嗜酸喜溫硫桿菌硫加氧還原酶基因的克隆、表達(dá)及酶活性研究

李凌凌 呂早生 左振宇 李堯益

（武漢科技大學(xué)化學(xué)工程與技術(shù)學(xué)院，武漢 430081）

嗜酸喜溫硫桿菌硫加氧還原酶基因的克隆、表達(dá)及酶活性研究

李凌凌 呂早生 左振宇 李堯益

（武漢科技大學(xué)化學(xué)工程與技術(shù)學(xué)院，武漢 430081）

旨為研究嗜酸喜溫硫桿菌硫加氧還原酶的生化特性，以嗜酸喜溫硫桿菌TST3的基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增出硫加氧還原酶基因（sor），構(gòu)建了表達(dá)載體pET-sor，轉(zhuǎn)化到Escherichia coli BL21（DE3）后，獲得了重組菌株E.coli BL21（pET-sor2）。SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)證明，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，該重組菌可以表達(dá)目的蛋白SOR。對(duì)誘導(dǎo)條件進(jìn)行優(yōu)化，并在最優(yōu)的條件下誘導(dǎo)SOR酶表達(dá)，再經(jīng)超聲波破碎重組菌，上清液通過Ni+-NTA親和層析柱純化獲得重組酶，其催化氧化反應(yīng)的比酶活、Km值和Vmax分別為0.70 U/mg，15.672×10-2g/mL和12.755×10-5mol/ （L·min），而催化的還原反應(yīng)的比酶活、Km值和Vmax分別為2.21 U/mg，0.507×10-2g/mL和4.876×10-5mol/ （L·min）。

生物浸礦；嗜酸喜溫硫桿菌；硫加氧還原酶；酶活

微生物氧化還原態(tài)無機(jī)硫化物和元素硫生成硫酸是自然界硫循環(huán)過程中的一個(gè)重要的反應(yīng)。此反應(yīng)能為微生物的生長(zhǎng)提供能量［1］。已知在微生物中，主要存在兩種硫氧化系統(tǒng)：第一種硫氧化系統(tǒng)——Sox系統(tǒng)，以化能自養(yǎng)型細(xì)菌Paracoccus pantotrophus為主要代表菌，該系統(tǒng)位于周質(zhì)，由4種蛋白質(zhì)SoxYZ、SoxAX、SoxB和Sox（CD）2組成，負(fù)責(zé)催化硫化物、元素硫、硫代硫酸鹽及亞硫酸鹽的氧化生成硫酸，此過程中伴隨著電子轉(zhuǎn)移到細(xì)胞色素c［2］。第二種硫氧化系統(tǒng)依賴于硫加氧還原酶（Sulfur oxygenase reductase，SOR），可催化元素硫的氧化和歧化反應(yīng)，產(chǎn)生亞硫酸鹽、硫代硫酸鹽及硫化物［1-4］，反應(yīng)過程中無需提供額外的輔酶和電子載體，反應(yīng)如下：

