張龍弟王雁偉張治國(guó)吳金霞

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京 100081；2.首都師范大學(xué)，北京 100048）

一個(gè)顯性卷葉突變體z2的遺傳分析與精細(xì)定位

張龍弟1王雁偉2張治國(guó)1吳金霞1

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京 100081；2.首都師范大學(xué)，北京 100048）

葉片的適度卷曲對(duì)水稻理想株型育種具有重要意義。在水稻T-DNA插入突變體庫(kù)中獲得一個(gè)葉片外卷突變體z2，突變體表型出現(xiàn)在分蘗期；與野生型相比，農(nóng)藝性狀無(wú)明顯差異，光合作用效率高于野生型。對(duì)突變體和野生型的石蠟切片研究表明，突變體葉片泡狀細(xì)胞數(shù)量（8-9個(gè)）明顯多于野生型（4-5個(gè)）。z2卷葉性狀遺傳穩(wěn)定，由一對(duì)顯性核基因控制。以z2純合突變體為母本，秈稻Dular為父本進(jìn)行雜交構(gòu)建F2代定位群體，利用圖位克隆的方法，將該基因初定位于水稻第2號(hào)染色體的InDel1812與InDel1870標(biāo)記之間，物理距離為580 kb。

水稻（Oryza sativa L.）；卷葉突變體；遺傳分析；圖位克隆

葉片是植物進(jìn)行光合作用最主要的營(yíng)養(yǎng)器官。葉形對(duì)水稻的產(chǎn)量、品質(zhì)等具有極大的影響，研究者在水稻理想株型的研究中就明確提出，微卷的葉片可以使葉片保持直立，相比于彎葉，直立的葉片有助于增加透光率，使植株整體的光合作用增強(qiáng)，從而提高光能利用率［1］。同時(shí)，適當(dāng)?shù)木砣~還可以降低葉片在干旱環(huán)境下的蒸騰作用，減少植株失水，增強(qiáng)植株的抗逆性，從而提高產(chǎn)量［2］。所以，在理想株型育種中，卷葉葉形越來(lái)越成為育種家們所關(guān)注的焦點(diǎn)［3］。水稻卷葉突變體則為水稻理想株型的研究和提高水稻產(chǎn)量提供了理想的實(shí)驗(yàn)材料。

到目前為止，已有多個(gè)卷葉基因被定位，其中6個(gè)基因（rl1-rl6）是通過(guò)傳統(tǒng)的遺傳分析手段，即形態(tài)學(xué)標(biāo)記，被定位在染色體上；有的基因如rl7-rl12是通過(guò)分子標(biāo)記被定位在染色體上。rl7、rl8定位于5號(hào)染色體［4］，rl9［5］、rl10［6］定位于9號(hào)染色體，rl11［7］定位于7號(hào)染色體，rl12［8］定位在10號(hào)染色體。此外，還有url（t）［9］、nrl2（t）［10］、nal3（t）［11］、acl1［12］等。就目前的研究報(bào)道，造成卷葉主要的原因是葉片細(xì)胞的變化，如泡狀細(xì)胞數(shù)量的變化、厚壁細(xì)胞增多或缺失等。sll1突變體葉片極度內(nèi)卷是由于SLL1基因功能缺失，導(dǎo)致遠(yuǎn)軸面葉肉細(xì)胞PCD過(guò)程紊亂，致使厚壁細(xì)胞缺失造成的［13］。Fang等［14］通過(guò)圖位克隆的方法定位了卷葉基因rl14，其編碼2OG-Fe（II）氧化酶，rl4突變體葉肉細(xì)胞次生細(xì)胞壁組分發(fā)生改變，從而影響到水分的運(yùn)輸，使得葉片失水，泡狀細(xì)胞異常，造成葉片內(nèi)卷。srl1突變體的正卷性狀是由于葉片近軸面泡狀細(xì)胞增多而造成的［15］。roc5的功能缺失會(huì)使葉片泡狀細(xì)胞增多且變大，造成葉片外卷，而在roc5過(guò)表達(dá)植株中，泡狀細(xì)胞則減少且變小，造成葉片內(nèi)卷，這說(shuō)明了roc5在泡狀細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中起重要的調(diào)控作用［16］。

本研究以水稻T-DNA插入突變體庫(kù)中所篩選到的顯性葉片內(nèi)卷突變體z2為基礎(chǔ)，通過(guò)初定位和精細(xì)定位，將基因定位在一個(gè)較小的范圍內(nèi)，旨在為克隆控制顯性卷葉z2基因奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

水稻葉片外卷突變體z2來(lái)自本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的水稻激活標(biāo)簽突變體庫(kù)［17］。經(jīng)過(guò)大田多代自交，卷葉性狀穩(wěn)定遺傳，后代無(wú)性狀分離。野生型為日本晴和雜交群體親本為秈稻Dular。

