基于單因素試驗的大豆CDDPPCR反應(yīng)體系優(yōu)化

李強 高聚林 蘇二虎 廉博 牛敏 邵志壯 謝田

摘要 [目的] 優(yōu)化大豆CDDP-PCR反應(yīng)體系。[方法]采用單因素試驗方法對影響大豆CDDPPCR反應(yīng)的Mg²⁺濃度、Taq DNA 聚合酶用量、引物濃度、dNTPs濃度和模板DNA用量等因素進行優(yōu)化。[結(jié)果]優(yōu)化后的大豆CDDPPCR體系為：Mg²⁺濃度2.0 mmol/L、Taq聚合酶用量1.5 U、引物濃度0.375 μmol/L、dNTPs濃度0.3 mmol/L、DNA模板用量40 ng。運用24個大豆品種驗證了該反應(yīng)體系穩(wěn)定、可靠。[結(jié)論]該反應(yīng)體系的建立為大豆種質(zhì)遺傳多樣性分析、遺傳連鎖圖譜構(gòu)建及分子標記輔助育種奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 大豆;CDDP;單因素試驗;體系優(yōu)化

中圖分類號 S565.1 ?文獻標識碼 A ?文章編號 0517-6611（2015）03-032-03

Optimization of CDDPPCR System by Single factor Experiment Design in Soybean

LI Qiang¹， GAO Julin²， SU Erhu¹et al

（1.Inner Mongolia Academy of Agricultural and Animal Husbandry Sciences， Huhhot， Inner 010031;2. College of Agronomy， Inner Mongolia Agricultural University， Huhhot， Inner 010019）

Abstract [Objective] The aim was to optimize CDDPPCR system by single factor experiment design in soybean. [Method] Single factor experiment design were applied to optimize CDDPPCR amplification system of soybean in five factors such as Mg²⁺， Taq DNA polymerase， primer， dNTPs and template DNA. [Result]The suitable reaction system was obtained， that is 20 μl containing 2.0 mmol/L Mg²⁺， 1.5 U Taq polymerase， 0.375 μmol/L primer， 0.3 mmol/L dNTPs， 40ng DNA template. The optimized CDDPPCR system was tested on 24 soybeans， and the result was stable and reliable. [Conclusion]The system provides the basis for evaluation of genetic diversity， construction of genetic linkage map and molecular marker assisted breeding for the soybean.

Key words Soybean; CDDP; Single factor experiment; System Optimization

基金項目 內(nèi)蒙古自治區(qū)科技創(chuàng)新引導(dǎo)獎勵資金項目（20111707）;內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學院青年創(chuàng)新基金項目（2014QNJJN01）。

作者簡介 李強（1982- ），男，內(nèi)蒙古巴彥淖爾人，助理研究員，博士，從事大豆育種、栽培研究。

*通訊作者，研究員，從大豆育種、栽培研究。

收稿日期 20141215

大豆是世界上重要的糧食、油料、飼料兼用作物，是人類食用油和植物蛋白的主要來源^[1]。大豆起源于我國，具有悠久的栽培歷史，經(jīng)過長期自然與人工選擇，產(chǎn)生了豐富的遺傳變異類型。但品種退化、品種混亂嚴重給種質(zhì)區(qū)分和大豆育種工作帶來了諸多困難，而分子標記技術(shù)可有效地進行品種鑒定、遺傳多樣性研究，并能指導(dǎo)育種實踐^[2]。前人已先后應(yīng)用RAPD^[3]、AFLP^[4]、SSR^[5]、ISSR^[6]、SRAP^[7]等分子標記技術(shù)對大豆種質(zhì)遺傳多樣性、親緣關(guān)系鑒定及雜交后代鑒定等方面進行了研究。但這些標記技術(shù)都是傳統(tǒng)意義上的隨機DNA分子標記，隨著植物基因組學和大規(guī)模測序技術(shù)的深入發(fā)展，NCBI、SOYBASE、GDB等公共基因組、蛋白組數(shù)據(jù)庫信息爆炸式增長，研究者應(yīng)用這些DNA/ cDNA相關(guān)序列信息設(shè)計、開發(fā)了一大批目的基因分子標記，這類標記與目標基因關(guān)聯(lián)密切，針對性強、效率高，且該類技術(shù)在不同物種間可以通用^[8]。目的基因分子標記技術(shù)有利于實現(xiàn)對植物特定性狀進行標記，對重要性狀QTL定位研究也具有特殊價值。因此，建立一套簡單、有效、實用的目的基因分子標記技術(shù)對大豆親緣關(guān)系鑒定、遺傳多樣性及分子標記輔助育種具有重要意義^[9]。

來源保守DNA序列多態(tài)性（Conserved DNA-derived polymorphism，CDDP）標記是2009年Collard等^[10]提出的一種基于DNA保守序列的新型目的基因分子標記方法。其原理是根據(jù)一些功能得到驗證的重要基因或基因家族中的保守氨基酸序列對應(yīng)的DNA保守序列在不同物種間也是相當保守的，利用多重比較軟件（CLUSTAL W、Genedoc、DNAman等）對來自不同物種的功能基因序列或功能蛋白質(zhì)序列進行多重比較，找出不同物種中同時存在的保守DNA或蛋白質(zhì)序列，為引物的設(shè)計提供錨定位點。目前國內(nèi)外CDDP分子標記應(yīng)用很少，僅在水稻^[10]、歐白英^[11]、牡丹^[12]、菊花^[13]等作物上成功應(yīng)用，利用正交設(shè)計建立了大豆CDDP-PCR反應(yīng)體系^[14]，筆者以大豆為材料，采用單因素試驗方法進一步優(yōu)化大豆CDDP-PCR反應(yīng)體系，對正交設(shè)計試驗進行驗證，建立一套穩(wěn)定、有效的標記體系，為研究大豆的遺傳多樣性、遺傳圖譜構(gòu)建及分子標記輔助育種提供新的技術(shù)手段。