黃錠 劉旭平 范里 趙亮 譚文松 陳則

采用動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)流感疫苗，是將病毒適應(yīng)到傳代細(xì)胞，并在生物反應(yīng)器中大規(guī)模進(jìn)行病毒繁殖以實(shí)現(xiàn)流感疫苗的規(guī)?；a(chǎn)。目前，這種工藝已經(jīng)逐步取代傳統(tǒng)雞胚培養(yǎng)技術(shù)，成為流感疫苗生產(chǎn)的主流工藝。然而，相對(duì)于日益增長的全球流感疫苗需求，這種生產(chǎn)工藝產(chǎn)能相對(duì)低下，因此提高工藝效率的研究工作勢(shì)在必行。近年來，應(yīng)用于提高產(chǎn)率的手段多種多樣，主要涉及營養(yǎng)調(diào)節(jié)（維持培養(yǎng)基優(yōu)化、流加、灌注等）［1-4］、基因改造［5-7］和感染參數(shù)調(diào)整［感染復(fù)數(shù)（Multiplicity of infection，MOI）、感染時(shí)間（Time of infection，TOI）等］［8］等幾個(gè)方面。

在基于MDCK細(xì)胞（Mardin-Darby kidney cells，MDCK）培養(yǎng)技術(shù)的流感疫苗生產(chǎn)工藝中，MDCK細(xì)胞是流感病毒的宿主細(xì)胞，流感病毒在細(xì)胞內(nèi)的擴(kuò)增必然會(huì)受到感染時(shí)的細(xì)胞生理狀態(tài)的影響。生理狀態(tài)良好的細(xì)胞有利于病毒的感染復(fù)制，可提高流感病毒在細(xì)胞內(nèi)的擴(kuò)增效率，而TOI是決定感染病毒時(shí)細(xì)胞生理狀態(tài)的關(guān)鍵因素。因此，TOI是流感疫苗生產(chǎn)工藝中一個(gè)重要的優(yōu)化參數(shù)。細(xì)胞在生長過程中其生理狀態(tài)是隨時(shí)間不斷變化的，其生產(chǎn)病毒的能力也會(huì)隨之發(fā)生相應(yīng)改變。因此，考察細(xì)胞在何時(shí)處于感染復(fù)制病毒的最佳生理狀態(tài)成為一個(gè)關(guān)鍵研究點(diǎn)。當(dāng)TOI較小時(shí)，細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長期時(shí)，細(xì)胞對(duì)應(yīng)的生理狀態(tài)較好，此時(shí)可能有利于病毒感染復(fù)制。當(dāng)TOI較大，細(xì)胞處于衰亡期時(shí)，細(xì)胞逐漸死亡，這對(duì)于病毒擴(kuò)增過程可能造成不利影響［1，9-12］。然而，目前的研究工作大多僅涉及最適合TOI的選擇，而鮮見TOI對(duì)細(xì)胞生長、代謝與流感病毒擴(kuò)增過程影響的研究［8，13］。因此，深入研究TOI對(duì)MDCK細(xì)胞生產(chǎn)流感病毒過程的影響機(jī)制，對(duì)于流感疫苗工藝的開發(fā)與優(yōu)化具有重要的意義。

本研究通過以H1N1流感病毒于不同TOI條件下感染MDCK細(xì)胞的方法，研究TOI對(duì)MDCK細(xì)胞生長、代謝以及流感病毒擴(kuò)增過程的影響，以期能夠揭示TOI對(duì)MDCK細(xì)胞培養(yǎng)中流感病毒生產(chǎn)過程的作用機(jī)制，為基于動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的流感疫苗生產(chǎn)工藝的開發(fā)與優(yōu)化工作提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株與培養(yǎng)基 本實(shí)驗(yàn)所用的細(xì)胞株為犬腎上皮連續(xù)細(xì)胞系MDCK細(xì)胞，購自ATCC。細(xì)胞培養(yǎng)所用培養(yǎng)基補(bǔ)加10％（V/V）胎牛血清（購自美國Gibco公司）和3700mg/L碳酸氫鈉（購自美國Sigma-Aldrich公司）的DMEM培養(yǎng)基（購自美國Gibco公司）。流感病毒生產(chǎn)階段所用維持培養(yǎng)基為添加5mg/L 經(jīng)甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲酮（TPCK）處理的胰蛋白酶（購自美國Sigma-Aldrich公司）的DMEM培養(yǎng)基。

