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      巢式一實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)慢性乙型肝炎患者PBMC中HBVcccDNA的實(shí)用性評(píng)估

      2015-10-21 19:58:27楊慧慧
      關(guān)鍵詞:乙型環(huán)狀單核細(xì)胞

      楊慧慧

      【摘要】 目的 評(píng)估巢式-實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)慢性乙型肝炎患者PBMC中HVB cccDNA的實(shí)用性。方法 利用巢式-實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)慢性乙型肝炎患者肝組織和PBMC中HVB cccDNA水平。結(jié)果 20例血清HBV DNA均為陽(yáng)性的慢性乙型肝炎患者肝組織和外周血PBMC中ccDNA陽(yáng)性率分別為55%(11/20)和45%(9/20),兩者的符合率為90%。結(jié)論 利用巢式-實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)慢性乙型肝炎患者PBMC中HBV cccDNA能較真實(shí)地反映HBV的復(fù)制。該方法可能是一種評(píng)價(jià)抗病毒藥物的療效,觀察乙型肝炎患者病情的變化的有效手段,具有很強(qiáng)的實(shí)用性。

      【關(guān)鍵詞】 肝炎病毒,乙型;DNA,環(huán)狀;聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng);單核細(xì)胞

      【中圖分類號(hào)】R51216 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】B【文章編號(hào)】1004-4949(2015)02-0048-02

      乙型肝炎病毒(HBV)復(fù)制有其獨(dú)特的地方,首先形成共價(jià)閉合環(huán)DNA(covlently closed circular DNA,cccDNA),然后轉(zhuǎn)錄成前基因組RNA,最后在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成病毒基因組DNA,故cccDNA是HBV復(fù)制的突出標(biāo)志[1]。cccDNA主要存在宿主的細(xì)胞核,既往均采用肝組織檢測(cè)DNA,但取材困難,限制了臨床應(yīng)用。研究發(fā)現(xiàn)外周血淋巴細(xì)胞同樣存在HBV感染復(fù)制現(xiàn)象[2,3],故檢測(cè)外周血HBV cccDNA同樣能反映HBV復(fù)制狀況及評(píng)價(jià)藥物療效,且比肝組織更方便,只是外周血cccDNA濃度較低,易出現(xiàn)假陰性。為了評(píng)估巢式-實(shí)時(shí)熒光定量PCR法在檢測(cè)慢性乙型肝炎患者PBMC中HVB cccDNA的實(shí)用性,筆者擬利用巢式-實(shí)時(shí)熒光定量PCR法同時(shí)檢測(cè)慢性乙肝患者肝組織和PBMC中HVB cccDNA的含量,以期為臨床檢測(cè)HCV復(fù)制狀況及評(píng)價(jià)藥物療效提供簡(jiǎn)便有效的方法。

      1 材料與方法

      1.1 標(biāo)本 選取長(zhǎng)沙市第一醫(yī)院傳染科確診的慢性乙型肝炎患者20例,男13例,女7例,平均年齡46.8歲(28~65歲),所有患者均未進(jìn)行任何治療。每例病例分別采取全血10ml和行肝穿刺獲取肝組織;全血采用密度梯度離心法分離PBMC,洗滌5次后檢測(cè)上清液中HBV DNA,確認(rèn)HBV DNA PCR結(jié)果為陰性后,計(jì)數(shù)細(xì)胞,取1×106細(xì)胞備用。肝組織用生理鹽水清洗4次,入液氮保存?zhèn)溆?。aywHBV全序列的pcp10質(zhì)粒,采用p-GEM-T-Easy載體構(gòu)建,用作檢測(cè)HBV cccDNA的陽(yáng)性參照定量標(biāo)準(zhǔn)品,提取陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒,測(cè)定核酸濃度,倍比稀釋為5.0×102~5.0×109拷貝/ml,作為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照。

