)，在植物生長(zhǎng)、發(fā)育和適應(yīng)生物脅迫及非生物脅迫的信號(hào)傳導(dǎo)中起重要的調(diào)節(jié)作用，但其表達(dá)調(diào)節(jié)和作用機(jī)制仍不清楚。

擬南芥[1]、小麥[2]、水稻[3]、辣椒[4]和短柄草[5]等大量的植物或作物基因組測(cè)序的完成和公布，為植物MAPK信號(hào)聯(lián)結(jié)成員的鑒定、表達(dá)調(diào)節(jié)和功能分析奠定了重要的基礎(chǔ)。已經(jīng)在多種植物基因組中發(fā)現(xiàn)20個(gè)左右的MAPK成員，并對(duì)部分成員的表達(dá)和功能及其作用機(jī)制進(jìn)行了分析。例如，研究表明棉花GhMPK2可以受到病原菌侵染的誘導(dǎo)表達(dá)并且其在煙草超表達(dá)可以明顯提高轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)病原菌的抗性[6]，GhMPK17在棉花應(yīng)答高鹽中起著重要的作用[7]，水稻MAPK家族成員IBR5在水稻耐干旱中起著負(fù)調(diào)控的作用[8]，這些結(jié)果表明MAPK通路在植物適應(yīng)各類逆境脅迫過(guò)程中起著重要作用。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)辣椒基因組中CaMAPK7在根、莖和葉中均有不同程度的組成型表達(dá)，其中以根部的表達(dá)最高，這種組成型表達(dá)可能與該基因參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育有關(guān)，另外，在葉片中則受到青枯菌侵染、高溫等逆境及水楊酸、茉莉酸甲酯和乙烯等外源激素處理的誘導(dǎo)，但脫落酸處理使其表達(dá)下調(diào)，暗示CaMAPK7可能在辣椒應(yīng)答青枯病和高溫等逆境脅迫中起一定作用[9]，但其應(yīng)答逆境或外源激素表達(dá)的分子機(jī)制還不太清楚。本研究利用GUS報(bào)告基因分析啟動(dòng)子在生物與非生物逆境處理下的轉(zhuǎn)錄表達(dá)情況，不僅有利于闡明CaMAPK7應(yīng)答幾種外源激素的分子機(jī)制，為進(jìn)一步鑒定CaMAPK7功能奠定基礎(chǔ)，還可望為作物的遺傳改良提供有利用價(jià)值的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子或者順式作用元件。

1 材料與方法

1.1 材料

辣椒基因型CM334、本氏煙草、大腸桿菌（Escherichia coli）菌株DH10B、根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株GV3101、Gateway入門載體pDNOR-207及GUS融合載體pMDC163均由本實(shí)驗(yàn)室提供。KOD高保真聚合酶購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司，Gateway試劑盒購(gòu)自Invitrogen公司，質(zhì)粒提取試劑盒、凝膠回收試劑盒均購(gòu)自泰京有限公司，各種抗生素購(gòu)自上海生工生物有限公司，引物合成和測(cè)序均委托上海Invitrogen公司。其他常規(guī)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 CaMAPK7啟動(dòng)子的克隆 利用CTAB法提取的辣椒CM334基因組DNA為模板，利用premier primer 5.0生物信息學(xué)軟件設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增該啟動(dòng)子的上下游引物（F5′-GGGGACAAGTTTGTA

CAAAAAAGCAGGCTTCACCAATTTAAATAATGTAA

TAGAAA-3′R：5′-GGGGACCACTTTGTACAAGAAA

GCTGGGTCTTCTCTGTTATTTTCAATATTCA-3′），采用KOD高保真酶進(jìn)行PCR反應(yīng)（程序：94 ℃，5 min；94 ℃，30 s；56 ℃，30 s；68 ℃，90 s，30 cycles，68 ℃，10 min），用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，將擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收。

1.2.2 CaMAPK7啟動(dòng)子轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建 用Gateway法的BP反應(yīng)將PCR產(chǎn)物連接到入門載體pDNOR-207，命名為pCaMAPK7-207，挑取經(jīng)PCR驗(yàn)證的陽(yáng)性克隆送往英俊生物公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序確認(rèn)無(wú)誤后使用Gateway的LR反應(yīng)構(gòu)建pCaMAPK7：：GUS目的表達(dá)載體，并命名為pCaMAPK7-163。PCR檢測(cè)為陽(yáng)性的再使用凍融法轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌GV3101菌株中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 對(duì)CaMAPK7啟動(dòng)子序列進(jìn)行順式作用元件分析 把公司發(fā)回的測(cè)序結(jié)果與GenBank公布的辣椒（CM334）的啟動(dòng)子序列在DNAMAN上進(jìn)行比對(duì)，確定兩者之間的同源序列，比對(duì)結(jié)果無(wú)誤之后在PlantCARE網(wǎng)站（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）上對(duì)獲得的啟動(dòng)子序列進(jìn)行順式作用元件分析。

