余凱敏 馮為民 李國超 張家禹 劉麗麗 閆艷春

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，北京　100081）

毒死蜱的環(huán)境生物學(xué)效應(yīng)分析

余凱敏 馮為民 李國超 張家禹 劉麗麗 閆艷春

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，北京100081）

高毒有機磷農(nóng)藥禁用以后，毒死蜱作為其替代品逐漸開始大規(guī)模應(yīng)用。毒死蜱在水中降解緩慢，因此在水中的殘留會對水生生物及其他生物造成潛在危害。為探究低濃度毒死蜱的內(nèi)分泌干擾效應(yīng)，使用流式細(xì)胞儀分析了其對人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞HEC-1B生長周期的影響。為探究高濃度毒死蜱的生物毒性，將斑馬魚胚胎暴露在不同濃度的毒死蜱（0、1.0、2.0、3.0和4.0 ppm）中60 h，發(fā)現(xiàn)毒死蜱能導(dǎo)致斑馬魚胚胎的死亡和嚴(yán)重畸形，并且胚胎存活率與處理濃度呈負(fù)相關(guān)，畸形率與處理濃度呈正相關(guān)。最后，檢測了毒死蜱處理后斑馬魚胚胎中5種神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)情況。結(jié)果表明，低濃度毒死蜱具有內(nèi)分泌干擾效應(yīng)，高濃度毒死蜱會影響斑馬魚神經(jīng)系統(tǒng)的正常發(fā)育。

毒死蜱；環(huán)境生物學(xué)效應(yīng)；斑馬魚胚胎；神經(jīng)發(fā)育毒性；內(nèi)分泌干擾效應(yīng)

毒死蜱是一種世界范圍內(nèi)廣泛使用的有機磷殺蟲劑，早在1965年毒死蜱就被引入美國市場并且廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和家庭害蟲的防治［1］。2008年1月，我國政府徹底禁止了對硫磷等5種高毒有機磷農(nóng)藥的生產(chǎn)和使用，毒死蜱作為高毒有機磷農(nóng)藥的替代品應(yīng)用日益廣泛［2］。毒死蜱的大規(guī)模應(yīng)用，也使其逐漸成為人體健康和環(huán)境污染研究領(lǐng)域的重點關(guān)注對象。盡管毒死蜱屬于中等毒性農(nóng)藥，但是其對多數(shù)水生生物仍具有較高毒性，一些發(fā)達(dá)國家已經(jīng)開始禁用或者限制使用毒死蜱［3］。

農(nóng)作物病蟲害防治過程中，使用的農(nóng)藥大部分會進入農(nóng)田土壤，并且通過滲透、排水等方式轉(zhuǎn)移至地下水或河流，造成水體污染［4］。有研究指出，在相對集中的玉米種植區(qū)，徑流水帶入河水中的毒死蜱濃度可達(dá)0.1 μg/L［5］，大豆種植區(qū)地表水毒死蜱濃度最高達(dá)10.8 μg/L［6］，而在肯尼亞的Naivasha湖中毒死蜱的濃度高達(dá)26.6 μg/L［7］。由于毒死蜱在水中降解的速度緩慢，且會隨著水體的轉(zhuǎn)移而造成二次污染，因此其在水中的殘留會對水生生物及其他生物造成潛在的危害。

斑馬魚具有體型小、易于培養(yǎng)、產(chǎn)卵量大、胚胎易于觀察和顯微操作等特點，并且斑馬魚胚胎和幼魚對有害物質(zhì)非常敏感，因此常用于研究環(huán)境物質(zhì)對發(fā)育的影響及作用機制［8-10］?；谶@些優(yōu)勢，斑馬魚已經(jīng)成為一種公認(rèn)的發(fā)育生物學(xué)和毒理學(xué)研究模式生物。由于毒死蜱在水環(huán)境中具有難以降解的特性，因此水生模式生物斑馬魚也成為本研究的理想模型。本研究首先脅迫處理人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞（HEC-1B）進行流式細(xì)胞分析，確定低濃度毒死蜱的內(nèi)分泌干擾物效應(yīng)，然后分析毒死蜱對斑馬魚的急性毒性和可能的神經(jīng)發(fā)育毒性，旨在探究水環(huán)境殘留的毒死蜱所具有環(huán)境生物學(xué)效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 化學(xué)試劑 毒死蜱（O，O-二乙基-O-3，5，6-三氯-2-吡啶基硫代磷酸酯，chlorpyrifos，CPF）購自于中國山東省天成生物科技有限公司，純度≥98%；17β-雌二醇（E2）購自于Sigma公司，純度≥98%。熒光染料碘化丙啶（Propidium Iodide，PI）購自于Sigma公司。MEM細(xì)胞培養(yǎng)液、牛血清、胰酶、PBS購自BD公司。本研究中其他化學(xué)試劑均屬于分析純級別，各種試劑先配制母液保存，使用前配制相應(yīng)濃度的工作液。

