彩葉鳳梨離體培養(yǎng)中外植體消毒及防止褐化的研究

史華平 王彥尊 王計(jì)平

摘要

[目的]研究彩葉鳳梨離體培養(yǎng)過程中外植體消毒及褐化的防止措施。 [方法]以彩葉鳳梨幼苗莖段作為外植體材料，研究其消毒和褐化防止問題。[結(jié)果]減少培養(yǎng)基中無機(jī)鹽濃度，外植體選用0.1%升汞溶液消毒10 min，并在MS誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加200 mg/L的抗壞血酸，能夠有效防止褐化，而且不影響愈傷組織的進(jìn)一步分化。[結(jié)論]研究結(jié)果為彩葉鳳梨離體培養(yǎng)奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 彩葉鳳梨;離體培養(yǎng);外植體;消毒;褐化

中圖分類號 S188 ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼

A ?文章編號 0517-6611（2015）03-047-03

Studies on Disinfection and Antibrowning during the Tissue Culture of Neoregelia carolinae

SHI Huaping¹， WANG Yanzun²， WANG Jiping2*

（1. Pomology Institute， Shanxi Academy of Agricultural Sciences， Taigu， Shanxi 030815; 2.College of Agronomy， Shanxi Agricultural University， Taigu， Shanxi 030801）

Abstract ?[Objective] The aim was to study disinfection and antibrowning during the tissue culture of Neoregelia carolinae.

[Method ] In this experiment， with the seedling stems of Neoregelia carolinae as explants， study on the problems in disinfection and browning of Neoregelia carolinae tissue culture was carried out. [Result]Results showed that the explant browning could be alleviated by reducing the salt concentration of medium and explants treated with 0.1% HgCl₂ for 10 min during in vitro culture. Results also showed that the medium supplemented with 200 mg/L Vc could prevent browning effectively， and did not produce bad effects on growth of Neoregelia carolinae explants.[Conclusion] The study provided basis for tissue culture of Neoregelia carolinae.

Key words ? Neoregelia carolinae; Tissue culture; Explant; Disinfection; Browning

基金項(xiàng)目 山西省科技攻關(guān)項(xiàng)目（20130311019-2）;國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31201266）。

作者簡介 史華平（1974- ），男，山西昔陽人，助理研究員，從事植物組織培養(yǎng)技術(shù)研究。*通訊作者，副教授，博士，從事植物生理與分子生物學(xué)研究。

收稿日期 20141205

彩葉鳳梨（Neoregelia carolinae）又名赪鳳梨、五彩鳳梨，為鳳梨科彩葉鳳梨屬植物。原產(chǎn)于巴西，無明顯休眠期，喜溫暖、濕潤和陽光充足的環(huán)境，不耐寒，怕干燥和強(qiáng)光暴曬^[1]。我國彩葉鳳梨的栽培時(shí)間不長，從20世紀(jì)80年代開始進(jìn)入引種階段，至今僅有小批量的生產(chǎn)，主要集中在廣東、海南、福建和云南昆明等地。

彩葉鳳梨通常以分株、播種繁殖為主，時(shí)間限制十分明顯，而且生長緩慢，繁殖率低，且苗不整齊，通過植物組織培養(yǎng)技術(shù)可以大大提高其繁殖率^[1-2]，短期內(nèi)獲得大量整齊一致的種苗，因此通過組織培養(yǎng)快速繁殖鳳梨是一條很理想的途徑。然而，在離體培養(yǎng)過程中，首先遇到的是外植體嚴(yán)重褐化而導(dǎo)致培養(yǎng)物死亡的問題，筆者針對該問題，對彩葉鳳梨離體培養(yǎng)過程中外植體消毒及褐化的防止措施進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院組培試驗(yàn)室提供的彩葉鳳梨為材料，取其幼苗莖段作為外植體材料。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 外植體的處理與消毒。

1.2.1.1 材料預(yù)處理。

取彩葉鳳梨幼苗，流水沖洗干凈，切下其莖段，在無菌條件下用75%乙醇表面消毒30 s，用消毒劑消毒，最后無菌水清洗6～8次，用無菌濾紙吸干材料表面水分后備用。

1.2.1.2 表面消毒劑的篩選。分別用2%、5%NaClO及01%、0.2%的HgCl₂溶液按如下設(shè)置進(jìn)行外植體消毒。①2%的NaClO消毒10 min;②2%的NaClO消毒20 min;③2%NaClO消毒30 min;④5%的NaClO消毒10 min;⑤5%NaClO消毒20 min;⑥5%NaClO消毒30 min;⑦0.1%HgCl₂溶液消毒5 min ;⑧0.1%HgCl₂溶液消毒10 min;⑨0.2%HgCl₂溶液消毒5 min;⑩0.2%HgCl₂溶液消毒10 min。每處理20個(gè)外植體，重復(fù)3次。

