張鵬遠 任龍輝 王建光 陳壯壯 鐘宇 陳穗云

（云南大學生命科學學院，昆明　650091）

薯蕷褪綠壞死花葉病毒CP基因的原核表達及抗血清的制備

張鵬遠 任龍輝 王建光 陳壯壯 鐘宇 陳穗云

（云南大學生命科學學院，昆明650091）

薯蕷褪綠壞死花葉病毒（yam chlorotic necrotic mosaic virus，YCNMV）是馬鈴薯Y病毒科柘橙病毒屬暫定成員。采用RT-PCR方法，以Sprimer/M4簡并引物對擴增獲得的YCNMV分離物3'端基因組序列為參考序列，根據(jù)該序列設計CP基因特異引物獲得YCNMV CP基因并插入pET-30a表達載體中，在BL21（DE3）菌株中誘導表達。獲得的融合蛋白經Ni+-NTA柱純化后免疫新西蘭大白兔，制備抗血清。結果表明，連接在表達載體中的CP基因序列及表達的蛋白氨基酸序列與預期的CP基因核苷酸和氨基酸序列同源性均為99.65%。聚丙烯酰胺凝膠電泳結果表明，獲得的融合蛋白大小約為44 kD，與預期蛋白大小相符。制備的抗血清經Western blotting和ID-ELISA檢測表明，獲得的多克隆抗體效價較高，能可靠、靈敏、特異地與YCNMV病毒顆粒結合，可應用到該病毒的檢測中。

薯蕷褪綠壞死花葉病毒；外殼蛋白；原核表達；抗血清

薯 蕷（Dioscorea opposite Thunb） 是 薯 蕷 科（Dioscoreaceae）薯蕷屬（Diosorea L.）單子葉纏繞藤本植物，廣泛分布于熱帶至溫帶地區(qū)，是西非、東南亞和南美的主要糧食和經濟作物。小花盾葉薯蕷（Dioscorea parviflora C. T. Ting），又名苦良姜，是云南省特有的薯蕷種類，主要分布于金沙江河谷流域。因其薯蕷皂甙含量較高，具有較高的藥用價值，近年來，大量的小花盾葉薯蕷野生資源受到嚴重破壞。為了提高商品價值，該品種在云南省已形成規(guī)?；N植。但薯蕷常以營養(yǎng)繁殖方式連續(xù)多年進行栽培，薯蕷病害發(fā)生嚴重，尤其以病毒病的發(fā)生更為明顯［1］。

薯蕷褪綠壞死花葉病毒（yam chlorotic necrotic mosaic virus，YCNMV）是近年來從云南小花盾葉薯蕷分離到的一個新病毒，屬于馬鈴薯Y病毒科（Potyviridae）柘橙病毒屬（Macluravirus）成員［2，3］。目前，柘橙病毒屬共收錄有7個病毒，其中6個確定種，1個暫定種，YCNMV被國際病毒命名委員會（ICTV）確定為該病毒屬的暫定成員［3］。

國際上檢測植物病毒主要從病毒生物學特征（例如，病毒顆粒形態(tài)、長度、宿主范圍及感病植株癥狀等）、血清學以及分子生物學角度進行鑒別［4］。但薯蕷樣品常存在著復合侵染情況［5］，單純從植物病征難以進行準確有效的判斷；同時，薯蕷葉片含有大量的皂苷、多糖等物質，對RNA的提取技術及成本要求較高，為該病毒的檢測帶來很多困難。因此，為了能快速有效的檢測該病毒及進一步確定該病毒的分類學地位，本實驗克隆YCNMV病毒的CP基因，并通過基因工程的方法構建原核表達載體，獲得該病毒的CP融合蛋白，經免疫注射新西蘭白兔制備抗血清，旨在建立起相對敏感、特異、可靠的血清學檢測體系，為該病毒的檢測提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗用毒源由本實驗室采自云南永勝縣，并保存于實驗室無蟲溫室大棚內由專人負責管理與維護。pET-30a原核表達載體由本實驗室保存于-80℃冰箱；DH5α菌株、BL21（DE3）菌株、r Taq酶、Easysee Western Marker等購自北京全式金生物技術有限公司；Eco R V、Hin d III內切酶以及T4連接酶等購自Fermentas公司；DL5000 Marker、質粒抽提試劑盒、膠純化回收試劑盒、M-MLV Reverse Transcriptase、Ribonuclease Inhibitor、IPTG、pMD19-T simple克隆載體及X-Gal、LA Taq DNA聚合酶購自TaKaRa公司；40%丙烯酰胺購自北京鼎國生物公司；羊抗兔IgG購自ABcam；Tris-base、EDTA-Na2+、甘油、Tryptone、Yeast extract及透析袋等其他常用試劑均購自Sigma公司；Ni-NTA+Agarose親和純化柱購自QIAGEN公司；引物由上海捷瑞生物工程有限公司及Invitrogen上海合成部進行合成；菌液送南京金斯瑞生物科技有限公司測序。