加氧酶：S0+O2+H2O→HSO3-+H+

歧化反應(yīng)：3S0+3H2O→2H2S+ HSO3-+H+

總反應(yīng)式：4S0+ O2+4H2O→2H2S+2HSO3-+2H+

此反應(yīng)體系中，亞硫酸鹽和過量的元素硫會(huì)經(jīng)非酶促反應(yīng)迅速形成硫代硫酸鹽：

S0+ HSO3-→ S2O32-+H+

目前的研究表明，SOR或sor基因在自然界中并非廣泛存在，主要存在于一些嗜熱嗜酸古菌和嗜超高溫細(xì)菌中。另外，一些嗜中溫細(xì)菌中也存在sor基因，如嗜酸硫桿菌。嗜酸喜溫硫桿菌（Acidithiobacillus caldus，A. caldus）是一種專性化能自養(yǎng)型嗜中溫嗜酸性革蘭氏陰性菌。它與嗜酸氧化亞鐵硫桿菌、嗜酸氧化硫硫桿菌共同存在于浸礦的生態(tài)龕位，并廣泛應(yīng)用于生物冶金。嗜酸喜溫硫桿菌能夠氧化元素硫和各種還原態(tài)無機(jī)硫化物（Reduced inorganic sulfur compounds，RISCs）生成硫酸而釋放出H+，從而使礦物溶解浸出?？紤]到嗜酸喜溫硫桿菌中RISCs的代謝與最終礦物的浸出有著直接的相關(guān)性，因此，研究此菌氧化RISCs的機(jī)理具有重大理論意義和實(shí)踐價(jià)值。已知，嗜酸喜溫硫桿菌的硫氧化系統(tǒng)分為3個(gè)亞類——縮短型Sox硫氧化亞系統(tǒng)、非Sox硫氧化亞系統(tǒng)和SOR亞系統(tǒng)［2］。其中，SOR亞系統(tǒng)在細(xì)胞質(zhì)的硫氧化過程中起著重要的作用，其關(guān)鍵酶——硫加氧還原酶能夠氧化細(xì)胞質(zhì)中無論是胞外轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入的還是由其他途徑代謝生成的單質(zhì)硫，由此與另兩種硫氧化亞系統(tǒng)關(guān)聯(lián)到一起，共同完成RISCs的氧化。研究該菌中的硫加氧還原酶的生化特性對(duì)于理解該菌如何代謝RISCs至關(guān)重要，但是目前關(guān)于這方面的報(bào)道很少。本研究克隆嗜酸喜溫硫桿菌的硫加氧還原酶基因sor，在大腸桿菌中大量表達(dá)，并以Ni-NTA親和層析柱純化出重組蛋白SOR，研究其酶活性，旨在為研究嗜酸喜溫硫桿菌SOR亞系統(tǒng)中的硫加氧還原酶的生化特性提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種和質(zhì)粒 嗜酸喜溫硫桿菌TST3為本實(shí)驗(yàn)室從湖北大冶銅山口礦區(qū)酸性排污口附近的土壤中分離純化、鑒定且保藏；大腸桿菌表達(dá)載體pET-28a由安徽大學(xué)張部昌教授惠贈(zèng)。

1.1.2 培養(yǎng)基 Waksman培養(yǎng)基用于培養(yǎng)嗜酸喜溫硫桿菌［5］；LB培養(yǎng)基用于培養(yǎng)大腸桿菌，篩選抗性菌株時(shí)，加入終濃度為100 μg/mL的卡那霉素［6］。

1.1.3 酶和化學(xué)試劑 DNA Marker、loading buffer、dNTP mixture、pfu DNA聚合酶、溶菌酶溶液、蛋白酶K溶液、RNaseA溶液、大腸桿菌DH5α和BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞及質(zhì)粒小提中量試劑盒為天根生化科技（北京）有限公司產(chǎn)品；限制性核酸內(nèi)切酶Nde I、高保真內(nèi)切酶EcoR I-HF及Protein Marker為New England Biolabs（NEB）公司產(chǎn)品；Micro BCATMProtein Assay Kit由Thermo Pierce公司提供；QIAquick Gel Extraction Kit為Qiagen公司產(chǎn)品；T4 DNA連接酶、IPTG為TaKaRa公司產(chǎn)品；引物合成和測(cè)序工作由北京奧科鼎盛生物科技有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 引物的設(shè)計(jì)及硫加氧還原酶基因的克隆 根據(jù)GenBank中 登 錄 號(hào) 為NZ_ACVD010000-78的A.caldus ATCC 51756鳥槍法測(cè)序全基因組序列片段02162006.asm.C78中37 049-37 984 bp的sor基因，設(shè)計(jì)合成引物。為便于克隆，在正向引物和反向引物前分別加上NdeⅠ和EcoRⅠ酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)的上下游擴(kuò)增引物分別為：引物sor-1：5'-GCCATATGGACAAAAATCCTATCGTC-3'（正向引物，下劃線為NdeⅠ酶切位點(diǎn)，前面GC為保護(hù)性堿基）；引物sor-2：5'-GGAATTCTCAGAGCACAAGTTTGCGCC-3'（反向引物，下劃線為EcoRⅠ酶切位點(diǎn)，前面G為保護(hù)性堿基）。從嗜酸喜溫硫桿菌TST3中提取基因組DNA［7］，并以其為模板，利用上述的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。采用的PCR擴(kuò)增體系如下：嗜酸喜溫硫桿菌TST3的基因組DNA 2 μL，dNTP（2.5 mmol/L）5 μL，10×pfu DNA聚合酶緩沖液5 μL，引物sor-1（2.5 μmmol/L）10 μL，引物sor-2（2.5 μmmol/L）10 μL，pfu DNA聚合酶0.5 μL，最后補(bǔ)無菌水至50 μL。PCR擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性45 s，63℃退火1 min，72℃延伸90 s，共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。