1.1.2 實驗材料 本研究使用的AB型野生斑馬魚購自于國家斑馬魚資源中心（China Zebrafish Resource Center，CZRC），人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株HEC-1B購自于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤細(xì)胞庫。

1.2 方法

1.2.1 癌細(xì)胞的培養(yǎng)和處理 HEC-1B在MEM培養(yǎng)液中采用開放式單層貼壁培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃，5% CO2，飽和濕度。加受試物前4 d將細(xì)胞用PBS洗滌后改為在無酚紅MEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)，目的是耗盡細(xì)胞內(nèi)儲存的雌激素。設(shè)置空白對照組，雌激素對照組（E2）：終濃度為0.05 ppm；毒死蜱梯度處理組（CPF）：終濃度分別為0.05、0.01和0.005 ppm。將HEC-1B 細(xì)胞接種于5 mL培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)24 h待細(xì)胞貼壁后，加入受試物處理72 h，用胰酶消化收集細(xì)胞，充分吹打，制成單細(xì)胞懸液。

1.2.2 細(xì)胞周期分析 使用PI（碘化丙啶）染色法檢驗細(xì)胞周期。收集胰酶消化的HEC-1B細(xì)胞，使用預(yù)冷70%乙醇于4℃固定一晚。離心收集細(xì)胞，使用50 μg/L的PI溶液4℃避光染色30 min，PBS洗滌兩遍后40 μm篩網(wǎng)過濾，制成單細(xì)胞懸液。使用流式細(xì)胞儀（BD FACSJazz，USA）在488 nm波長下觀察細(xì)胞周期分布及亞二倍體細(xì)胞所占比例，每個樣本檢測3次。數(shù)據(jù)使用流式細(xì)胞分析軟件FlowJow 7.6.1分析。

1.2.3 斑馬魚養(yǎng)殖 本研究使用的AB型野生斑馬魚，其養(yǎng)殖方法和胚胎收集按照本實驗室的傳統(tǒng)方法進行。即野生型（AB品系）斑馬魚養(yǎng)殖在封閉的貫流系統(tǒng)（北京愛生公司）中，自來水經(jīng)過活性炭過濾，控制水溫（28±0.5）℃，光照黑暗比例14∶10。斑馬魚每天喂食3次，食物為豐年蟲幼蟲。將產(chǎn)卵用的成魚按照2∶1的比例裝入盒中準(zhǔn)備收集受精卵。挑選發(fā)育正常（無畸形）的0.5-1.0 hpf的胚胎，隨機分裝于一次性培養(yǎng)皿中（50/個）。

1.2.4 毒死蜱對斑馬魚的毒性測試 以定時更換處理液的方式，使用毒死蜱對斑馬魚胚胎進行毒性處理，設(shè)計4個毒死蜱實驗濃度，分別為0、1.00、2.00、3.00和4.00 ppm，每個濃度3個平行處理，每個處理的培養(yǎng)皿中分別加入50個發(fā)育正常的胚胎和40 mL處理液。由于毒死蜱難溶于水，易溶于有機溶劑這一特征，故選用丙酮作為助溶劑。在處理液中，丙酮的最高濃度為0.1%。我們以前的研究表明，低濃度（＜0.1%）的丙酮不會影響實驗結(jié)果。

1.2.5 斑馬魚胚胎形態(tài)學(xué)觀察 毒死蜱暴露處理后，每12 h對斑馬魚胚胎進行一次鏡檢（奧林巴斯公司，日本）觀察。將斑馬魚胚胎放入加有3%亞甲基纖維素的雙凹載玻片中，明場觀察并且拍照記錄。統(tǒng)計分析胚胎的孵化率、畸形率和死亡率。