1.1.2 病毒株 WHO推薦的甲型流感病毒株A/California/7/2009（H1N1）X-179A， 購 于 英 國 國家生物標(biāo)準(zhǔn)與檢定所（National Institute for Biological Standards and Control，NIBSC）。該病毒為以模式甲型流感A/PR8/34病毒株為骨架，含2009年流行的豬流感病毒抗原蛋白基因的重組病毒株。病毒原液為在SPF雞胚中收獲的尿囊液，其半組織感染滴度TCID50值為 5.62×108TCID50/mL。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 種子細(xì)胞用方瓶貼壁培養(yǎng)，待種子細(xì)胞足夠時(shí)于攪拌瓶中以微載體懸浮培養(yǎng)進(jìn)行接毒實(shí)驗(yàn)。方瓶培養(yǎng)：從細(xì)胞庫中復(fù)蘇MDCK細(xì)胞，以4×104-5×104cells/cm2細(xì)胞密度接種于方瓶（購自美國Corning公司）中，置于 37℃、5％ CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，作為實(shí)驗(yàn)用的種子細(xì)胞。待MDCK細(xì)胞生長至鋪滿方瓶底部約80％-90％后，去掉培養(yǎng)液，用不含鈣鎂的無菌磷酸緩沖液（Phosphate buffered saline，PBS）（0.2mL/cm2）漂洗細(xì)胞；然后于室溫下用含0.25％（W/V）胰蛋白酶（購自Gibco公司）和 0.05％（W/V）EDTA（Ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）（購自Sigma-Aldrich公司）的無菌消化液（0.2mL/cm2）消化細(xì)胞30-60s；棄消化液后，置于5％ CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱37℃孵育至細(xì)胞收縮變圓，輕搖方瓶細(xì)胞即可脫落；加入新鮮培養(yǎng)基輕柔吹打均勻后傳代，接種密度為4×104-5×104cells/cm2。

微載體攪拌瓶培養(yǎng)：微載體CytodexTM1（購自美國GE-Healthcare公司）用PBS浸泡3次，每次浸泡30min，滅菌后待用。接種MDCK細(xì)胞至裝有微載體的無菌500mL攪拌瓶（購自美國Corning公司）中，接種細(xì)胞密度為2×105-3×105cells/mL，微載體用量為2g/L，培養(yǎng)液體積為200mL。置于37℃、5％CO2的培養(yǎng)箱中，攪拌瓶轉(zhuǎn)速設(shè)為50r/mim。

1.2.2 病毒感染 細(xì)胞培養(yǎng)至實(shí)驗(yàn)既定時(shí)間（TOI，視具體實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)而定），去除上清，以等培養(yǎng)體積的PBS洗滌細(xì)胞兩次以除去殘留血清蛋白及抑制性代謝物，加入等體積含病毒原液（MOI=0.01，以病毒原液TCID50值為依據(jù)［14］）和維持培養(yǎng)基繼續(xù)孵育。

1.2.3 MOI確定方法 根據(jù)劉鵬等［15-17］的方法，以不同 MOI（1、0.01、0.001、0.0001和 0.00001）接種病毒原液感染以微載體培養(yǎng)生長良好的MDCK細(xì)胞，血凝滴度實(shí)驗(yàn)（Hemagglutination assay，HA）結(jié)果顯示MOI為0.01時(shí)病毒HA滴度最高，表明接種劑量選擇MOI=0.01為最佳，故本實(shí)驗(yàn)MOI采用0.01。1.2.4 取樣及樣品處理 培養(yǎng)過程中每12h取樣，計(jì)數(shù)細(xì)胞。培養(yǎng)懸液經(jīng)300×g離心10min后取上清于-20℃保存，用于檢測(cè)營養(yǎng)物和代謝副產(chǎn)物濃度。上清存-80℃用于測(cè)定流感病毒血凝滴度。