1.2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及目標(biāo)序列分析 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物及載體pET-28a分別采用NdeⅠ和EcoRⅠ雙酶切，回收目的片段并連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-sor，并采用氯化鈣轉(zhuǎn)化法將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coli DH5α。提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切來驗(yàn)證陽性克隆并測(cè)序，通過NCBI數(shù)據(jù)庫提供的BlastN和BlastP功能分別對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行核苷酸序列及氨基酸序列對(duì)比分析。針對(duì)嗜酸喜溫硫桿菌SOR氨基酸序列和NCBI數(shù)據(jù)庫中查詢得到的各種微生物的SOR同源類似物序列，利用Clustal Omega（http：//www.ebi.ac.uk/Tools/msa/ clustalo/，由EMBL數(shù)據(jù)庫提供）和Mega 5.05軟件進(jìn)行各序列間的同源性和進(jìn)化距離的分析與比較，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹［8］。

1.2.3 SOR酶在大腸桿菌BL21（DE3）中的誘導(dǎo)表達(dá) 將測(cè)序正確的pET-sor重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21（DE3）中。挑取若干單菌落，接種至含100 μg/mL卡那霉素的10 mL LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜后，按1%的接種量接入到100 mL含100 μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基（250 mL錐形瓶）中，37℃培養(yǎng)大約3 h（OD600約為0.8）后，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)酶的表達(dá)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h［9］，離心（8 000 r/min，4℃，10 min）收集菌體，超聲波破碎后，離心取上清進(jìn)行SDS-PAGE電泳，分析蛋白質(zhì)的分子量和存在性質(zhì)，采用的分離膠濃度為10%，使用考馬斯亮藍(lán)R-250進(jìn)行染色。利用BandScan 5.0軟件分析目標(biāo)蛋白的SDS-PAGE掃描圖片，以了解重組菌株中目標(biāo)蛋白質(zhì)的表達(dá)量占全菌可溶性蛋白質(zhì)的百分比。

1.2.4 SOR蛋白質(zhì)的純化方法 離心（8 000 r/min，4℃，10 min）收集經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的E. coli BL21（pET-sor2）菌體，用1×PBS緩沖液（pH 7.4）洗滌3次后，再重懸，在冰水浴中進(jìn)行超聲波破碎（400 W下工作2 s，間歇3 s，共破碎30 min），離心（13 000 r/min，4℃，10 min），收集上清，即得SOR粗酶液。取粗酶液上樣于經(jīng)1×PBS緩沖液預(yù)平衡的Ni+-NTA柱，先用1×PBS緩沖液清洗，再用含20 mmol/L咪唑的1×PBS緩沖液洗脫，最后用含80 mmol/L咪唑的1×PBS緩沖液洗脫，并收集各步驟液體。

1.2.5 SOR酶活力的測(cè)定 硫粉（2%）加入到含有0.005% 吐溫20的70 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH 7.2）中，用最大功率的超聲波處理10 min，粉碎硫粉。取1 mL處理后的硫粉液，加入100 μL的SOR粗酶液或純化后的酶液（陰性對(duì)照加入的是1 mL的pET-28a裂解液上清）。在80℃條件下反應(yīng)10 min后［1］，分別測(cè)定反應(yīng)液上清中的亞硫酸鹽、硫代硫酸鹽［10］及S2-濃度［11］。酶活單位定義為每分鐘形成亞硫酸鹽和硫代硫酸鹽（SOR催化的氧化反應(yīng)）或硫化氫（SOR催化的還原反應(yīng)）的微摩爾數(shù)［4］。而比酶活為每毫克蛋白形成的亞硫酸鹽和硫代硫酸鹽的量或每毫克蛋白質(zhì)形成的硫化氫量［10］。蛋白質(zhì)含量的測(cè)定采用BCA法，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品。

SOR酶的Km和Vmax值的測(cè)定方法：取2-5 μg純化的酶，分別溫育于1 mL的含有0.4%、0.8%、1.2%、1.6%及2% 硫處理液（含有0.1%吐溫20）的70 mmol/L Tris-HCl（pH 7.2）中。在65℃條件下反應(yīng)0、2、4、6、8及10 min后，測(cè)亞硫酸鹽，硫代硫酸鹽和硫化物的量（假設(shè)亞硫酸鹽和硫化物是反應(yīng)的唯一產(chǎn)物，而硫代硫酸鹽來自硫和亞硫酸鹽的非酶促反應(yīng)）。反應(yīng)速率V從產(chǎn)物濃度的線性增長(zhǎng)中獲得，再根據(jù)Linewaver-Burk作圖法，以1/V對(duì)1/［S］作圖，得到一條直線，直線在橫軸上的截距為-1/Km，縱截距為1/Vmax，從而求出Km與Vmax。