1.2.6 神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)基因的表達(dá) 毒死蜱暴露處理后，收集胚胎并且加入TRIzol試劑-80℃保存。每種濃度的胚胎分別取30枚保存，一式3份。使用TRIzol試劑提取總RNA，總RNA濃度在260 nm下估算，質(zhì)量則通過OD260/OD280比率驗證。使用0.8%瓊脂糖凝膠電泳、溴化乙錠染色進行總RNA的進一步驗證。單鏈cDNA的合成按照試劑盒（PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser，TaKaRa， Japan）說明書進行。以β-actin作為內(nèi)參調(diào)整數(shù)據(jù)，使用Primer Premier 5軟件設(shè)計引物（表1），PCR擴增程序為：95℃ 10 min；95℃ 30 s，57℃ 30 s，72℃1 min?；虮磉_(dá)的差異倍數(shù)通過2-△△Ct方法計算。3組平行均進行表達(dá)量檢測。

1.2.7 統(tǒng)計分析 使用Levene檢驗方法檢測數(shù)據(jù)的方差齊性，并且使用SPSS19.0（美國SPSS公司）進行單因素方差分析（one-way ANOVA）和Duncan法多重比較分析。認(rèn)定P＜0.05作為統(tǒng)計顯著性的標(biāo)準(zhǔn)，所有值表示方法均為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（x-±s）。

2 結(jié)果

2.1 低濃度毒死蜱的毒性

2.1.1 毒死蜱對HEC-1B細(xì)胞周期的影響 為了進一步研究毒死蜱的內(nèi)分泌干擾效應(yīng)，選用人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞（HEC-1B）進行脅迫處理?？紤]到癌細(xì)胞的耐受性，因此選用相對較低的濃度進行暴露處理。通過碘化丙啶染色和流式細(xì)胞儀檢測，并且通過FlowJow分析。對照組的細(xì)胞增殖系數(shù)PI（proliferous index，PI）為22.17，雌二醇E2對照組PI為41.19，毒死蜱0.05、0.01和0.005 ppm處理組的增殖系數(shù)PI分別為36.55、34.74和30.96（表2）。對比各組增值系數(shù)，E2＞CPF0.05＞CPF0.01＞CPF0.005＞CK。

表2 低濃度毒死蜱對HEC-1B細(xì)胞周期的影響

2.1.2 毒死蜱對斑馬魚胚胎孵化的影響 考慮到毒死蜱在水環(huán)境中的溶解度僅為1.2 ppm，因此使用較低的實驗濃度。使用梯度濃度CPF（0、0.10、0.25、0.50、0.75和1.00 ppm）暴露處理斑馬魚胚胎48 h后，出現(xiàn)了一個有趣的現(xiàn)象，即處理組胚胎比對照組快，并且胚胎的孵化率與暴露濃度成正比（未發(fā)表），同時低濃度處理組很少出現(xiàn)胚胎發(fā)育畸形。

2.2 高濃度毒死蜱的毒性

2.2.1 毒死蜱對斑馬魚的致死作用 采用梯度濃度的毒死蜱（0、1.00、2.00、3.00和4.00 ppm）對斑馬魚胚胎進行處理，每12 h進行一次處理液更換和胚胎觀察，記錄各時段胚胎及幼魚的存活情況，對正常幼魚和死亡幼魚進行拍照記錄（圖1-A和圖1-B）。處理60 h后，毒死蜱0、1.00、2.00、3.00和4.00 ppm處理組存活率分別為98.9%、91.1%、48.4%、37.8%和23.3%（圖1-C）。

圖1 毒死蜱的致死作用

2.2.2 毒死蜱對斑馬魚的致畸作用 梯度濃度的毒死蜱處理胚胎時，處理48 h后孵化的幼魚就會出現(xiàn)體軸彎曲、心包囊腫等畸形現(xiàn)象（圖2-A和圖2-B），統(tǒng)計該時段的幼魚出現(xiàn)各畸形的數(shù)目并計算平均畸形率。處理48 h后，毒死蜱0、1.00、2.00、3.00和4.00 ppm處理組體軸彎曲的比例分別為3.3%、14.6%、23.9%、37.1%和36.8%（圖2-C），即隨著濃度的提高，斑馬魚幼魚出現(xiàn)畸形的比例也隨之提高。而心包囊腫的畸形現(xiàn)象出現(xiàn)的比例相對較低，并且該現(xiàn)象出現(xiàn)的時間相對較晚。