2.1 Survivin基因表達(dá)與喉癌患者臨床病理特征的關(guān)系 126例喉癌癌組織標(biāo)本中共檢出Survivin陽性86例，陽性率為68.3%(86/126)。Survivin陽性組年齡、性別、腫瘤部位與Survivin陰性組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、中低分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者比例顯著高于Survivin陰性組(P<0.05)，見表1。

1.2.5 細(xì)胞計(jì)數(shù) 傳代時(shí)細(xì)胞經(jīng)消化后以臺(tái)盼藍(lán)拒染法計(jì)數(shù)。具體來說，培養(yǎng)好的貼壁細(xì)胞消化后，用新鮮的培養(yǎng)基將細(xì)胞按一定比例制成細(xì)胞懸液。以0.5mL加入24孔板一孔中，加入0.5mL 0.4％臺(tái)盼藍(lán)染液，染色2-3min后吸取少許懸液涂于血球計(jì)數(shù)板上，加上蓋玻片，鏡下對(duì)每個(gè)視野分別計(jì)死細(xì)胞和活細(xì)胞數(shù)。微載體培養(yǎng)的細(xì)胞以結(jié)晶紫染核法計(jì)數(shù)。其方法為，取1mL含鋪有細(xì)胞的微載體的培養(yǎng)液，沉降棄上清，以不含鈣鎂的磷酸緩沖液（Phosphate buffered saline，PBS）洗滌一遍，去除上清，加入與上清等體積的結(jié)晶紫裂解染色液，搖床上37℃孵育4h。經(jīng)處理，微載體上細(xì)胞被裂解，細(xì)胞核釋放到上清中并被結(jié)晶紫染色。將此懸液吹打均勻后用PBS緩沖液以適當(dāng)倍數(shù)稀釋，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞核即為活細(xì)胞數(shù)。計(jì)數(shù)所需試劑均購自Sigma-Aldrich公司。

1.2.6 營養(yǎng)物及代謝副產(chǎn)物濃度測(cè)定 培養(yǎng)液中營養(yǎng)物葡萄糖、谷氨酰胺和代謝副產(chǎn)物乳酸、氨的濃度使用生化分析儀Bioprofile 400analyzer（購自美國Nova biomedical公司）測(cè)定。

1.2.7 流感病毒血凝滴度測(cè)定 采用血凝滴度實(shí)驗(yàn)HA試驗(yàn)方法測(cè)定。配置雞紅細(xì)胞懸液，使懸液中的紅細(xì)胞密度控制在2.0×107cells/mL左右。在每個(gè)孔中加入50μL配置好的雞紅細(xì)胞懸液，振蕩器上振蕩混勻，室溫下靜置20-30min后，觀察其結(jié)果［18］。每個(gè)樣品同時(shí)平行測(cè)試2遍，結(jié)果取平均值。所需96孔微量反應(yīng)板購自Corning公司，雞紅細(xì)胞由上海生物制品研究室有限責(zé)任公司提供。

1.2.8 計(jì)算方法 細(xì)胞比生長速率計(jì)算：

其中，μ：比生長速率（h-1），VCD：活細(xì)胞密度（cells/mL），t為時(shí)間（h）。

其中，IVCC：活細(xì)胞密度對(duì)時(shí)間的積分（109cells·d/L）；i：葡萄糖、谷氨酰胺、乳酸或氨；Qi：0到t期間物質(zhì)的比消耗速率或比生產(chǎn)速率mmol/（109cells·d）；△i：0到t期間i物質(zhì)單位體積的消耗或生成量（mmol/L）。

計(jì)算乳酸對(duì)葡萄糖的轉(zhuǎn)化率Ylac/gluc（mmol/mmol）及氨對(duì)谷氨酰胺的轉(zhuǎn)化率Yamm/gln（mmol/mmol）：

單位細(xì)胞病毒產(chǎn)率（svy）的計(jì)算［19］：

式中：Vi：收獲病毒時(shí)的體積（mL），RBC（Red blood cell）：紅細(xì)胞密度（cells/mL），WV（Working volume）：工作體積（mL），Xv：受感染的活細(xì)胞密度（cells/mL），αHAi：血凝值檢測(cè)最高的 HA 效價(jià)（HA units/50μL）。