2 結(jié)果

2.1 pET-sor重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

以嗜酸喜溫硫桿菌TST3的基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增出嗜酸喜溫硫桿菌硫加氧還原酶的基因片段sor，PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.0%的瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果（圖1）顯示，PCR產(chǎn)物位于750 bp和1 000 bp之間，與目標(biāo)基因的序列長(zhǎng)度936 bp吻合。將該片段克隆到pET-28a載體上，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET-sor。對(duì)該質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定（圖2），證實(shí)了質(zhì)粒pET-sor已克隆了目標(biāo)片段的重組質(zhì)粒。

將重組質(zhì)粒pET-sor送交測(cè)序，獲得了一段長(zhǎng)1 135 bp的核苷酸序列，利用NCBI數(shù)據(jù)庫中的Vecscreen功能將其中pET-28a載體中的序列片段去除后，得到了長(zhǎng)度為936 bp的嗜酸喜溫硫桿菌TST3的sor基因序列，將此序列提交到GenBank，登錄號(hào)為KJ958902。利用NCBI上提供的核苷酸比對(duì)功能（BlastN），對(duì)重組質(zhì)粒的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行序列分析，得出重組質(zhì)?？寺〉幕蚱闻c登錄號(hào)為 NZ_ACVD01000078的 A. caldus ATCC 51756鳥槍法測(cè)序全基因組的序列片段02162006.asm.C78中的37 049 bp至37 984 bp的sor基因序列之間的相似度為97%，兩者的堿基序列有28處不同，而相應(yīng)的嗜酸喜溫硫桿菌TST3的SOR（簡(jiǎn)稱AcSOR）氨基酸序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中登錄號(hào)AIA55075.1的嗜酸喜溫硫桿菌ATCC 51756硫加氧還原酶蛋白質(zhì)序列的相似度達(dá)到97%，兩者之間有9處不同（圖3中下標(biāo)線標(biāo)出），其中除了S→P的突變外，其余的突變都是理化性質(zhì)基本相同的氨基酸殘基，如S→T、T→S、I→M、V→I、K→R及Q→E。已知，硫加氧還原酶的活性中心由3個(gè)保守半胱氨酸（V-G-P-K-V-C和C -X-X-C，其中X代表各種不同的氨基酸，圖3中*號(hào)標(biāo)出）和一個(gè)Fe結(jié)合位點(diǎn)（H-X3-H -X23-E，其中X代表各種不同的氨基酸，圖3中Δ號(hào)標(biāo)出）組成［1］。而AcSOR中的氨基酸突變均未發(fā)生在活性中心中。另外，對(duì)比各種微生物中的SOR氨基酸序列發(fā)現(xiàn)，這些突變位點(diǎn)并不保守，通常變化較大，且其他微生物的氨基酸序列中也出現(xiàn)過這些突變的氨基酸［3］，推測(cè)這些氨基酸突變對(duì)酶的催化活性不會(huì)產(chǎn)生較大的影響。

圖1 硫加氧還原酶基因PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖

圖2 pET-sor質(zhì)粒的雙酶切產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖

根據(jù)AcSOR的氨基酸序列比對(duì)（BlastP）結(jié)果，在GenBank數(shù)據(jù)庫中找出與AcSOR序列一致性高于40%的蛋白質(zhì)序列，進(jìn)行多重序列比對(duì)，再利用Mega 5.05軟件構(gòu)建進(jìn)化樹（圖4），嗜酸喜溫硫桿菌TST3與A.caldus ATCC 51756處于系統(tǒng)發(fā)育樹中的同一分支，一致性可達(dá)97%。