1.2 方法

1.2.1 薯蕷總RNA的提取及cDNA的合成 薯蕷總RNA按照RNeasy Plant mini（QIAGEN公司）試劑盒所述方法提取，以NanoDrop檢測OD260/280并在1.5%濃度的變性瓊脂糖凝膠電泳以確定提取RNA的質量，符合標準的樣品于-80℃凍存?zhèn)溆谩Ｒ訫4T（5'-GTTTTCCCAGTCACGAC（T）15-3'）引物進行反轉錄，共兩步。反轉錄第一步體系如下：1 μL M4T引物；5 μL模板RNA（185 ng/μL）；共計6 μL反應液于70℃孵育10 min后冰浴急冷2 min。第二步體系如下：6 μL第一步反應液；2 μL 5×M-MLV Buffer；0.5 μL dNTP Mixture（10 mmol/L each）；0.25 μL RNase Inhibitor（40 U/μL）；0.5 μL M-MLV反 轉錄酶（200 U/μL）；0.75 μL RNase free ddH2O，以上共計10 μL反應液，于42℃反應1 h，70℃反應15 min，反應產物于-80℃冰箱凍存。

1.2.2 pET30a-CP原核表達載體的構建 根據(jù)前期工作中以Sprimer/M4引物對［6］擴增獲得的YCNMV病毒3'端序列（數(shù)據(jù)未提供），由上海捷瑞生物工程公司合成如下引物：CP-F：5'-GCAGATATCATGG ATCTTACAGCGCCAG-3'；CP-R：5'-GCAAAGCTTTTA ATATAAGGCTGGACGC-3'（下劃線部分分別為Eco R V及Hin d III酶切位點）。以稀釋10倍后的cDNA為模板，采用TaKaRa公司LA Taq DNA聚合酶按照使用說明書上所述體系進行PCR擴增。擴增產物經1.5%（W/V）瓊脂糖凝膠100 V電泳60 min分離后，以TaKaRa公司膠純化回收試劑盒精確切取目的條帶回收，具體操作參照試劑盒所述步驟進行。純化產物與pMD19-T simple按照說明書所述比例于16℃過夜連接后轉化DH5α感受態(tài)細胞，經藍白斑篩選及菌液PCR進行初步驗證后，提取陽性單克隆質粒送南京金斯瑞公司測序以驗證質粒序列。將驗證序列無誤的質粒及pET-30a空載體以Eco R V及Hin d III按說明書所述體系分別進行雙酶切后純化回收目的片段與酶切后的pET30a載體，T4連接酶進行連接后，將pET30a-CP載體轉化到BL21（DE3）感受態(tài)細胞，再經過菌液PCR及pET30a-CP質粒測序驗證無誤后，獲得含有pET30a-CP載體的表達菌株。

1.2.3 CP基因的誘導表達體系的優(yōu)化及蛋白純化轉化后的表達菌先以不同濃度IPTG、不同誘導時間進行誘導以摸索最佳誘導表達條件并對該融合蛋白的溶解性進行分析。最終誘導表達產物經10% SDSPAGE電泳后，以考馬斯亮藍G-250染色檢測結果。誘導表達的蛋白使用Ni+-NTA Agarose親和純化柱進行純化后，分別以70、100、200和300 mmol/L咪唑梯度洗脫，確定最佳洗脫條件。洗脫蛋白以透析袋和PBS緩沖液（pH7.4）進行透析，透析蛋白經NanoDrop檢測濃度及質量后凍存于-80℃冰箱。

1.2.4 抗血清的制備、效價檢測及Western blotting檢測 純化后的蛋白經過定量檢測后，免疫2只新西蘭白兔（2-2.5 kg），每2-3周進行一次皮下免疫（免疫抗原400 μg/次），共免疫4次，待效價大于1∶50 000時進行采血制備抗血清，凍存于-80℃冰箱備用。獲得的抗血清以ABcam公司的羊抗兔-HRP作為二抗，以ID-ELISA檢測其效價（效價=樣品OD/空白OD≥2.1，即P/N≥2.1時的最高稀釋度，包被抗原濃度5 μg/mL，100 μL/孔），并通過Western blotting檢測其與抗原蛋白結合的特異性情況［7］。