2 結(jié)果

2.1 TOI對(duì)感染H1N1流感病毒后MDCK細(xì)胞生長的影響

將 MDCK細(xì)胞培養(yǎng)至 24、48、60、72、84和96h后感染H1N1流感病毒（即TOI分別為24、48、60、72、84和96h），考察TOI對(duì)感染H1N1流感病毒后MDCK細(xì)胞生長的影響，結(jié)果如圖1所示。

各TOI條件下，感染時(shí)活細(xì)胞密度CCI（Cell concentration at infection，CCI）為（1.49±0.04）×106cells/mL、（3.01±0.20）×106cells/mL、（4.28±0.12）×106cells/mL、（5.19±0.25）×106cells/mL、（5.57±0.01）×106cells/mL 和（5.52±0.13）×106cells/mL。TOI=24h與 TOI=48h組在感染后12h（12hpi）內(nèi)，細(xì)胞密度分別增加（14.61±7.38）％和（21.57±2.62）％，該階段比生長速率均為正值；隨后細(xì)胞密度快速下跌，比生長速率變?yōu)樨?fù)值，前者細(xì)胞密度60hpi跌至0，后者細(xì)胞密度72hpi跌至0。TOI=60h組0-24hpi細(xì)胞密度緩慢下跌，該階段平均比生長速率為-0.003h-1；隨后下跌速度加劇，72hpi跌至0。TOI=84h與96h組，細(xì)胞密度自0hpi起便快速下跌，無增長期或緩慢下跌期。

計(jì)算0-48hpi平均死亡速率（圖1-C）可知，TOI小于60h時(shí)，細(xì)胞比死亡速率隨TOI增加而減??；當(dāng)TOI大于60h時(shí)，細(xì)胞比死亡速率隨TOI增加而增加。

圖1 不同TOI條件下MDCK細(xì)胞的活細(xì)胞密度（A）、比生長速率（B）和0-48hpi平均比死亡速率（C）

2.2 TOI對(duì)感染H1N1流感病毒后MDCK細(xì)胞代謝的影響

同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)也考察了TOI對(duì)感染H1N1流感病毒后MDCK細(xì)胞代謝的影響，結(jié)果如圖2所示。TOI小于60h時(shí)，葡萄糖比消耗速率（-Qgluc）隨TOI增加而大幅下跌；TOI小于60h時(shí)，-Qgluc隨TOI變化幅度減小。TOI小于48h時(shí)，谷氨酰胺的比消耗速率（-Qgln）隨TOI增加大幅下跌；TOI大于48h時(shí)，-Qgln變化幅度較小。對(duì)于乳酸和氨這兩種代謝產(chǎn)物，TOI小于72h時(shí)生成速率（Qlac和Qamm）隨TOI增加而大幅下跌；TOI大于72h，Qlac和Qamm代謝速率很小。

另外，計(jì)算乳酸對(duì)葡萄糖的轉(zhuǎn)化率（Qlac/（-Qgluc））與氨對(duì)谷氨酰胺的轉(zhuǎn)化率（Qamm/（-Qgln）），結(jié)果表明，隨著 TOI增大，Qlac/（-Qgluc）逐漸增大，而Qamm/（-Qgln）逐漸減小（圖 2-B）。