2.2 SDS-PAGE檢測(cè)目標(biāo)蛋白的表達(dá)

表達(dá)載體pET-sor轉(zhuǎn)化到E.coli BL21（DE3）后，獲得了8個(gè)E.coli BL21（pET-sor）重組菌株。以E. coli BL21（pET-28a）菌株為陰性對(duì)照，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，進(jìn)行SDS-PAGE分析。結(jié)果（圖5）顯示，與陰性對(duì)照相比，8個(gè)E.coli BL21（pET-sor）重組菌，均在相對(duì)分子量40 kD和35 kD之間，有明顯的SOR蛋白表達(dá)條帶，與目標(biāo)蛋白SOR的相對(duì)分子量約為36 kD一致（包括了pET-28a載體表達(dá)的His-tag片段）。而且，利用BandScan 5.0軟件分析目標(biāo)蛋白的SDS-PAGE掃描圖片，可知，在8個(gè)E.coli BL21（pET-sor）重組菌中，E.coli BL21（pET-sor2）的表達(dá)量最大（圖5中的孔道2），其目標(biāo)蛋白質(zhì)的表達(dá)量占全菌可溶性蛋白質(zhì)的69.8%。另外，SDSPAGE分析經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后的E.coli BL21（pET-sor2）重組菌株中的上清液、周質(zhì)蛋白以及超聲波破碎獲得的胞內(nèi)蛋白，結(jié)果顯示目標(biāo)蛋白分布于胞內(nèi)，而且主要以包涵體形式存在。

2.3 硫加氧還原酶的誘導(dǎo)條件的優(yōu)化

對(duì)比不同的誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時(shí)間及IPTG濃度的條件下的硫加氧還原酶的比酶活，獲得E.coli BL21（pET-sor2）重組菌的最佳誘導(dǎo)條件。

圖3 pET-sor重組質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果的氨基酸序列比對(duì)分析結(jié)果

圖4 根據(jù)SOR氨基酸序列同源性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3.1 誘導(dǎo)溫度的優(yōu)化 在接種后3 h的菌液中加入1 mmol/L的IPTG后，分別置于16、20、25、30和37℃下進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)時(shí)長(zhǎng)為4 h。結(jié)果（圖6）顯示，比起較低的誘導(dǎo)溫度，在較高溫度下（如30和37℃）誘導(dǎo)表達(dá)的SOR催化氧化反應(yīng)的比酶活相對(duì)較高，而催化還原反應(yīng)的比酶活則相對(duì)較低。另外，由于低溫下誘導(dǎo)酶的表達(dá)有助于酶的正確折疊［12］，于是觀察到16-25℃下誘導(dǎo)表達(dá)生成包涵體的量相對(duì)于30-37℃較低。根據(jù)兩種反應(yīng)的最適誘導(dǎo)溫度和包涵體的生成量，選擇25℃作為最適的誘導(dǎo)溫度。

2.3.2 誘導(dǎo)時(shí)間的優(yōu)化 接種3 h后，加入1 mmol/L的IPTG，置于25℃分別誘導(dǎo)2、3、4、5、6、7及8 h（圖7），誘導(dǎo)6 h表達(dá)的SOR催化氧化反應(yīng)的比酶活最優(yōu)，而誘導(dǎo)4 h表達(dá)的酶催化還原反應(yīng)的比酶活最優(yōu)。結(jié)合兩者，確定較好的誘導(dǎo)時(shí)間為4 h。

圖5 E.coli BL21（pET-sor）重組菌株的SDS-PAGE圖（全菌可溶性蛋白）

圖6 誘導(dǎo)溫度的優(yōu)化

圖7 誘導(dǎo)時(shí)間的優(yōu)化

2.3.3 IPTG濃度的優(yōu)化 接種3 h后，分別加入0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0及1.2 mmol/L 的IPTG，置于25℃誘導(dǎo)4 h。圖8顯示，在加入0.6 mmol/L 的IPTG的條件下，SOR催化氧化反應(yīng)的比酶活相對(duì)最好，而加入0.4 mmol/L 的IPTG時(shí)，SOR催化還原反應(yīng)的比酶活相對(duì)最好。由此確定最適的IPTG濃度為0.4 mmol/L。

圖8 IPTG誘導(dǎo)濃度的優(yōu)化

綜上所述，由以上的單因子實(shí)驗(yàn)可以得出，重組Sor酶優(yōu)化的誘導(dǎo)條件為：加入0.4 mmol/L的IPTG后，在25℃的溫度下誘導(dǎo)4 h。

