徐志霞，張穎，金顯敏，梁晨，李丹，金映虹

（海南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，海南海口571158）

高效石油降解菌株的篩選及菌群的構(gòu)建

徐志霞，張穎，金顯敏，梁晨，李丹，金映虹*

（海南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，海南?？?71158）

從海南澄邁油井周?chē)廴镜耐寥乐胁杉瘶悠?，以原油為唯一碳源，?jīng)初篩、復(fù)篩得到13株具降解石油性能的微生物，其中J-2、J-4、J-12、J-13菌株在培養(yǎng)10 d后，其石油降解率分別可達(dá)到27.92%、37.36%、30.98%和14.10%.選擇這4株菌進(jìn)行2株菌、3株菌、4株菌的混合培養(yǎng)，構(gòu)建了11個(gè)降解石油的微生物體系，研究發(fā)現(xiàn)J-2與J-4混合菌群降解效果最好，高達(dá)71.58%，明顯優(yōu)于其他的混合菌群體系和單菌株的降解效果.根據(jù)形態(tài)學(xué)觀(guān)察和生理生化特征對(duì)這4種菌株進(jìn)行鑒定，初步確定為粉紅頭孢霉屬（Cephaesosp），青霉屬（Penicillium），鏈霉菌屬（Streptomyces）和黃單胞菌屬（Xanthomonas）.

石油；高效降解；篩選；菌群構(gòu)建

石油是含有各種芳香烴、烷烴、環(huán)烷烴成分的一種復(fù)雜混合物，是古代海洋或湖泊的生物經(jīng)過(guò)漫長(zhǎng)的演化而形成的一種化石燃料［1-2］.目前，石油及其提煉品（汽油、煤油、柴油等）在人類(lèi)生產(chǎn)和生活中扮演著極其重要的角色，因此被人們稱(chēng)為“工業(yè)血液”［3］.當(dāng)今能夠替代石油的新型能源由于成本高等原因尚未能廣泛應(yīng)用，因此人們對(duì)石油的需求量仍然居高不下［4］.然而石油在開(kāi)采、運(yùn)輸、裝卸、加工和使用過(guò)程中，對(duì)環(huán)境造成嚴(yán)重污染，產(chǎn)生致癌物，污染土壤、地下水源、海洋環(huán)境等，危害人類(lèi)健康.傳統(tǒng)的石油污染治理方法主要為物理和化學(xué)方法，但其治理效果不佳，耗資巨大，并殘余大量有毒物質(zhì)于自然環(huán)境中，因此微生物修復(fù)技術(shù)（Bioremediation）以其經(jīng)濟(jì)、安全、效率高、適用范圍廣和無(wú)明顯的二次污染等顯著優(yōu)點(diǎn)［5］越來(lái)越引起人們的關(guān)注.

大多數(shù)未污染土壤的復(fù)雜微生物群落都含有天然降解石油的微生物，這種固有的特性使大多數(shù)土壤具有很大的石油降解能力［6］.大量的研究表明，在生物圈中，可以降解石油污染物的微生物超過(guò)100余屬，200多個(gè)種，分屬于霉菌、酵母菌、細(xì)菌、放線(xiàn)菌等［7］，其降解菌種類(lèi)十分豐富，具有菌種的多樣性.但是石油組成成分復(fù)雜，很難實(shí)現(xiàn)只靠一種微生物即可對(duì)其污染物實(shí)現(xiàn)完全降解.

本研究通過(guò)對(duì)石油污染土壤樣品進(jìn)行篩選，得到4株高效石油降解菌株，根據(jù)形態(tài)學(xué)觀(guān)察和生理生化特征初步鑒定為粉紅頭孢霉屬（Cephaesosp）、青霉屬（Penicillium）、鏈霉菌屬（Streptomyces）和黃單胞菌屬（Xanthomonas），并以此為基礎(chǔ)進(jìn)行石油降解微生物菌群的構(gòu)建及研究，進(jìn)一步提高降解效率，達(dá)到更高效降解石油的目的.

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)材料

原油及土樣均采自海南澄邁油井.

1.1.2培養(yǎng)基

原油培養(yǎng)基：NH4NO31.0g，K2HPO41.0g，KH2PO41.0g，MgSO4·7H2O 0.2g，CaCl20.02g，Na2EDTA·2H2O 0.02g，F(xiàn)eCl30.05g，蒸餾水1000 mL，pH7.4，分裝時(shí)每50 mL培養(yǎng)基加1 mL原油.固體平板培養(yǎng)需另外加入2%瓊脂.