      1.2 引物與探針的設(shè)計(jì)及合成 根據(jù)HBV cccDNA與松弛結(jié)構(gòu)DNA(rcDNA)結(jié)構(gòu)上的差異,跨HBV DNA雙鏈缺口兩側(cè)選擇區(qū)域設(shè)計(jì)2對(duì)內(nèi)外引物,并在負(fù)鏈缺口下游設(shè)計(jì)TaqMan熒光探針。所有設(shè)計(jì)的引物能選擇性地?cái)U(kuò)增HBV cccDNA,而不能擴(kuò)增rcDNA。P1引物:5-CGC TTT CGG GTC CCT CAT GCG ACG TGC-3,P2引物:5-TCG CTT TCG GGT CCC T-3,P3引物:5-GCA CCT CTC TTT ACG CGG TC-3,P4引物:5-AAC TGA AAG CCA AAC AGT G-3,TaqMan熒光探針:5-FAM-CTC TGC C-TAA TCA TCT CAT GTT CAT-TAMRA-3,外引物擴(kuò)增片段為385bp,內(nèi)引物擴(kuò)增片段為105bp。

      1.3 主要試劑 基因組提取試劑盒、HBV DNA熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒均購(gòu)自北京索奧生物技術(shù)公司,CR Master Mix試劑購(gòu)自日本東洋坊公司。

      1.4 DNA抽提 利用質(zhì)粒抽提試劑盒按說(shuō)明書(shū)操作提取PBMC及肝組織中病毒DNA。

      1.5 巢式-實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增 取純化模板2μl,用外引物進(jìn)行第一輪常規(guī)PCR擴(kuò)增。外引物P1和P2濃度為10μmol/L,各1μl,10mmoldNTP 0.5μl,Taq酶0.5μl,10×buffer 2μl,ddH2O 13μl;循環(huán)條件:94℃ 5min;94℃ 30s,50℃ 30s,72℃ 30s,40個(gè)循環(huán);72℃ 5min。第二輪反應(yīng)用內(nèi)引物和熒光探針對(duì)第一輪PCR產(chǎn)物中的目的片段進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量擴(kuò)增。反應(yīng)體系為:第一輪PCR產(chǎn)物2μl,2×Taq PCR Master Mix 12μl,P3、P4引物各1μl,10μmol/L熒光探針0.5μl,反應(yīng)總體積20μl;循環(huán)條件:94℃ 5min;94℃ 30s,50℃ 30s,72℃ 30s,40個(gè)循環(huán);72℃ 5min。設(shè)陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照為aywHBV全序列的pcp10質(zhì)粒,陰性對(duì)照為3例健康獻(xiàn)血員。

      2 結(jié) 果

      2.1 肝組織和外周血中PBMC中cccDNA檢測(cè)結(jié)果 第一輪PCR產(chǎn)物電泳在385bp處見(jiàn)陽(yáng)性條帶,第4,6,7,8,10,12,13泳道呈陽(yáng)性(圖1)。20例血清HBV DNA均為陽(yáng)性的慢性乙型肝炎患者肝組織中ccDNA陽(yáng)性者10例,陽(yáng)性率為50%(10/20)。cccDNA定量值為4.214×104~5.211×105拷貝/ml。外周血PBMC中cccDNA陽(yáng)性者9例,陽(yáng)性率45%(9/20)。cccDNA定量值為3.521×103~3.452×104拷貝/ml。3例健康獻(xiàn)血員PBMC中cccDNA均陰性。

      2.2 外周血PBMC和肝組織中cccDNA陽(yáng)性的符合率 9例外周血PBMC中cccDNA陽(yáng)性患者的肝組織中cccDNA均陽(yáng)性,但有1例肝組織中cccDNA陽(yáng)性患者其外周血PBMC中cccDNA陰性,外周血PBMC和肝組織中cccDNA陽(yáng)性的符合率高達(dá)90%(9/10)。