1.2 方法

1.2.1 表型鑒定和農(nóng)藝性狀 選取z2突變體與野生型種子各約40粒放入底部鋪有濾紙的玻璃培養(yǎng)皿，25℃加水萌發(fā)。待水稻露白后移至光照培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)條件：光照強(qiáng)度40 000 lx，光照周期14/10 h，溫度28/20℃，濕度70%。待芽長(zhǎng)約2-3 cm后移栽至溫室，觀察z2突變體與野生型各葉片葉形差異。后移栽至河北廊坊大田，掛牌標(biāo)記，觀察各葉葉長(zhǎng)、葉寬和卷曲程度。在水稻成熟后測(cè)量統(tǒng)計(jì)其農(nóng)藝性狀，如株高、分蘗數(shù)、有效分蘗數(shù)、穗長(zhǎng)、結(jié)實(shí)率、千粒重、劍葉長(zhǎng)、劍葉寬等。

1.2.2 z2突變體光合參數(shù)測(cè)定 使用光合測(cè)定儀LICOR LI-600分別對(duì)抽穗期的z2突變體與野生型進(jìn)行光合作用效率、蒸騰作用速率、二氧化碳?xì)饪讓?dǎo)度測(cè)定。

1.2.3 葉片石蠟切片觀察 在田間取抽穗期z2突變體與野生型葉片，立即放入Carnoy固定液（無(wú)水乙醇∶氯仿∶冰醋酸=6∶3∶1，現(xiàn)用現(xiàn)配）中，利用注射器抽真空使材料浸沒(méi)與固定液中，室溫放置12 h，進(jìn)行梯度濃度乙醇脫水和二甲苯透明，在浸蠟包埋后使用RM2155型切片機(jī)進(jìn)行切片，經(jīng)熔蠟、復(fù)水、染色和脫水后進(jìn)行封片，最后在ZESIS蔡司熒光顯微鏡下鏡檢、拍照。

1.2.4 遺傳分析和F2代定位群體構(gòu)建 以卷葉突變體z2與野生型進(jìn)行正反交組合，獲得F1代種子，后觀察F1代植株性狀并進(jìn)行自交獲得F2代種子。將F2種子種于大田，觀察F2代表型，統(tǒng)計(jì)性狀分離比，進(jìn)行遺傳分析。以z2純合突變體為母本，秈稻亞種Dular為父本進(jìn)行雜交，獲得F1代，F(xiàn)1代自交構(gòu)建F2代定位群體。

1.2.5 水稻基因組DNA提取和PCR擴(kuò)增體系 用于構(gòu)建混池的F2代正常表型水稻單株、野生型和Dular的DNA提取均采用改進(jìn)的CTAB法［18］。10 μL PCR擴(kuò)增體系：10×Buffer 1 μL，25 mmol/L MgCl20.5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 0.5 μL，20 pmol/L正、反向引物各1 μL，約20 nmol/L DNA模板1 μL，5 U/μL Taq DNA聚合酶0.1 μL，ddH2O 4.9 μL。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min，33個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 min。根據(jù)產(chǎn)物差異，選擇（1）進(jìn)行4%瓊脂糖凝膠電泳，185 V，15 min；（2）進(jìn)行10%聚丙烯凝膠電泳，200 V，120 min，后經(jīng)銀染觀察。

1.2.6 InDel分子標(biāo)記建立與基因定位 利用植物分子生物學(xué)網(wǎng)站Gramene（http：//www.gramene.org）上所公布的秈稻日本晴與粳稻9311全基因組進(jìn)行比對(duì)，挖掘秈稻與粳稻之間差異，一般相差10 bp以上，DNAMAN設(shè)計(jì)初定位引物。開(kāi)發(fā)的初定位引物共612條，對(duì)612條初定位引物進(jìn)行多態(tài)性分析，其中166條在日本晴與Dular之間具有多態(tài)性，平均分布在水稻的12條染色體上，平均約3 Mbp有一條初定位引物。以F2代正常表型的植株每5株組成一定位混池，共3個(gè)混池，以初定位引物對(duì)混池進(jìn)行PCR擴(kuò)增，確定連鎖關(guān)系。獲得連鎖后，擴(kuò)大群體，設(shè)計(jì)精細(xì)定位引物進(jìn)行精細(xì)定位。

1.2.7 遺傳作圖 將與Dular親本帶型一樣的記為I型帶，與日本晴親本帶型一樣的記為II型帶，具有雙帶的記為Ⅲ型帶。統(tǒng)計(jì)并分析帶型結(jié)果，利用MapMaker EXP 3.0［19］進(jìn)行數(shù)據(jù)分析計(jì)算遺傳距離，并繪制連鎖圖譜。