1.2.4 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬間表達(dá) 將含有重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌在含75 μg/mL抗生素利福平、50 μg/mL卡那霉素和0.2 μg/mL LB固體（10 g Tryptone，5 g Yeast extract，10 g NaCl，15 g agar/L），培養(yǎng)基上劃線，28 ℃下培養(yǎng)2 d。挑取單克隆接種于2 mL含有相應(yīng)抗生素的液體LB培養(yǎng)基中，28 ℃下以220 r/min震蕩培養(yǎng)過(guò)夜后，轉(zhuǎn)移至50 mL新鮮配制不加抗生素的LB液體培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)，3 500 r/min離心15 min并收集菌液，用侵染液（10 mmol/L MgCl2，

10 mmol/L MES，200 mmol/L acetosyringone，pH5.1～5.4）重懸，終濃度為OD600=0.6～0.8。用不帶針頭的針管將菌液注射進(jìn)事先用水拭擦干凈的生長(zhǎng)健康且均勻一致的本氏煙草葉片中。將注射完滲透液的煙草移至25 ℃光照培養(yǎng)箱中（L ∶ D=16 h ∶ 8 h）。培養(yǎng)2 d后對(duì)煙草進(jìn)行各種逆境處理。

1.2.5 煙草植株的幾種逆境處理 煙草植株的煙草青枯菌（R. solanacearum）接種：首先將-80 ℃保存的青枯菌FJC100301于4 ℃下溶化并在含有TTC的SPA固體培養(yǎng)基中劃線，28 ℃培養(yǎng)2～3 d，從SPA固體培養(yǎng)基中挑取單克隆接種于100 mL SPA液體培養(yǎng)基中，28 ℃搖床震蕩約24 h，搖至菌液OD600值達(dá)到1.0。菌液在3 500 r/min下離心10 min，去除上清，用10 mmol/L MgCl2重懸至終濃度為OD600=0.6，接著把調(diào)好OD600值的懸浮液用去掉針頭的注射器針筒注射先前已滲入含啟動(dòng)子滲透液的各個(gè)煙草葉片中，同時(shí)以注射MgCl2的煙草葉片作為對(duì)照。處理后的煙草放回光照培養(yǎng)箱正常培養(yǎng)12 h和24 h后，分別采樣做GUS酶活性的測(cè)定。

煙草植株外源激素處理：對(duì)先前已注射啟動(dòng)子滲透液的本氏煙草葉片分別進(jìn)行外源激素處理。具體方法是將茉莉酸甲酯100 μmol/L、水楊酸1 mmol/L、脫落酸100 μmol/L、乙烯100 μmol/L和油菜素內(nèi)酯10 μmol/L直接噴灑在已注射含啟動(dòng)子滲透液的煙草葉片并保濕，置于25 ℃光照培養(yǎng)箱中（L ∶ D=16 h ∶ 8 h）處理12 h和24 h后分別采樣提取蛋白用于GUS定量分析，同時(shí)設(shè)置噴灑蒸餾水為對(duì)照。所有的處理均做6個(gè)重復(fù)。

1.2.6 CaMAPK7啟動(dòng)子酶活性的測(cè)定 GUS酶活性的測(cè)定采用分光光度計(jì)法進(jìn)行，具體步驟參考曾凡鎖[10]等的方法。酶活力單位為每分鐘水解PNPG生成1 nmol/L對(duì)硝基苯酚的酶量為一個(gè)單位。GUS活性以每mg蛋白的酶活力表示，實(shí)驗(yàn)設(shè)置6次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 CaMAPK7基因的啟動(dòng)子克隆及序列分析

通過(guò)PCR反應(yīng)擴(kuò)增出一條大小約為1 500的PCR產(chǎn)物，將該產(chǎn)物連接到入門載體pDNOR-207并測(cè)序，得到的測(cè)序序列與Genbank公布的辣椒CM334該啟動(dòng)子序列比對(duì)，在順式作用元件分析網(wǎng)站plantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）對(duì)獲得的序列進(jìn)行分析，預(yù)測(cè)到多個(gè)與植物逆境相關(guān)元件，如高溫相關(guān)元件HSE、WRKY轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合元件W-box、乙烯應(yīng)答元件ERE、低溫應(yīng)答元件LTR等（圖1）。

2.2 啟動(dòng)子GUS融合載體的構(gòu)建

通過(guò)特異性引物PCR的擴(kuò)增，獲得了CaMAPK7啟動(dòng)子PCR擴(kuò)增片段（pCaMAPK7）（圖2），將該片段通過(guò)Gateway技術(shù)通過(guò)過(guò)渡載體pDONR-207進(jìn)一步克隆到目的載體pMDC163中并驗(yàn)證（圖3），最后將含pCaMAPK7：：GUS 的目的載體轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌GV3101并驗(yàn)證（圖4），最終構(gòu)建的融合表達(dá)載體（圖5）。