      2.3 方法的敏感性 檢測(cè)pcp10陽(yáng)性參照定量標(biāo)準(zhǔn)品,得到該方法的靈敏度為2log10拷貝/ml范圍,隨著模板量減少,對(duì)應(yīng)CT值增大,呈線性相關(guān),獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖2)。

      3 討 論

      臨床上一般以HBV DNA載量作為抗病毒治療依據(jù)及判斷乙肝病毒復(fù)制活力,HBV DNA包括rcDNA和ceeDNA。有學(xué)者認(rèn)為單純依靠血清HBV DNA檢測(cè)是不夠的,應(yīng)結(jié)合HBV cccDNA的檢測(cè)和臨床來(lái)進(jìn)行綜合分析,才能更真實(shí)地反應(yīng)患者體內(nèi)乙肝病毒的復(fù)制,為臨床治療提供更為可靠的依據(jù)[4]。cccDNA的清除預(yù)示著HBV在宿主體內(nèi)生命周期的終結(jié),因此不少學(xué)者認(rèn)為這是最佳的抗病毒參考指標(biāo)之一[4]。HBV cccDNA的檢測(cè)能夠評(píng)價(jià)抗病毒藥物的療效,連續(xù)觀察更能反映乙型肝炎患者病情的變化,所以準(zhǔn)確、方便、快速檢測(cè)cccDNA的量是目前乙肝治療的迫切要求。乙型肝炎病毒HBV cccDNA研究以肝組織為多,但肝組織取材困難,臨床應(yīng)用受到了極大的限制。HBV可以感染白細(xì)胞,而這種免疫細(xì)胞的感染有利于病毒免疫逃逸,不被免疫細(xì)胞攻擊,從而導(dǎo)致機(jī)體清楚HBV能力下降,故外周血PBMC中存在HBV感染和復(fù)制,檢測(cè)外周血PBMC中cccDNA應(yīng)該亦能反映HCV的復(fù)制,但血液中cccDNA的水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于肝組織,檢測(cè)亦較為困難。

      巢式-實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)具有高靈敏性和高特異性,能夠檢測(cè)極其微量的DNA。cccDNA有共價(jià)、閉合、超螺旋雙鏈DNA結(jié)構(gòu),在堿變性后可再?gòu)?fù)性,而rcDNA是有缺口的雙鏈DNA,堿變性后不可復(fù)性 所以本實(shí)驗(yàn)方法應(yīng)用質(zhì)粒提取試劑盒抽提肝組織和PBMC中的病毒DNA可以祛除rcDNA、單鏈DNA和RNA,對(duì)cccDNA進(jìn)行純化,可進(jìn)一步提高cccDNA檢測(cè)的靈敏性和特異性[5]。

      本研究結(jié)果顯示,利用巢式-實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)20例血清HBV DNA陽(yáng)性的慢性乙型肝炎患者的肝組織和PBMC中的cccDNA進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)肝組織和PBMC中cccDNA的陽(yáng)性率分別為50%和45%,且兩者的符合率高達(dá)90%,表明利用巢式-實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)外周血PBMC中的cccDNA亦能較真實(shí)的反映HBV的復(fù)制,可以避免由于肝組織取材帶來(lái)的限制,且準(zhǔn)確、方便、快捷,是一種評(píng)價(jià)抗病毒藥物的療效,觀察乙型肝炎患者病情的變化的有效手段,具有很強(qiáng)的實(shí)用性。

      參考文獻(xiàn)

      [1]陳延平. 檢測(cè)HBVcccDNA的巢式-實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的建立及初步應(yīng)用[D].第四軍醫(yī)大學(xué),2007.

      [2]陳勇. 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)HBV cccDNA體系建立及臨床應(yīng)用初步研究[D].重慶醫(yī)科大學(xué),2008.

      [3]陳延平,孟存英,徐光華,馮繼紅,王平忠,白雪帆. 應(yīng)用巢式-實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)慢性乙型肝炎患者PBMC中HBV cccDNA[J]. 肝臟,2011,05:401-404.

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