2 結(jié)果

2.1 z2突變體的表型分析

z2突變體在溫室生長(zhǎng)時(shí)期5葉期，移栽至廊坊大田后到分蘗期表型開(kāi)始出現(xiàn)，表現(xiàn)為葉片向遠(yuǎn)軸面卷曲，隨著植株生長(zhǎng)，全部葉片整體發(fā)生卷曲，葉片卷曲呈半桶狀。葉片卷曲度（LRIs）為65%左右，野生型卷曲度為0（圖1）。由于z2突變體的葉片外卷，其葉片的直立度（LEIs）高于野生型，其光合作用效率也相應(yīng)的有所提高（表1）。在農(nóng)藝性狀方面，經(jīng)過(guò)大田統(tǒng)計(jì)分析，相對(duì)于野生型，z2突變體在株高、分蘗數(shù)、穗長(zhǎng)、穗粒數(shù)、千粒重等方面均無(wú)顯著差異。

圖1 成熟期野生型與z2突變體表型比較

表1 野生型與z2突變體光合生理指標(biāo)比較

2.2 z2突變體細(xì)胞形態(tài)學(xué)分析

通過(guò)對(duì)野生型和z2突變體葉片進(jìn)行石蠟切片觀察發(fā)現(xiàn)，相比于野生型，z2突變體的葉片泡狀細(xì)胞明顯增多，達(dá)到7-8個(gè)，而野生型一般有4-5個(gè)，突變體泡狀細(xì)胞在葉片橫切面中的總面積也明顯大于野生型（圖2），所以z2突變體葉片外卷表型的出現(xiàn)是由于葉片泡狀細(xì)胞增多導(dǎo)致的。

2.3 z2突變體的遺傳分析

以z2突變體與野生型雜交獲得F1代種子，對(duì)F1代植株進(jìn)行大田觀察，發(fā)現(xiàn)全部F1代植株的葉片在分蘗期出現(xiàn)向進(jìn)軸面卷曲，表型與z2突變體相同。F1代植株自交產(chǎn)生F2代植株出現(xiàn)性狀分離，卷曲葉與非卷曲葉植株的分離比為3∶1，經(jīng)卡方檢測(cè)，實(shí)得數(shù)據(jù)與理論比例無(wú)明顯差異（表2），可以證明z2突變體是由一對(duì)顯性核基因控制。

2.4 z2基因的初定位與精細(xì)定位

使用612對(duì)初定位引物中日本晴與Dular之間具有多態(tài)性的166對(duì)引物對(duì)3個(gè)混池（z2/Dular F2代正常葉形5株一混池）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，進(jìn)行初定位，發(fā)現(xiàn)其中2個(gè)混池與2號(hào)染色體長(zhǎng)臂上的rm2-6和rm2-10完全連鎖。取30株野生型表型的F2代單株使用rm2-6和rm2-10標(biāo)記進(jìn)行連鎖分析，結(jié)果顯示rm2-6和rm2-10與z2突變位點(diǎn)連鎖，部分開(kāi)發(fā)的初定位引物與精細(xì)定位引物，見(jiàn)表3。

在rm2-6與rm2-10標(biāo)記之間設(shè)計(jì)InDel精細(xì)定位引物共29對(duì)，經(jīng)檢測(cè)其中16對(duì)在日本晴與Dular之間具有多態(tài)性，且能使用4%瓊脂糖凝膠電泳或10%聚丙烯凝膠電泳分辨開(kāi)。使用33個(gè)正常表型F2代交換單株將z2突變位點(diǎn)定位在InDel1599與InDel1918標(biāo)記之間，進(jìn)一步擴(kuò)大群體并開(kāi)發(fā)新的InDel標(biāo)記，使用519個(gè)正常表型F2代單株，最終將z2突變基因定位于InDel1870與InDel1812之間，其物理距離為580 kb（圖3）。

