張慶瑞，趙國棟

（1.河南林業(yè)職業(yè)學院，河南洛陽 471002；2.洛陽國家牡丹園，河南洛陽 471011）

牡丹（Paeonia suffruticosa）是中國十大名花之一，其花型碩大、色澤艷麗、雍容華貴，自古以來，深受人們的喜愛。我國栽培牡丹歷史悠久，除了采用傳統(tǒng)的嫁接和分株方法進行繁殖外，近年來，組織培養(yǎng)技術也取得了不小的進展，但在牡丹組培過程中，外植體褐化現(xiàn)象嚴重，嚴重影響愈傷組織的誘導、繼代增值培養(yǎng)及根系的誘導[1-4]。筆者以‘洛陽紅’牡丹的腋芽為外植體，通過添加不同的物質(zhì)，探索防止組織培養(yǎng)過程中腋芽褐化的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗以‘洛陽紅’牡丹的腋芽為材料，2 月份采集牡丹腋芽，流水清洗后，經(jīng)75%酒精和0.1%升汞消毒。培養(yǎng)基中添加3%蔗糖、0.75%的瓊脂，pH 5.8。培養(yǎng)室溫度控制在25℃，光照強度為1 500~2 000 Lux，光照時數(shù)每天10 h。

1.2 試驗方案

1.2.1 不同天然添加物濃度對‘洛陽紅’腋芽褐化的影響。以1/2MS 為基本培養(yǎng)基，在培養(yǎng)基中添加不同濃度的馬鈴薯汁（0，100，200，300 g/L），椰汁（0，100，200，300 g/L），研究不同天然添加物對‘洛陽紅’腋芽褐化的影響。每處理7 瓶，每瓶接種3 個腋芽，14 d 后觀察統(tǒng)計結果。

1.2.2 固體培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基、活性炭對‘洛陽紅’腋芽的影響。以1/2MS+NAA 0.2 mg/L+6-BA 2.0 mg/L 為基本培養(yǎng)基。把培養(yǎng)基分液體、固體、液體+活性炭、固體+活性炭的不同處理，用0.75%的瓊脂固化，觀察固體培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基、活性炭對‘洛陽紅’腋芽的影響。每處理7 瓶，每瓶3 個材料，14 d 后觀察統(tǒng)計結果。

1.2.3 不同的預處理對‘洛陽紅’腋芽褐化的影響。同樣以1/2MS+NAA 0.2 mg/L+6-BA 2.0 mg/L 為基本培養(yǎng)基。腋芽接種前采用4 種不同的預處理，分別是除鱗片、冷處理（4℃下儲存3 d）、熱處理（45℃下90 s）、水沖洗（水沖洗5 h），研究不同預處理對‘洛陽紅’腋芽褐化的影響。每處理7 瓶，每瓶 3 個，14 d 后觀察統(tǒng)計結果。

1.3 褐化程度的分級標準

將牡丹腋芽褐化程度分為6 個等級，從重到輕依次為：5 級，極嚴重褐化，整個外植體變?yōu)楹谏? 級，嚴重褐化，整個外植體變?yōu)樽睾谏? 級，中度褐化，外植體70%以上部分變色；2 級，輕度褐化，外植體兩端變色較輕；1級，輕微褐化，基本上沒有褐化；0 級，無褐化，沒有褐化。褐化率和綜合褐化程度采用下式計算：

褐化率=褐化數(shù)量/接種數(shù)量×100%

綜合褐化程度=（褐化等級×該等級的褐化數(shù)量+褐化等級×該等級的褐化數(shù)量）/褐化總數(shù)

2 結果與分析

2.1 不同天然添加物濃度對‘洛陽紅’腋芽褐化的影響

從表1 可以看出，添加椰汁的培養(yǎng)基，綜合褐化程度都比對照低，其中200 和300 g/L 的椰汁的處理，褐化程度顯著低于對照，說明椰汁起到了一定的控制褐化的作用；添加馬鈴薯汁的培養(yǎng)基對褐化的控制效果不僅不明顯，還有加重的現(xiàn)象。

表1 天然添加物對‘洛陽紅’腋芽褐化的影響

2.2 瓊脂及活性炭對‘洛陽紅’腋芽褐化的影響

從表2 可以看出，未添加活性炭時，液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基相比，液體培養(yǎng)基培養(yǎng)的腋芽褐化程度顯著低于固體培養(yǎng)基，說明液體培養(yǎng)基能起到控制褐化的作用。添加活性炭后，無論是液體培養(yǎng)基還是固體培養(yǎng)基，褐化率及褐化程度顯著降低，說明活性炭對控制褐化起到了有效的作用。

表2 瓊脂及活性炭對‘洛陽紅’腋芽褐化的影響

2.3 不同預處理對‘洛陽紅’腋芽褐化的影響

從表3 可以看出經(jīng)過去除鱗片與熱處理的的腋芽，達到了較好的控制褐化的目的，而經(jīng)過冷處理與水沖洗的褐化率較高，褐化程度較大。

表3 不同的預處理對‘洛陽紅’腋芽褐化的影響

在第21 天觀察時，去除鱗片與熱處理的腋芽長高2~3 cm，而冷處理中只有4 個長勢良好，2 個沒有褐化，其他均沒有發(fā)芽，在水沖洗處理中，有12 個長勢良好，3 個沒有褐化。

3 結論與討論

在液體培養(yǎng)基中，外植體溢出的有毒物質(zhì)能夠很快擴散，從而減輕了對外植體的傷害[5]，因此液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基相比，液體培養(yǎng)基能起到控制褐化的作用。添加活性炭的培養(yǎng)基褐化率及綜合褐化程度顯著降低，說明活性炭對控制褐化起到了有效地控制作用。添加活性炭的原理是活性炭能夠吸附培養(yǎng)基中的有害物質(zhì)，如瓊脂中所含的雜質(zhì)，培養(yǎng)物在培養(yǎng)過程中分泌的酚、醌類物質(zhì)以及蔗糖在高壓消毒時產(chǎn)生的5-羥甲基糠醛[6]。

椰汁不僅可以在組織培養(yǎng)過程中提供營養(yǎng)，還可以防止褐化，已廣泛應用到蝴蝶蘭、文心蘭等花卉的組織培養(yǎng)中[7-8]。該次研究發(fā)現(xiàn)，在牡丹腋芽培養(yǎng)時，加入椰汁，可明顯減低褐化指數(shù)，起到控制褐化的作用。接種前對腋芽除鱗片與熱處理的腋芽，可達到控制褐化的目的，而經(jīng)過冷處理與水沖洗的反而使褐化率提高，褐化程度增大。