1.2方法

1.2.1石油降解菌的富集培養(yǎng)和分離純化［8］

將5 g（干重）石油污染土壤接入45 mL原油培養(yǎng)基中，30℃，180 r/min恒溫?fù)u床上富集培養(yǎng)7 d.取培養(yǎng)液在原油平板培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線(xiàn)分離，同時(shí)取適量菌液進(jìn)行稀釋?zhuān)谠推桨迮囵B(yǎng)基上涂布分離，將培養(yǎng)皿置于30℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，定期觀(guān)察.另外，將富集培養(yǎng)液按10%的比例接入新鮮的原油培養(yǎng)基中，相同條件下進(jìn)行第二次富集培養(yǎng)，同樣操作進(jìn)行3次，每次的富集培養(yǎng)液都經(jīng)過(guò)劃線(xiàn)和平板稀釋分離.

3次富集培養(yǎng)之后，觀(guān)察平板上長(zhǎng)勢(shì)良好的優(yōu)勢(shì)菌株，選取形態(tài)特征一致的單菌落，并分別接種于相應(yīng)的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、查氏培養(yǎng)基、高氏Ⅰ號(hào)培養(yǎng)基、馬鈴薯培養(yǎng)基中，進(jìn)行多次劃線(xiàn)分離，純化得到單菌后斜面保存.

1.2.2高效石油降解菌的篩選

將分離純化得到的具有降解石油能力的13株菌株，分別接種至含50 mL原油培養(yǎng)基的三角瓶中，接種量為1 mL，以不接種的原油培養(yǎng)基作空白對(duì)照組，30℃，180 r/min振蕩培養(yǎng)10d.培養(yǎng)結(jié)束后采用重量法測(cè)定每株菌的石油降解率［9］.

降解率=（m3-m2）/m1×100%

m3為對(duì)照組的殘余油量，m2為降解后的殘余油量，m1為最初的含油量.

1.2.3高效石油降解體系的構(gòu)建

通過(guò)篩選得到4株高效石油降解菌，分別接種至含50 mL原油培養(yǎng)基的三角瓶中，30℃，180 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，制備一定濃度的菌懸液，接種于裝用原油培養(yǎng)基的三角瓶（裝液量50 mL/250 mL）中，每株菌接種量均為1 mL，30℃，180 r/min振蕩培養(yǎng)10d.培養(yǎng)結(jié)束后測(cè)定每個(gè)微生物降解體系的降解率，選出較佳的降解體系.

1.2.4高效石油降解菌的初步鑒定

根據(jù)菌株的形態(tài)特征和生理生化特征，參照伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)［10］、常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)［11］、常見(jiàn)真菌鑒定手冊(cè)［12］，對(duì)分離得到的石油降解菌進(jìn)行初步鑒定.

2　結(jié)果與分析

2.1石油降解菌的富集培養(yǎng)和分離純化

從海南省澄邁采集的石油污染土樣通過(guò)原油培養(yǎng)基的3次富集培養(yǎng)后，挑選生長(zhǎng)良好的優(yōu)勢(shì)菌株，分離純化得到具有較好石油降解能力的細(xì)菌8株，霉菌4株及放線(xiàn)菌1株，共計(jì)13株菌株.

2.2高效石油降解菌的篩選

將富集分離純化得到的13株菌株，并分別接種于原油培養(yǎng)基中培養(yǎng)，與未接菌的空白對(duì)照組進(jìn)行對(duì)比，觀(guān)察培養(yǎng)液的顏色、混濁程度及分層現(xiàn)象等變化.培養(yǎng)前，培養(yǎng)液上下層呈黑褐色和乳黃色.培養(yǎng)后，培養(yǎng)液出現(xiàn)三種情況：圖1-A，培養(yǎng)液分為3層，由上往下依次為殘余石油油膜、褐色絮狀物和淺褐色溶液；圖1-B，培養(yǎng)液顏色澄清透明，分散著明顯的真菌絲狀菌落，菌體中間呈深褐色；圖1-C，培養(yǎng)液無(wú)明顯變化.