圖2 成熟期野生型與z2突變體葉片石蠟切片觀察

表2 F2代分離群體統(tǒng)計(jì)結(jié)果

圖3 z2突變基因在第2號(hào)染色體上的定位

表3 本研究開(kāi)發(fā)的多態(tài)性rm和InDel標(biāo)記

3 討論

葉片是水稻進(jìn)行光合作用最主要的場(chǎng)所，葉片的適度卷曲在水稻理想株型改良中具有重要的應(yīng)用意義。在已克隆的控制卷葉的基因中，大多數(shù)屬于單基因隱性遺傳，還有一些卷葉性狀是由數(shù)量性狀基因所控制的［20］，鮮有報(bào)道由顯性控制的卷葉基因。目前所報(bào)道的顯性卷葉基因主要有OsAGO7［21］和OsCLF1［22］。其中OsAGO7是利用T-DNA標(biāo)簽法分離到的，位于3號(hào)染色體，其編碼一個(gè)Argnaute（AGO）家族蛋白，其中包含PAZ和PIWI保守結(jié)構(gòu)域。AGO家族蛋白是RNA介導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RISC）的重要組成部分［23］，PAZ結(jié)構(gòu)域是與miRNA或siRNA結(jié)合的區(qū)域，而PIWI結(jié)構(gòu)域是負(fù)責(zé)剪切mRNA的區(qū)域［24］。在OsAGO7突變體中，有可能是由于ARF3或ARF4基因受到抑制而產(chǎn)生葉片內(nèi)卷的性狀［22］。OsCFL1也是通過(guò)T-DNA標(biāo)簽法分離得到的，其編碼一個(gè)具有WW結(jié)構(gòu)域的蛋白。在OsCFL1突變體植株中OsCFL1基因表達(dá)量約為野生型的30倍，突變體表現(xiàn)出葉片扭曲、內(nèi)卷的性狀。在水稻中過(guò)表達(dá)OsCFL1、在擬南芥中過(guò)表達(dá)OsCFL1的同源基因AtCFL1和AtCFL2，結(jié)果顯示無(wú)論是水稻葉片還是擬南芥葉片其角質(zhì)層都出現(xiàn)發(fā)育異常，而降低AtCFL1的表達(dá)則會(huì)使擬南芥葉片的角質(zhì)層增厚。通過(guò)點(diǎn)對(duì)點(diǎn)酵母雙雜交驗(yàn)證AtCFL1與AtHDG1互作，抑制AtHDG1的表達(dá)會(huì)使野生型擬南芥角質(zhì)層受損，而在AtCFL1突變體中角質(zhì)層的受損程度降低。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)在AtCFL1過(guò)表達(dá)和AtHDG1共抑制植株中BDG與FDH基因的表達(dá)量下降，而B(niǎo)DG與FDH在擬南芥中是與角質(zhì)層發(fā)育相關(guān)的，并且BDG與FDH的調(diào)控區(qū)含有能與AtHDG1結(jié)合的順式作用元件L1。這就說(shuō)明了造成水稻卷葉的原因是CFL1通過(guò)HDG1負(fù)調(diào)控BDG與FDH，從而導(dǎo)致表皮角質(zhì)層的缺損［23］。在z2卷葉突變基因精細(xì)定位的區(qū)間內(nèi)發(fā)現(xiàn)含有CFL1基因，但經(jīng)過(guò)測(cè)序未發(fā)現(xiàn)在CFL1的讀碼框和上下游調(diào)控序列中有突變位點(diǎn)存在，因此我們認(rèn)為定位z2基因可能是一個(gè)新的位點(diǎn)。

圖4 z2突變位點(diǎn)與InDel1812和InDel1870分子標(biāo)記連鎖分析

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)z2卷葉突變體進(jìn)行了表型分析，其葉片外卷表型出現(xiàn)在分蘗期，突變體的直立度高于野生型，并且其光合作用效率也有所提高，通過(guò)石蠟切片發(fā)現(xiàn)z2突變體葉片泡狀細(xì)胞明顯增多。遺傳分析表明，z2突變體卷葉表型由一對(duì)顯性核基因控制。利用圖位克隆的方法將z2顯性卷葉突變基因定位于分子標(biāo)記InDel1870與InDel1812之間，物理距離為580 kb。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Genetic Analysis and Gene Mapping of a Dominant Rolled Leaf Mutant z2 in Rice

Zhang Longdi1Wang Yanwei2Zhang Zhiguo1Wu Jinxia1
（1. Biotechnology Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Science，Beijing 100081；2. Capital Normal University，Beijing 100048）

Moderate rolled leaf is significant in ideotype breeding of rice. An outward rolled leaf mutant z2 was discovered from the rice T-DNA insertion mutant library， and its leaves became curly during tillering stage. Compared with the wild type， there was no significant difference in its main agronomic traits， and its photosynthetic was more efficient. Paraffin sections showed that the number of bulliform cells（8-9）in the mutant was higher than that in the wild type（4-5）. Through successive selfing， phenotype of z2 was stable and was controlled by a pair of dominant nuclear genes. We made the combination of z2/Dular to establish F2 mapping population， and used map-based cloning method to locate the gene on rice chromosome 2 between maker InDel1812 and InDel1870 with 580 kb physical distance.

rice（Oryza sativa L.）；rolled leaf mutant；genetic analysis；map-based cloning

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.06.014

2015-02-04

中國(guó)、巴西作物生物技術(shù)與種質(zhì)資源聯(lián)合研究項(xiàng)目（2014DFA31550）

張龍弟，男，碩士研究生，研究方向：植物分子生物學(xué)與基因工程；E-mail：zld2011@126.com

吳金霞，女，副研究員，研究方向：植物功能基因組學(xué)；E-mail：wujinxia@caas.cn