2.4 硫加氧還原酶的分離純化及酶活研究

在優(yōu)化的條件下誘導(dǎo)E.coli BL21（pET-sor2）中硫加氧還原酶的表達(dá)。取經(jīng)超聲波破碎此重組菌獲得的粗酶液，與1×PBS緩沖液預(yù)平衡的鎳柱結(jié)合，目的蛋白吸附到鎳柱上。之后分別用0、20 和80 mmol/L咪唑的1×PBS緩沖液進(jìn)行洗脫，層析過程如圖9所示，經(jīng)1×PBS緩沖液洗下來的峰為雜蛋白，而目標(biāo)蛋白SOR是經(jīng)20 mmol/L的1×PBS緩沖液洗脫下來。洗脫下來的純化酶液和純化前的粗酶液分別進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，結(jié)果（圖10）表明，純化前的條帶很多，而純化后幾乎所有的雜蛋白都消失了，說明純化的效果較好。

根據(jù)純化前后的SOR與硫粉反應(yīng)后的溶液中S2-離子、SO32-離子和S2O32-離子的濃度以及蛋白濃度，算出純化前粗酶液及純化后的SOR蛋白進(jìn)行氧化反應(yīng)、還原反應(yīng)的酶活及比酶活，結(jié)果見表1，純化前的SOR粗酶液（100 μL）催化氧化反應(yīng)的酶活為8.00 mU，催化還原反應(yīng)的酶活為23.14 mU，而作為陰性對(duì)照的E.coli BL21（pET28a），經(jīng)超聲波破碎后獲得的粗酶液（1 mL），催化氧化反應(yīng)和還原反應(yīng)的酶活僅為0.93 mU和0.98 mU。含3.10 mg蛋白質(zhì)總量的經(jīng)超聲破碎后的重組菌上清液，經(jīng)鎳柱純化后，獲得含667.35 μg蛋白質(zhì)總量的SOR酶。純化后的SOR酶，催化氧化反應(yīng)的酶活為3.12 mU，而催化還原反應(yīng)的酶活為9.83 mU。另外，純化前后的SOR酶催化氧化反應(yīng)的比酶活分別為257.72 mU/mg和0.70 U/mg，而催化還原反應(yīng)的比酶活分別為745.47 mU/mg和2.21 U/mg。

圖9 SOR酶的Ni-NTA純化層析圖譜

圖10 SOR純化前后的SDS-PAGE圖譜

表1 SOR酶液的活性

另外，研究SOR酶的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)常數(shù)Km和Vmax時(shí)，考慮到硫代硫酸鹽是非酶促反應(yīng)的產(chǎn)物，所以以亞硫酸鹽的量隨著反應(yīng)時(shí)間的變化繪制氧化反應(yīng)曲線，以硫化物的量隨著反應(yīng)時(shí)間的變化繪制還原反應(yīng)曲線。再根據(jù)氧化反應(yīng)曲線和還原反應(yīng)曲線中線性部分的斜率，分別計(jì)算在不同的底物濃度下氧化反應(yīng)和還原反應(yīng)的初始反應(yīng)速率V，以1/V對(duì)1/［S］作圖，得到兩條直線。其中，氧化反應(yīng)的1/V與初始底物濃度的倒數(shù)1/［S］的關(guān)系為y=1.228 7x+0.078 4（R2=0.976 5），而還原反應(yīng)的1/V與1/［S］的關(guān)系為y=1.039 7x+2.050 9（R2=0.971 6）。根據(jù)這些直線的橫截距和縱截距，可以計(jì)算得到氧化反應(yīng)的Km和Vmax分別為15.672×10-2g/mL和12.755×10-5mol/（L·min），而還原反應(yīng)的Km和Vmax分別為0.507×10-2g/mL和4.876×10-5mol/（L·min）。