圖1　石油降解菌培養(yǎng)液變化情況Fig.1Results of cultivated oil degrading bacteria

進(jìn)一步對(duì)13株菌進(jìn)行石油降解率的測(cè)定（見(jiàn)表1），其中J-2、J-4、J-12、J-13編號(hào)的菌株降解率較高，分別為27.92%、37.36%、30.98%、14.10%，挑選這4株菌株用以構(gòu)建降解菌群.

2.3石油降解菌的菌群構(gòu)建

將篩選獲得的具有高效降解石油性能的菌株J-2、J-4、J-12、J-13進(jìn)行不同的組合，分別2株菌、3株菌和4株菌混合，等比例接種培養(yǎng)，構(gòu)建不同的微生物降解菌群，并檢測(cè)其石油降解率，通過(guò)與單菌株的降解率比對(duì)，研究不同降解體系的降解效果（見(jiàn)表2）.

表1　單菌株石油降解率Tab.1Result of degradation rate of solo strain

表2　微生物降解體系的石油降解率Tab.2Result of degradation rate of different degradation systems

根據(jù)表2的降解率可初步判斷，不同菌株構(gòu)成的降解菌群相對(duì)于單菌株而言，降解率有的升高，有的降低，這可能是由于不同菌株之間的相互作用導(dǎo)致的.其中由菌株J-2和J-4的混合降解組降解效果較其他組高，在裝液量50 mL、石油濃度為2%的培養(yǎng)基中，10 d后其石油降解率可達(dá)到71.58%，較單菌株中降解效果最好的J-4的降解率提高近一倍.

2.4高效石油降解菌的初步鑒定

對(duì)J-2、J-4、J-12、J-13進(jìn)行鑒定，其菌落形態(tài)特征見(jiàn)表3，菌體形態(tài)見(jiàn)圖2，可初步判斷J-2、J-4為真菌，J-12為放線(xiàn)菌，J-13為細(xì)菌.其中，J-13的染色結(jié)果表明該菌為革蘭氏陰性細(xì)菌.

對(duì)J-12和J-13進(jìn)行了生理生化特征試驗(yàn)，其結(jié)果見(jiàn)表4.

根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，參照參照伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)［10］、常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)［11］、常見(jiàn)真菌鑒定手冊(cè)［12］，初步鑒定J-2為粉紅頭孢霉屬（Cephaesosp），J-4為青霉屬（Penicillium），J-12為鏈霉菌屬（Strepto?myces），J-13為黃單胞菌屬（Xanthomonas）.

3　結(jié)論

隨著國(guó)內(nèi)外經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，隨著原油的開(kāi)采量不斷上升，由此引起的土壤及海洋石油污染日益加劇. 20世紀(jì)80年代末，美國(guó)在短時(shí)間內(nèi)利用生物修復(fù)技術(shù)成功清除了油輪石油泄漏的污染物，開(kāi)啟了生物修復(fù)技術(shù)的研究，也引發(fā)石油污染微生物降解的討論［13］.

圖2　菌體形態(tài)（a），（b）J-2（×400）；（c）J-4（×400）；（d）J-12（×400）；（e）J-13（×1000）Fig.2Shapes of strain J-2、J-4、J-12、J-13

表3　石油降解菌的形態(tài)特征Tab.3Morphological characteristics of oil degrading strain

表4　J-12和J-13菌株生理生化結(jié)果Tab.4Results of physiological and biochemical characters with J-12 and J-13

在本研究中以海南澄邁油井附近被石油污染的土壤為樣品，利用石油為唯一碳源的培養(yǎng)基富集純化得到的13株菌，經(jīng)過(guò)篩選獲取降解效果較好的4株菌，分別為J-2、J-4、J-12、J-13，在裝液量50 mL、石油濃度為2%的培養(yǎng)基中，10d后其石油降解率可達(dá)到27.92%、37.36%、30.98%、14.10%.

由于石油成分復(fù)雜，依靠單一的微生物無(wú)法徹底完成石油的降解，需要通過(guò)具有不同降解功能的微生物共同作用，才可能實(shí)現(xiàn)石油污染物的完全降解［14］.本研究對(duì)篩選得到的4株菌進(jìn)行2株菌、3株菌、4株菌混合培養(yǎng)，構(gòu)建了11個(gè)降解石油的微生物體系，通過(guò)與單菌株降解率比較，發(fā)現(xiàn)J-2與J-4混合菌群降解效果最好，可將降解率提高至71.58%，明顯優(yōu)于其他的微生物體系的降解效果.