1.2.1.3 外植體處理時(shí)間的確定。

用0.1%HgCl₂溶液按以下時(shí)間設(shè)置對莖段外植體進(jìn)行消毒處理。①0.1%HgCl₂溶液消毒3 min;②0.1%HgCl₂溶液消毒5 min;③0.1%HgCl₂溶液消毒7 min;④0.1%HgCl₂溶液消毒10 min;⑤0.1%HgCl₂溶液消毒15 min。消毒的外植體接種于無菌培養(yǎng)基上。培養(yǎng)基配方為MS+6BA 3.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L，附加0.6%瓊脂和3%蔗糖，pH 5.6～5.8。每處理20個(gè)外植體，重復(fù)3次。培養(yǎng)20 d后，統(tǒng)計(jì)外植體污染率，死亡率，存活率。

1.2.2 外植體褐化的防止。研究不同基本培養(yǎng)基及消毒劑的種類和處理方法對外植體褐化的影響，每個(gè)處理接種20個(gè)，設(shè)3次重復(fù)。

1.2.2.1 不同消毒劑處理對外植體褐化的影響。

取彩葉鳳梨的幼苗莖段，流水洗凈后設(shè)6個(gè)處理：①在無菌條件下用75%乙醇表面消毒30 s后，于0.1%HgCl₂溶液消毒7 min;②用75%乙醇表面消毒30 s后，于0.1%HgCl₂溶液消毒10 min;③用75%乙醇表面消毒30 s后，于0.1%HgCl₂溶液消毒15 min;④直接用0.1%HgCl₂溶液消毒7 min;⑤直接用01%HgCl₂溶液消毒10 min;⑥直接用0.1%HgCl₂溶液消毒15 min。

1.2.2.2 不同基本培養(yǎng)基對外植體褐化的影響。

將基本培養(yǎng)基設(shè)為MS、1/2MS、N6和B5 4種類型，分別附加6BA 3.0 mg/L及NAA 0.1 mg/L，分析不同培養(yǎng)基類型對彩葉鳳梨外植體褐化的影響。

1.2.2.3 不同濃度抗壞血酸處理對外植體褐化的影響。在培養(yǎng)基中添加不同濃度抗壞血酸（Vc），以沒有任何防褐化處理的外植體作為對照，篩選抗壞血酸防止外植體褐化的最適濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 外植體材料的處理

2.1.1 消毒劑對外植體消毒效果的影響。

從表1可以看出，2% NaClO處理10 min的污染率達(dá)到62.1%，存活率為34.4%，而5% NaClO處理20和30 min的存活率達(dá)到68%左右;01%和0.2% HgCl₂消毒5和10 min的存活率均保持在70%以上;表明2種滅菌劑對彩葉鳳梨幼苗莖段外植體消毒效果之間存在顯著差異，不同濃度HgCl₂消毒效果均優(yōu)于NaClO，污染率降低，存活率提高。對存活率分析表明，處理⑧是彩葉鳳梨莖段外植體較適宜的消毒方法，即0.1% HgCl₂消毒10 min，外植體存活率高達(dá)92.6%。

表1 消毒劑對莖段消毒效果的影響

%

處理污染率死亡率存活率

①62.1 3.534.4

②45.22.652.2

③36.0 3.061.0

④58.2 4.337.5

⑤23.5 8.468.1

⑥17.6 14.867.6

⑦14.2 11.874.0

⑧2.05.492.6

⑨8.3 5.286.5

⑩1.8 18.479.8

2.1.2 處理時(shí)間對外植體消毒效果的影響。

為了進(jìn)一步確定0.1%HgCl₂對外植體材料的最佳處理時(shí)間，分別設(shè)置了5個(gè)處理時(shí)間進(jìn)行消毒，結(jié)果見表2。由表2可知，隨著處理時(shí)間的延長，外植體污染率逐漸降低，死亡率升高，說明較長時(shí)間HgCl₂處理會(huì)對外植體材料造成一定傷害。5個(gè)不同處理時(shí)間中，0.1%HgCl₂處理3 min外植體的死亡率雖然是0，但外植體的污染率卻達(dá)到64.5%，存活率也只有35.5%;而用0.1%HgCl₂處理7～15 min，雖然外植體有一定的污染，但死亡率較低，其存活率在80%左右，結(jié)果表明，處理④即0.1% HgCl₂消毒10 min，外植體存活率高達(dá)92.6%，消毒效果最好，是較適宜的外植體處理時(shí)間。