1.2.5 樣品植株的ID-ELISA檢測 將樣品葉片以1∶10 000（W/V）的比例，以包被緩沖液PBST進行稀釋后，研磨，經短暫離心后取上清100 μL/孔加入到酶標板中，以制備的兔抗作為一抗，辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG為二抗進行ID-ELISA檢測，最后以TMB顯色并測定OD值，計算P/N。

2 結果

2.1 YCNMV CP基因的克隆及原核表達載體的構建以RNeasy Plant mini（QIAGEN）試劑盒可獲得高質量的總RNA（圖1），可以用于后續(xù)試驗。以設計的CP基因特異引物CP-F及CP-R可擴增到800 bp左右的特異性條帶，該條帶與預期大小相符（圖2）。將該條帶切膠純化并插入到pMD19-T simple克隆載體中，測序結果表明，該分離物CP基因核苷酸序列為867 nt，序列能通讀，能正確翻譯氨基酸序列，連接在載體中的CP基因序列與預測的CP基因核苷酸和氨基酸序列同源性均為99.65%（圖3和圖4），即獲得的CP基因序列與預期序列基本一致。該克隆載體經雙酶切后，將CP基因插入到pET-30a原核表達載體，測序結果表明，核苷酸序列與之前測定序列一致。說明已成功構建了YCNMV-CP基因的原核表達載體。

圖1 薯蕷總RNA樣品瓊脂糖凝膠電泳

圖2 CP基因RT-PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳

2.2 YCNMV CP基因的原核表達及蛋白純化

將成功構建的pET30a-CP原核表達載體轉化BL21（DE3）菌株進行誘導表達，初步確立誘導表達體系為0.8 mmol/L IPTG，以28℃誘導6 h，同時分析融合蛋白的溶解性。SDS-PAGE結果（圖5）表明，表達的融合蛋白多數(shù)以包涵體的形式集中在沉淀部分，而上清中僅存在相對較少的表達蛋白。誘導表達產物經離心后，上清液中的融合蛋白經Ni+-NTA親和層析柱純化后，以PBS緩沖液（pH7.4）進行透析，以NanoDrop檢測，單次純化蛋白濃度為0.192-0.231 mg/mL。

圖3 連接到pMD19-T Simp le上的CP核苷酸序列與模板序列比對結果

2.3 抗血清效價檢測及Westernblotting檢測

制備的抗血清通過ID-ELISA檢測效價，結果表明該抗血清在稀釋1∶256 000時，P/N=2.2，表明該抗血清效價為1∶256 000，可以用于后續(xù)檢測（表1）。Western blotting（圖6）分析表明，制備的抗體僅與抗原蛋白產生特異條帶，而免疫前血清（CK-）在相同位置無條帶。

圖4 載體中CP蛋白與模板CP蛋白氨基酸序列比對

圖5 純化蛋白溶解度及純度的SDS-PAGE電泳分析

表1 ID-ELISA抗血清效價測定結果

圖6 CP蛋白抗血清的W estern blotting檢測

2.4 不同地區(qū)薯蕷病葉樣品的ID-ELISA檢測

以制備的抗血清對采自云南省境內麗江、鶴慶、維西、映華、祿豐及永勝等地共計101個表現(xiàn)出褪綠、壞死等癥狀的薯蕷病葉樣品研磨液進行ID-ELISA檢測（圖7）并測定其吸光度值。檢測出映華（6株）、祿豐（2株）及永勝（5株）等3地共計13個樣品ID-ELISA結果顯示為陽性（P/N≥2.1）。篩選出的陽性樣品經電鏡及RT-PCR檢測后證實該樣品內確實含有YCNMV病毒。

3 討論

薯蕷褪綠壞死花葉病毒（YCNMV）是近年來在小花盾葉薯蕷中新發(fā)現(xiàn)的柘橙病毒屬病毒，屬于馬鈴薯Y病毒科。目前僅見該病毒侵染薯蕷，尚未發(fā)現(xiàn)該病毒侵染其他物種的報道，鮮見與該病毒相關的其他研究報道。薯蕷是我國一種重要的藥材，同時也是深受群眾喜愛的一種食材。因此近年來在云南省大理、祿豐等多地已經形成規(guī)?；N植。但由于薯蕷是多年生草本纏繞植物，常采用無性繁殖的方式年復一年地進行種植，這為該型病毒的繁殖、擴散提供了良好的條件，同時也對薯蕷的品質與產量帶來了不利影響。因此，構建針對該型病毒穩(wěn)定、可靠的血清學檢測體系對后續(xù)檢測、研發(fā)、抗病等工作極為重要。