2.3 啟動(dòng)子不同逆境和激素處理下的表達(dá)分析

在ABA、BR、ET、JA激素處理下，12 h和24 h時(shí)，GUS活性都出現(xiàn)了極顯著性差異（p<0.01），在12 h，分別為對(duì)照的3.53、2.12、3.55、3.37倍；在24 h，分別為對(duì)照的4.37、4.48、3.74、3.48倍；而在SA處理下，在12 h出現(xiàn)極顯著性差異，為對(duì)照的4.9倍，隨后在24 h又恢復(fù)到與對(duì)照沒有顯著差異；在接種青枯病處理后，在12 h出現(xiàn)極顯著性差異，為對(duì)照的2.63倍，24 h則有顯著性差異（p<0.05），為對(duì)照的2.56倍。在ABA、BR、ET、JA、SA和青枯菌接種處理下，pCaMAPK7驅(qū)動(dòng)的GUS活性都出現(xiàn)不同程度的增強(qiáng)（圖6）。這些結(jié)果說(shuō)明CaMAPK7啟動(dòng)子能夠響應(yīng)青枯菌和多種外源激素處理。

3 討論與結(jié)論

植物在其自然生境中總是不可避免地遭受到各種生物和非生物逆境脅迫，長(zhǎng)期的進(jìn)化也使植物形成了復(fù)雜的防御反應(yīng)機(jī)制，包括對(duì)各種逆境的感知和信號(hào)傳遞，最終達(dá)到細(xì)胞核調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)以實(shí)現(xiàn)在生理生化水平上應(yīng)對(duì)逆境的調(diào)節(jié)。植物的耐（抗）逆反應(yīng)在很大程度上受到信號(hào)通路的調(diào)控，其中MAPKKK-MAPKK-MAPK級(jí)聯(lián)是植物應(yīng)答逆境信號(hào)通路的重要組成成員，均由多基因家族編碼。大量研究表明，參與應(yīng)答逆境的植物MAPK家族成員往往表現(xiàn)出對(duì)逆境脅迫的轉(zhuǎn)錄應(yīng)答。本研究發(fā)現(xiàn)，辣椒CaMAPK7的啟動(dòng)子區(qū)域中含有5個(gè)W-box、1個(gè)HSE、1個(gè)LTR和1個(gè)TCA等與生物以及非生物脅迫相關(guān)的順式作用元。其中W-box是可和特定WRKY轉(zhuǎn)錄因子相結(jié)合，而WRKY轉(zhuǎn)錄因子的不同成員可參與包括病害、高溫、干旱、高鹽等，還與SA、JA、ET等信號(hào)通路相關(guān)[11-16]。LTR元件是與低溫脅迫相關(guān)的元件[17-21]。ERE元件是一個(gè)與乙烯應(yīng)答相關(guān)的元件[22]。HSE則可通過(guò)與HSF結(jié)合，介導(dǎo)目標(biāo)基因?qū)Ω邷孛{迫的應(yīng)答[23]。TCA在目標(biāo)基因應(yīng)答外源SA處理中起作用[24]。這些原件的存在與本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)該基因可受到青枯菌接種和高溫處理的誘導(dǎo)結(jié)合較為吻合?；谵r(nóng)桿菌注射的煙草外源基因瞬間表達(dá)分析方法已經(jīng)在植物功能基因組學(xué)研究中得到了成功的應(yīng)用[25]。本研究利用該方法分析了pCaMAPK7：：GUS中GUS報(bào)告基因?qū)η嗫菥臃N以及外源激素處理的應(yīng)答，結(jié)果發(fā)現(xiàn)pCaMAPK7驅(qū)動(dòng)的GUS基因表達(dá)受到青枯菌接種和外源SA，JA，ET，BR 和ABA等激素處理的誘導(dǎo)，進(jìn)一步表明CaMAPK7應(yīng)答青枯菌接種和各種外源激素處理與其啟動(dòng)子順式作用原件結(jié)合特地的轉(zhuǎn)錄因子在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)節(jié)所致。由于pCaMAPK7可協(xié)同應(yīng)答SA，JA，ET，BR 和ABA等外源激素處理，暗示CaMAPK7可能參與了上述激素介導(dǎo)的信號(hào)通路，在辣椒耐高溫和抗病等反應(yīng)中起重要的調(diào)節(jié)作用。未來(lái)進(jìn)一步分離CaMAPK7的底物，將有助于進(jìn)一步 解析CaMAPK7的作用辣椒的抗逆機(jī)制。

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