表2 處理時(shí)間對外植體材料消毒效果的影響

%

處理污染率死亡率存活率

①64.5035.5

②14.211.874.0

③8.5 10.381.2

④2.05.492.6

⑤2.318.179.6

2.2 外植體褐化的防止

2.2.1 不同表面消毒方式對外植體褐化的影響。由表3可知，用75%乙醇處理外植體材料，明顯加劇了褐化程度，處理后1 d即出現(xiàn)中度褐化;0.1%HgCl₂溶液消毒10或15 min，褐化現(xiàn)象也較明顯，而用0.1%HgCl₂溶液消毒7 min，外植體褐化程度較輕，表明用0.1%HgCl₂溶液消毒處理對褐化的影響較小。

表3 不同表面消毒方式對外植體褐化的影響

處理處理時(shí)間∥d

1234

①+++++++++++

②+++++++++++

③++++++++++++

④++++++++

⑤+++++++++

⑥+++++++++++

注：N.沒有褐化，+.輕度褐化，++.中度褐化，+++.嚴(yán)重褐化。

2.2.2 不同基本培養(yǎng)基對外植體褐化的影響。

過高無機(jī)鹽濃度會(huì)引起某些植物外植體中酚類物質(zhì)氧化，引起褐變;培養(yǎng)基的狀態(tài)及硬度也會(huì)影響外植體褐化程度。以MS培養(yǎng)基作為對照，分別附加相同激素成分，蔗糖3%，瓊脂0.6%，pH 5.6～5.8。

表4 基本培養(yǎng)基對外植體褐化的影響

培養(yǎng)基處理時(shí)間∥d

1234

MS++++++++

1/2MS+++++++

N6+++++++

B5+++++++

注：N.沒有褐化，+.輕度褐化，++.中度褐化，+++.嚴(yán)重褐化。

由表4可知，MS培養(yǎng)基比其他培養(yǎng)基褐化速度更快，而其他3種培養(yǎng)基之間則無明顯差異。

2.2.3 不同濃度抗壞血酸對外植體褐化的影響。

在MS培養(yǎng)基中添加50、100、200和300 mg/L抗壞血酸，對外植體褐化有一定的抑制效果（表5），其中，較低濃度抗壞血酸在培養(yǎng)初期有防褐作用（50 mg/L在6d前，100 mg/L在8d前），200和300 mg/L抗壞血酸能夠很好地防止彩葉鳳梨外植體褐化的產(chǎn)生。

防褐化劑對愈傷組織和不定芽的產(chǎn)生有不同的影響，所以在添加抗壞血酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)莖段20 d時(shí)，對不定芽和愈傷組織的產(chǎn)生進(jìn)行了記錄，發(fā)現(xiàn)都有不定芽的產(chǎn)生，葉片也有愈傷組織的產(chǎn)生，因此認(rèn)為，在培養(yǎng)基中添加200 mg/L的抗壞血酸能夠較好地防止褐化，且不影響分化。

表5 不同濃度抗壞血酸對外植體褐化的影響

抗壞血酸濃度

mg/L處理時(shí)間∥d

4681020

對照++++++++++++++

50+++++++++++++

100+++++++++++

200NNN++

300NNN++

注：N.沒有褐化，+.輕度褐化，++.中度褐化，+++.嚴(yán)重褐化。

3 結(jié)論與討論

3.1 外植體的選擇及滅菌

外植體是植物組織培養(yǎng)的材料，其表面和內(nèi)部常攜帶一些微生物，是組織培養(yǎng)過程的主要污染源，外植體的消毒是植物組織培養(yǎng)能否成功的第一步，在培養(yǎng)時(shí)常因消毒效果不佳而導(dǎo)致失敗。外植體表面消毒的關(guān)鍵是選擇合適的消毒劑和消毒時(shí)間。因?yàn)橄緞┎粌H能殺死微生物，也會(huì)對外植體產(chǎn)生一定的傷害。不同植物或同一植物不同外植體消毒方法不同，為達(dá)到滿意的滅菌效果，需要根據(jù)外植體的情況，選擇合適的消毒劑，摸索出合理的消毒時(shí)間，焦立為等^[3]用臭氧對橡皮樹帶有頂芽的葉片進(jìn)行消毒，結(jié)果表明，臭氧用于外植體消毒滅菌的效果很好，接種20 d后，污染率為0%，且頂芽（有鱗葉包被）接種后的成活率極高;Abdul Qayyum Rao 等^[4]采用0.1%HgCl₂對棉花種子表面消毒時(shí)，種子在消毒液中浸泡20 ?min，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出一般時(shí)間范圍，但仍不會(huì)對種子造成傷害。在使用消毒劑時(shí)，有時(shí)只用1種消毒劑對外植體進(jìn)行消毒，有時(shí)是將2種或幾種消毒液混合后對外植體進(jìn)行消毒，劉香玲等^[5]使用混合消毒劑對水稻種子進(jìn)行滅菌，將水稻種子去殼后，先用70%乙醇消毒1 min，再用0.1%HgCl₂和2% NaClO（1∶1）的混合消毒液浸泡20 min。該研究對彩葉鳳梨幼苗莖段采用0.1%HgCl₂消毒10 min，其存活率可達(dá)92.6%。