2.2.3 毒死蜱對斑馬魚的神經(jīng)毒性 考慮到毒死蜱具有神經(jīng)毒性，因此選取斑馬魚的5種神經(jīng)發(fā)育標(biāo)志基因作為參考，從基因的轉(zhuǎn)錄水平探究其神經(jīng)發(fā)育毒性。使用60 h半致死濃度的毒死蜱（2.00 ppm）處理斑馬魚胚胎48 h后，收集胚胎，提取總RNA進行熒光定量PCR分析，得到各組基因表達(dá)量變化。本研究選取的神經(jīng)標(biāo)志基因包括neurog1、elavl3、nkx2.2a、nestin和gfap，相對于空白對照組分別上調(diào)1.30、0.58、1.46、1.58和0.42倍（圖3）。

圖2 毒死蜱的致畸作用

圖3 神經(jīng)標(biāo)志基因m RNA表達(dá)量的變化

3 討論

隨著毒死蜱的廣泛應(yīng)用，對其毒理的研究也越來越多樣化。2007年美國環(huán)保署（US EPA）公布首批73種化學(xué)物質(zhì)進行內(nèi)分泌干擾物檢測（Endocrine Disruptor Screening Program，EDSP），其中就包括毒死蜱［11］。內(nèi)分泌干擾物（endocrine disrupting chemicals，EDCs）是指干擾生物體內(nèi)維持內(nèi)穩(wěn)態(tài)及調(diào)節(jié)生殖、發(fā)育過程的天然激素的正常體內(nèi)代謝過程的外源性物質(zhì)［12］，包括農(nóng)藥、洗滌劑、殺菌劑、化妝品、合成雌激素等一系列化合物［13］。一些研究表明，毒死蜱對雄性小鼠具有內(nèi)分泌干擾效應(yīng)，導(dǎo)致精子異?；蛩劳觯?4］。同時，毒死蜱也會對雌性小鼠生殖器官造成永久傷害［15］。而在我們之前的研究中，低濃度的毒死蜱能加快斑馬魚胚胎的孵化，可能是毒死蜱的一種內(nèi)分泌干擾效應(yīng)。為了驗證毒死蜱的這種作用，本研究選用人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞HEC-1B進行低濃度毒死蜱脅迫處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)毒死蜱處理組的細(xì)胞增殖系數(shù)高于空白對照組，并且同等濃度下其增殖效應(yīng)不及雌二醇，即毒死蜱具有類雌激素的作用，因此證明毒死蜱具有內(nèi)分泌干擾物效應(yīng)。

動物實驗是有毒物質(zhì)毒性測試、新藥開發(fā)等過程中的一個重要環(huán)節(jié)［16］。本研究選用的模式生物斑馬魚，其胚胎發(fā)育早期對環(huán)境毒性物質(zhì)具有相當(dāng)強的敏感性，并且產(chǎn)生不同的形態(tài)學(xué)病變［17-19］。在本研究中，梯度濃度的毒死蜱處理斑馬魚胚胎后，其存活率隨著處理濃度的上升而降低，并且60 h的半致死濃度約為2 ppm。毒死蜱不僅會導(dǎo)致斑馬魚胚胎的死亡，還會造成存活胚胎發(fā)育的畸形，并且這種畸形的比例與處理濃度正相關(guān)。斑馬魚毒性測試結(jié)果表明，高濃度的毒死蜱對斑馬魚具有較強的毒性，并且會導(dǎo)致斑馬魚胚胎的死亡和發(fā)育畸形。