3 討論

硫加氧還原酶依賴于氧氣、催化元素硫的氧化和歧化反應(yīng)，生成亞硫酸鹽、硫代硫酸鹽和硫化氫。普遍認(rèn)為，SOR或sor基因主要存在于嗜熱嗜酸古菌和嗜超高溫（或高溫）型細(xì)菌。天然SOR酶最早從化能自養(yǎng)型嗜熱嗜酸型古菌Acidianus brierleyi（其SOR酶簡(jiǎn)稱AbSOR）、Acidianus ambivalens（其SOR酶簡(jiǎn)稱AaSOR）和Acidianus tengchongensis（其SOR酶簡(jiǎn)稱AtSOR）中被分離純化出來［10，13-16］。例如，2000年，He等［14］報(bào)道Acidianus tengchongensis S5細(xì)胞裂解液中的AtSOR催化氧化反應(yīng)和還原反應(yīng)的比酶活分別為28.6 U/mg和3.1 U/mg。2004年，Urich等［15］發(fā)現(xiàn)直接從Acidianus ambivalens純化獲得的AaSOR酶催化氧化反應(yīng)和還原反應(yīng)的比酶活分別為2.96 U/mg和0.6 U/mg。后來，陸續(xù)有關(guān)于異源表達(dá)AaSOR和AtSOR的報(bào)道［3，14，15，17］。2004年，Urich等［15］發(fā)現(xiàn)異源表達(dá)AaSOR的大腸桿菌粗酶液催化氧化反應(yīng)和還原反應(yīng)的比酶活分別為464 mU/mg和145 mU/mg，而經(jīng)純化后的重組AaSOR酶的比酶活可以分別達(dá)到2.82 U/mg和0.66 U/mg。2011年，Veith等［3］發(fā)現(xiàn)從異源表達(dá)AaSOR的大腸桿菌中分離純化獲得的重組AaSOR催化氧化反應(yīng)和還原反應(yīng)的比酶活分別為3.03 U/mg和1.69 U/mg。此外，在其他的一些古菌，如泉古菌門的Sulfolobus tokodaii和廣古菌門的Ferroplasma acidarmanus、Picrophilus torridus，以及嗜超高溫細(xì)菌Aquifex aeolicus中也都檢測(cè)到sor基因的存在［18］，并且相繼有些報(bào)道完成了這些古菌中sor基因的異源表達(dá)。如2008年，Pelletier等［19］發(fā)現(xiàn)從嗜超高溫菌Aquifex aeolicus中分離純化得到的SOR催化還原反應(yīng)的比酶活為5 U/mg，而該SOR酶在大腸桿菌中異源表達(dá)的重組酶催化氧化反應(yīng)和歧化反應(yīng)的比酶活分別為78.8 U/mg和3.05 U/mg。另外，發(fā)現(xiàn)sor基因存在于許多嗜中溫細(xì)菌和中等嗜熱菌中，如Halothiobacillus neapolitanus、Sulfobacillus acidophilus及Acidithiobacillus species等，顯示SOR并非局限存在于極端嗜超高溫細(xì)菌中［4，20］。例如，在重組大腸桿菌中異源表達(dá)的嗜中溫菌Halothiobacillus neapolitanus的SOR（簡(jiǎn)稱HnSOR）催化氧化反應(yīng)和還原反應(yīng)的比酶活分別為42.4 U/mg和4.1 U/mg［4］。

雖然，國內(nèi)外不斷出現(xiàn)關(guān)于硫加氧還原酶的活性研究及異源表達(dá)的報(bào)道，但是有關(guān)嗜酸硫桿菌屬中的SOR酶活及異源表達(dá)的研究卻鮮有報(bào)道。2007年，Chen等［18］發(fā)現(xiàn)從異源表達(dá)嗜中溫細(xì)菌Acidithiobacillus sp. SM-1（現(xiàn)更名為A.caldus SM-1）的SOR的大腸桿菌中獲得的粗酶液催化氧化反應(yīng)的比酶活為3.76 U/mg，但此研究并未報(bào)道該酶液催化還原反應(yīng)的活性，也未嘗試研究純化后的酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)。2012年，You等［21］構(gòu)建了克隆Acidithiobacillus sp. SM-1中的sor基因（sorSB）的重組質(zhì)粒pBV220/sorSB，實(shí)現(xiàn)了SOR酶（SORSB）在大腸桿菌HB101中的異源表達(dá)。另外，此研究還比較了來自Acidianus ambivalens和Sulfolobus tokodaii及Acidithiobacillus sp. SM-1的SOR酶的溫度穩(wěn)定性，得出經(jīng)Superdex 200凝膠過濾系統(tǒng)純化后的重組SORSB酶在70℃的條件下催化氧化反應(yīng)的比酶活大約可以達(dá)到0.3 U/mg，但該研究并未分析該酶催化還原反應(yīng)的活性。本研究中首次采用具有His-tag標(biāo)簽的pET-28a表達(dá)載體來構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-sor，并選擇金屬螯合親和層析從重組菌中純化SOR酶，這樣簡(jiǎn)化了蛋白質(zhì)純化過程，且純化后的SOR具有較高的催化活性，催化氧化反應(yīng)和還原反應(yīng)的比酶活可以分別達(dá)到0.70 U/mg和2.21 U/mg，純化的回收率約為40%，純化倍數(shù)可約達(dá)3倍。本研究還分析了該重組酶的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)特性，獲得了此酶催化氧化反應(yīng)和還原反應(yīng)的Km和Vmax值。