3.2 外植體褐化及防止

外植體褐化是鳳梨科植物等許多植物離體培養(yǎng)過程中的常見問題，發(fā)生褐化現(xiàn)象會(huì)直接導(dǎo)致培養(yǎng)物死亡，嚴(yán)重阻礙了快繁過程。影響褐化的因素很多，也很復(fù)雜，植物的種類、基因型、外植體部位及生理狀態(tài)、外植體消毒情況、培養(yǎng)方式等的不同，褐化程度也有所不同。首先，接種時(shí)各種化學(xué)消毒劑對外植體的傷害會(huì)引起褐化。消毒劑不同，消毒時(shí)間不同，外植體褐化程度也不同。乙醇消毒雖然效果較好，但易對材料造成傷害，導(dǎo)致褐化，HgCl₂對外植體傷害較輕，且消毒時(shí)間越長，效果越好，但褐變越嚴(yán)重^[6]。在消毒時(shí)間方面，一般是消毒時(shí)間越長，褐化率越高^[7]，因而消毒時(shí)間應(yīng)掌握在一定范圍內(nèi)才能保證較高的外植體成活率。該研究用0.1%HgCl₂溶液消毒7 min，外植體褐化程度較輕，而75%乙醇處理外植體材料，明顯加劇了褐化程度。

其次，培養(yǎng)基狀態(tài)及過高的無機(jī)鹽濃度也會(huì)引起外植體褐變，如把核桃分別在固體、半固體和液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，半固體培養(yǎng)基芽的誘導(dǎo)獲得成功，而其他培養(yǎng)基上都發(fā)生了褐變^[8]。在金錢樹愈傷組織誘導(dǎo)過程中，采用液體培養(yǎng)對防止褐化有很好的作用^[9]。在桑樹組培中，降低無機(jī)鹽濃度，將MS培養(yǎng)基改為1/2MS培養(yǎng)基能減輕褐變，降低褐化率^[10]。劉蘭英^[11]在核桃組培中發(fā)現(xiàn)，將DKW培養(yǎng)基的無機(jī)鹽濃度減少一半，核桃外植體褐變率由55.8%降至32.5%。該研究結(jié)果表明MS培養(yǎng)基比1/2MS、N6及B5培養(yǎng)基褐化速度更快。

另外，在培養(yǎng)基中加入防褐化劑可以明顯減少褐變發(fā)生。防褐化劑一般分為2種：一種是吸收醌類物質(zhì)的吸附劑，如活性炭，它是一種吸附性較強(qiáng)的吸附劑，但其吸附作用沒有選擇性，在吸附酚類氧化物的同時(shí)也吸附營養(yǎng)物質(zhì)，研究表明，活性炭能有效控制褐化和促進(jìn)生長，但不利于分化^[12];另一種是防止酚氧化的抗氧化劑，如Na₂SO₃和NaHSO₃，主要是影響酚類化合物與酶結(jié)合來有效防止褐化，抗壞血酸（Vc）也屬于抗氧化劑，是一種酚氧化酶抑制物，它可以將該酶的Cu²⁺還原成Cu+^[13]。雖然Na₂SO₃的防褐化作用最佳，但不利于不定芽和愈傷組織的發(fā)生，影響外植體培養(yǎng)。彭筱娜等^[14]研究表明，在培養(yǎng)基中添加200 mg/L抗壞血酸可以有效防止觀賞鳳梨褐化的產(chǎn)生。該試驗(yàn)同樣采用200 mg/ L的抗壞血酸作為一種有益的防褐化添加物，也可以有效防止彩葉鳳梨莖段外植體褐化，促進(jìn)外植體的培養(yǎng)。

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