根據(jù)形態(tài)學(xué)觀(guān)察和生理生化特征對(duì)這4種菌株進(jìn)行鑒定，初步確定為粉紅頭孢霉屬（Cephaesosp），青霉屬（Penicillium），鏈霉菌屬（Streptomyces）和黃單胞菌屬（Xanthomonas）.本研究組將進(jìn)一步研究培養(yǎng)溫度、pH、鹽度、時(shí)間等對(duì)菌株降解能力的影響，通過(guò)改變不同菌株在微生物系統(tǒng)中的比例構(gòu)成，使微生物降解系統(tǒng)達(dá)到更好的降解效果.

［1］張光宇.SBR工藝污水處理廠(chǎng)抗石油污染物沖擊強(qiáng)化處理技術(shù)研究［D］.山東：青島理工大學(xué)，2010.

［2］陸昕.產(chǎn)表面活性劑石油降解菌的選育及對(duì)陜北石油污染土壤生物修復(fù)的試驗(yàn)研究［D］.陜西：西北大學(xué)，2010.

［3］林標(biāo)聲，陳雪英，江勝滔，等.土壤中高效石油降解菌的篩選及其降解特征的研究［J］.福建師范大學(xué)福清分校學(xué)報(bào)，2010，98（2）：11-16.

［4］張磊.中國(guó)石油安全分析與對(duì)策研究［D］.天津：天津大學(xué)，2007.

［5］邵宗澤，許曄，馬迎飛，等.2株海洋石油降解細(xì)菌的降解能力［J］.環(huán)境科學(xué)，2004，25（5）：133-137.

［6］阮志勇.石油降解菌株的篩選、鑒定及其石油降解特性的初步研究［D］.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2006.

［7］賈燕，伊華.石油降解菌株的篩選、初步鑒定及其特性研究［J］.暨南大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，28（3）：296-301.

［8］李超敏，王加寧，邱維忠，等.高效石油降解菌的分離鑒定及降解能力的研究［J］.生物技術(shù)，2007，17（4）：80-82.

［9］張鵬.石油降解菌的分離、鑒定及降解特性的研究［D］.山東：山東師范大學(xué)，2006.

［10］R.E.布坎南，N.E.吉本斯.伯杰.細(xì)菌鑒定手冊(cè)（第八版）［M］.北京：科學(xué)出版社，1984：1037-1161.

［11］東秀珠，蔡妙莫.常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)［M］.北京：科學(xué)出版社，2001：128-180.

［12］魏景超.真菌鑒定手冊(cè)［M］.上海：上?？萍汲霭嫔?，1979：132-135；491-495.

［13］劉曉春，閻光緒，郭紹輝，等.微生物降解土壤中石油污染物的研究進(jìn)展［J］.污染防治技術(shù)，2007，20（6）：51-54.

［14］李寶明，阮志勇，姜瑞波.石油降解菌的篩選、鑒定及菌群構(gòu)建［J］.中國(guó)土壤與肥料，2007（3）：68-72.

責(zé)任編輯：劉紅

Efficient Oil Degrading Bacteria Screening and Degradation Systems Construction

XU Zhixia，ZHANG Ying，JIN Xianmin，LIANG Chen，LI Dan，JIN Yinghong*
（College of Life Science，Hainan Normal University，Haikou 571158，China）

Four strains of high efficient oil degrading which could take used of petroleum as sole carbon source were isolat?ed from Hainan Chengmai，and marked as No.J-2，J-4，J-12 and J-13.After incubation for ten days，every strain's degra?dation rate of petroleum was 27.92%，37.36%，30.98%，and 14.10%respectively.In the further exploration of mixed cul?ture of two bacteria，three bacteria or four bacteria，11 microbial systems of degradation petroleum had been built.The re?sults showed that the degradation rate of system No.J-2 and J-4 could reach 71.58%，which had the most efficient degrad?ing than any other systems or single strains in this study.These strains were preliminary identified as Cephaesosp，Penicilli?um，Streptomyces and Xanthomonas by physiology and biochemistry research.

Petroleum；high efficient degradation；screening；degradation systems

Q 939.9

A

1674-4942（2015）04-0421-04

2015-09-19

2014年海南師范大學(xué)青年教師科研啟動(dòng)項(xiàng)目（QN1437）