另外，本研究中所使用的菌種Acidihthiobacillus caldus TST3為本實(shí)驗(yàn)室從湖北大冶銅山口礦區(qū)酸性排污口附近的土壤中篩選鑒定獲得的一株浸磷菌，從中克隆出的sor基因所編碼的蛋白質(zhì)序列（AcSOR）與GenBank中所報(bào)道的模式菌株A.caldus ATCC 51756的SOR氨基酸序列的相似性為97%，其中有9處突變位點(diǎn)。對(duì)比AcSOR與各種微生物中的SOR氨基酸序列，可知這些突變位點(diǎn)并不保守，在不同微生物中變化較大，且不存在于酶活性中心。另外，酶活測(cè)定結(jié)果顯示這種突變的AcSOR仍可以催化單質(zhì)硫的氧化和歧化反應(yīng)，產(chǎn)生亞硫酸鹽、硫代硫酸鹽及硫化物，具有一定的酶活。以上結(jié)果均說明這些突變不會(huì)或只會(huì)微弱地影響酶的活性。為了進(jìn)一步確定上述突變位點(diǎn)對(duì)SOR酶的活性產(chǎn)生的影響及相應(yīng)的機(jī)理，目前本實(shí)驗(yàn)室致力于構(gòu)建回復(fù)突變型重組SOR酶。通過對(duì)比突變前后的兩種酶催化反應(yīng)的差異，以了解AcSOR的酶促反應(yīng)機(jī)制，為下一步進(jìn)行分子改造奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

以嗜酸喜溫硫桿菌TST3的硫加氧還原酶基因?yàn)槟０?，PCR擴(kuò)增獲得目的片段，選用pET-28a質(zhì)粒為表達(dá)載體，構(gòu)建了異源表達(dá)嗜酸喜溫硫桿菌硫加氧還原酶的大腸桿菌。優(yōu)化了重組菌株的誘導(dǎo)條件，并經(jīng)Ni+-NTA層析柱分離純化獲得重組AcSOR，其催化氧化反應(yīng)和還原反應(yīng)的比酶活分別達(dá)到0.70 U/mg和2.21 U/mg。且該重組AcSOR催化氧化反應(yīng)的Km和Vmax分別為15.672×10-2g/mL和12.755 ×10-5mol/（L·min），催化還原反應(yīng)的Km和Vmax分別為0.507×10-2g/mL和4.876×10-5mol/（L·min）。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Cloning and Expression of Sulfur Oxygenase Reductase Gene from Acidithiobacillus caldus and the Study of the Recombinant Enzyme Activity

Li Lingling Lü Zaosheng Zuo Zhenyu Li Yaoyi
（College of Chemical Engineering and Technology，Wuhan University of Science and Technology，Wuhan 430081）

In order to investigate biochemical properties of sulfur oxygenase reductase from Acidithiobacillus caldus（AcSOR）， the sor gene was amplified by PCR with the extracted A. caldus TST3 genomic DNA as template， which was inserted into vector pET-28a to construct recombinant plasmid pET-sor. And the plasmid was then transformed into Escherichia coli BL21（DE3）to obtain recombinant strain E.coli BL21（pET-sor2）. SDS-PAGE showed that the target enzyme SOR could be expressed in this recombinant strain after induction by IPTG. Induction conditions were optimized. The recombinant AcSOR was purified with Ni+-NTA column from the supernatant of the sonicated E.coli BL21（pET-sor2）induced under the optimal conditions. For the oxidation reaction， specific activity， Kmand Vmaxof the purified AcSOR were 0.70 units of oxidase/mg of protein， 15.672×10-2g/mL and 12.755×10-5mol/ （L·min）， respectively. Furthermore， specific activity， Kmand Vmaxof AcSOR for the reduction reaction were 2.21 units of reductase/mg of protein， 0.507×10-2g/mL and 4.876×10-5mol/ （L·min）， respectively.

bioleaching；Acidithiobacillus caldus；sulfur oxygenase reductase；enzyme activity

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.11.024

2015-01-28

湖北省科技廳基金項(xiàng)目（2009CDA006），湖北省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2014CFB802）

李凌凌，女，博士，副教授，研究方向：微生物浸礦技術(shù)；E-mail：moonletsmile@163.com

呂早生，博士，教授，研究方向：生物冶金；E-mail：lzs1961@aliyun.com