圖7 不同地區(qū)樣品的ID-ELISA檢測結果

本實驗以RT-PCR及克隆的方法，構建了含有YCNMV CP基因的原核表達載體。通過對該型病毒CP基因進行的序列比對及分析發(fā)現(xiàn)，該型病毒分離物僅在CP蛋白N端第17-19位氨基酸殘基中存在與其親緣關系較近的Chinese yam necrotic mosaic virus（CYNMV）中的“DKG”結構域相似的“SKG”結構域［8］，該結構域是否也與先前報道的存在于馬鈴薯Y病毒科中高度保守的“DAG”行使相同或相似功能尚不得而知。其他保守序列，如“NGTS”（140-143 aa）及“AFDF”（217-220 aa）［9］均在該型病毒CP蛋白中出現(xiàn)。

外源基因在大腸桿菌內進行原核表達時，由于多種因素的存在，如短時間內形成高濃度多肽，導致蛋白無法正確折疊等，極易使表達的蛋白形成包涵體并沉淀［10］。這對后續(xù)的蛋白純化工作造成了很大影響，導致單次純化的蛋白量大大減少。通過對表達蛋白的溶解狀態(tài)分析，以及不同誘導表達體系的摸索，實驗確立了優(yōu)化后以較低溫度（28℃）、較長時間（6 h）及較高濃度IPTG（0.8 mmol/L）進行誘導表達的體系，促進了CP融合蛋白在大腸桿菌內的可溶性表達。

在抗血清的制備方面，目前，通過電鏡負染觀察已發(fā)現(xiàn)球狀、桿狀、線狀等多種不同類型病毒復合侵染同一株小花盾葉薯蕷的情況（數(shù)據(jù)未提供），且對于含有大量多糖多酚類物質的植株來說很難提純病毒［11，12］。因此，以純化病毒粒子來制備抗血清的傳統(tǒng)方案并不適用。目前，已有諸多通過表達病毒CP基因融合蛋白免疫動物以制備抗血清的研究報道［13-17］證明，該方法可靠、有效。本研究通過進行RT-PCR、構建原核表達載體、誘導pET30a-CP融合蛋白的表達及純化、制備抗血清、后續(xù)檢測篩選等相關工作，成功制備出可用于檢測YCNMV的抗血清并應用到樣品篩查中，為后續(xù)的研究奠定了基礎。

4 結論

通過構建原核表達載體的方法獲得了能夠正確表達YCNMV CP基因的大腸桿菌表達菌株。該表達菌表達的融合蛋白經純化后免疫新西蘭大白兔，制備效價較高的抗血清，檢測表明該抗血清可以有效地檢測到病樣中的YCNMV病毒，初步建立起了可用于檢測YCNMV的ELISA檢測體系。

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（責任編輯 馬鑫）

Prokaryotic Expression of CP Gene of Yam Chlorotic Necrotic M osaic Virus and Preparation of Its Antiserum

Zhang Pengyuan Ren Longhui Wang Jianguang Chen Zhuangzhuang Zhong Yu Chen Suiyun
（School of Life Science，Yunnan University，Kunming650091）

Yam chlorotic necrotic mosaic virus（YCNMV）is a new tentative species of genus Macluravirus in the family Potyviridae. Referring to the 3'-terminal sequence amplified with degenerate primers Sprimer/M4 by RT-PCR， we designed the specific primer pair of CP gene of YCNMV. The PCR product of CP gene was inserted into the pET30a prokaryotic expression vector， which was subsequently expressed in BL21（DE）strain by induction. Fusion protein was purified with Ni+-NTA affinity column and was used to immunize New Zealand white rabbits to produce the antiserum. Results showed that the CP gene ligated in the prokaryotic expression vector shared 99.65% homology with the template CP gene in both nucleotide and protein sequence. SDS-PAGE results indicated that the CP fusion protein was about 44 kD in size， which was in accord with the prediction. The antiserum was tested by both ID-ELISA method and Western blotting， which showed that the polyclonal antibody had a relatively high level of titer， and reliably， sensitively and specifically bound with the YCNMV virus particles. These results indicate that the antiserum is suitable for YCNMV detection.

yam chlorotic necrotic mosaic virus；coat protein；prokaryotic expression；antiserum

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.08.030

2014-11-19

國家自然科學基金項目（31101416），云南大學生命科學學院科學研究與人才培養(yǎng)開放基金項目（2013S205），云南省煙草公司項目（2011YN60，2012YN10，2012YN36，2012YN13）

張鵬遠，男，博士研究生，研究方向：植物病毒及分子生物學；E-mail：acception@yeah.net

王建光，男，博士，副教授，碩士生導師，研究方向：植物病毒學；E-mail：jgwangyn@yeah.net