研究表明，毒死蜱及其代謝產(chǎn)物能夠抑制乙酰膽堿酶，從而阻止乙酰膽堿的降解，造成神經(jīng)遞質(zhì)在突觸的累積，導(dǎo)致持久的受體刺激和神經(jīng)相關(guān)信號通路的異常［20，21］，這也是毒死蜱毒殺害蟲的主要方式。研究發(fā)現(xiàn)，毒死蜱能夠影響小鼠腦部的發(fā)育、造成小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷［22，23］。同時，應(yīng)用基因芯片技術(shù)對處理前后的大鼠腦干和前腦進行轉(zhuǎn)錄譜分析，發(fā)現(xiàn)差異基因主要參與神經(jīng)細(xì)胞的生長、分化，神經(jīng)遞質(zhì)合成等過程［24］。因此，為了判斷毒死蜱對斑馬魚的神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育毒性，本研究選取了5種斑馬魚神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)的標(biāo)志基因，試圖從轉(zhuǎn)錄水平進行探究。neurog1（ngn1）是神經(jīng)前體細(xì)胞的標(biāo)志基因，在斑馬魚胚胎受精24 h后主要分布于前腦、中腦、后腦、脊髓、耳部和鰓背基板處［25］。elavl3是最早期的神經(jīng)元標(biāo)志物之一，在神經(jīng)系統(tǒng)廣泛表達(dá)，是神經(jīng)元決定的標(biāo)志［26］。nkx2.2a在哺乳動物和斑馬魚的背腹側(cè)神經(jīng)系統(tǒng)的形成與功能中起重要作用［27］。nestin是一種中等纖維蛋白，它在哺乳動物神經(jīng)前體細(xì)胞中高表達(dá)，已被廣泛用作神經(jīng)前體細(xì)胞的標(biāo)志分子［28］。gfap 為神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志基因，于胚胎受精12 h后在腦中表達(dá)，15 h至成魚在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中持續(xù)表達(dá)［29］。而本研究中，2 ppm毒死蜱處理斑馬魚胚胎48 h后，5種標(biāo)志基因的mRNA表達(dá)量基本都出現(xiàn)明顯上調(diào)，造成神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)紊亂，從而影響神經(jīng)系統(tǒng)正常發(fā)育，也可能是造成斑馬魚胚胎出現(xiàn)畸形的原因。

4 結(jié)論

低濃度的毒死蜱具有內(nèi)分泌干擾效應(yīng)，能夠加速胚胎的孵化脫膜，同時也能提高癌細(xì)胞的增殖系數(shù)，促進細(xì)胞的生長和分裂。通過斑馬魚的急性毒理研究，證明水環(huán)境中高濃度的毒死蜱主要表現(xiàn)為神經(jīng)毒性，能夠造成胚胎的畸形和死亡，并且顯著影響神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)基因的表達(dá)量。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

An Analysis of Environmental and Biological Effects of Chlorpyrifos

Yu Kaimin Feng Weimin Li Guochao Zhang Jiayu Liu Lili Yan Yanchun
（Graduate School，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing100081）

With the prohibition of high-toxicity organophosphorous pesticides， the chlorpyrifos as their substitute has been used in a large-scale. The residue of chlorpyrifos， degrading slowly in the water， may cause the potential damages to aquatic organisms and others. To investigate the endocrine disrupting effects of low-concentration chlorpyrifos， flow cytometry was used to analyze the growth cycle of endometrial cancer cell HEC-1B of human. Moreover， zebrafish embryos were selected for chlorpyrifos exposing treatment 60 h at various concentrations of 0， 1.0， 2.0， 3.0 and 4.0 ppm. It was found that the chlorpyrifos caused the zebrafish embryos to death and significant embryonic malformation， the survival rate of the embryos was inversely proportional to chlorpyrifos’ concentration， and the malformation rate was proportional to chlorpyrifos’concentration. Further， the mRNA expression levels of 5 neurodevelopment maker genes in the chlorpyrifos-treated zebrafish embryos were detected. These results showed that chlorpyrifos of low-concentration acted as endocrine disruptor， and chlorpyrifos of high-concentration affected the normal development of nerve system.

chlorpyrifos；environmental and biological effects；zebrafish embryo；developmental neurotoxicity；endocrine disrupting effect

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.08.033

2014-12-09

國家自然科學(xué)基金項目（31170119），中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院基礎(chǔ)研究基金項目（0042014006，0042012003，0042011006）

余凱敏，男，碩士研究生，研究方向：微生物分子生物學(xué)與基因工程；E-mail：kmyu1989@gmail.com

閆艷春，女，博士，教授，研究方向：微生物分子生物學(xué)與基因工程；E-mail：yanyanchun@caas.cn