2.3 TOI對(duì)MDCK細(xì)胞中H1N1流感病毒擴(kuò)增過程的影響

TOI對(duì)H1N1流感病毒在MDCK細(xì)胞中擴(kuò)增過程的影響如圖3所示。圖3-A和3-B顯示，TOI=24h組 HA 滴度至 24hpi達(dá)到 2.56×102HA units/50μL，隨后至 48hpi達(dá)峰值 6.09×102HA units/50μL，72hpi時(shí)略有下降；TOI設(shè)為48h，至24hpi病毒HA滴度僅為 1.28×102HA units/50μL，48hpi達(dá)到最大值7.24×102HA units/50μL，72hpi時(shí)下跌；TOI為 60h，24hpi時(shí) HA滴度為（3.84±1.81）×102HA units/50μL，48hpi達(dá)最大值（8.74±2.12）×102HA units/50μL，72hpi下降 ；TOI為 72h，24hpi時(shí) HA 滴度為5.12×102HA units/50μL，48hpi達(dá)最大值 1.02×103HA units/50μL，72hpi略 降 ；TOI為 84h 和 96h，HA滴度亦于48hpi達(dá)最大值，但最大值均低于TOI=72h組。進(jìn)一步計(jì)算（圖3-C）得知，單位細(xì)胞病毒產(chǎn)率svy隨TOI增大而降低。而且，TOI=72h時(shí)獲得的HA滴度最高，svy卻并非最高。隨著TOI增加，感染前細(xì)胞密度CCI呈上升趨勢(shì)，而對(duì)應(yīng)svy則呈下降趨勢(shì)（圖3-C）。

圖2 不同TOI條件下MDCK代謝速率（A）及葡萄糖和谷氨酰胺轉(zhuǎn)化效率（B）

圖3 不同TOI條件下MDCK中H1N1流感病毒滴度隨時(shí)間變化（A）、最大滴度（B）和單位細(xì)胞病毒產(chǎn)率（C）

2.4 不同TOI條件下CCI對(duì)單位細(xì)胞病毒產(chǎn)率的影響

據(jù)上述圖3-C結(jié)果，有必要進(jìn)一步考察TOI、CCI與svy的關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)將取自不同培養(yǎng)時(shí)間（TOI=24、36、48、60和 72h）的細(xì)胞濃縮或稀釋至不同細(xì)胞密度梯度，即每個(gè)TOI條件下設(shè)置1×106-5×106cells/mL 5個(gè)細(xì)胞密度梯度，考察各實(shí)驗(yàn)組svy值。圖4顯示，當(dāng)TOI相同時(shí)，不同CCI條件下svy值基本不變；而當(dāng)CCI相同時(shí)，svy隨TOI增加而降低。

3 討論

近年來，全世界對(duì)流感疫苗的需求量在飛速增長。相較之下，以動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)方法為基礎(chǔ)的流感病毒疫苗生產(chǎn)工藝的產(chǎn)能則相對(duì)低下，成為制約這種新興工藝發(fā)展的一個(gè)瓶頸因素［20］。因此，提高生產(chǎn)效率一直是該類工藝開發(fā)與優(yōu)化工作的重點(diǎn)。在眾多的考察因素中，感染參數(shù)TOI是一個(gè)重要考察對(duì)象。然而，目前工作大多僅涉及最適合TOI值的選擇［13，21］，而少有研究TOI值對(duì)工藝過程影響機(jī)制。據(jù)此，本研究通過設(shè)置不同TOI條件，研究了其對(duì)細(xì)胞生長、代謝與流感病毒擴(kuò)增過程影響，以及TOI、CCI與svy之間的關(guān)系。

圖4 不同TOI與CCI條件下MDCK細(xì)胞中單位細(xì)胞病毒產(chǎn)率

首先，考察了TOI的設(shè)定值對(duì)被流感病毒感染后的MDCK細(xì)胞的生長和代謝的影響。通過上述研究結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，TOI的設(shè)定值會(huì)影響細(xì)胞死亡速率，TOI值過小或過大均會(huì)使被H1N1流感病毒感染的MDCK細(xì)胞死亡速率加快。推測(cè)其原因可能為：當(dāng)TOI過小時(shí)，細(xì)胞密度較小，細(xì)胞之間結(jié)合比較疏松，且細(xì)胞伸展到微載體表面，導(dǎo)致細(xì)胞體積大，表面積大［22］，因而更容易被病毒感染脫落死亡或被TPCK-胰酶影響［23，24］；相反，TOI過大，細(xì)胞衰老，代謝廢物累積等原因造成細(xì)胞很脆弱，甚至出現(xiàn)凋亡，同時(shí)病毒感染又會(huì)加劇凋亡過程，所以細(xì)胞死亡速率快。同時(shí)，TOI設(shè)定值不同，也會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞代謝速率出現(xiàn)很大差異。結(jié)果表明，被感染后的細(xì)胞的對(duì)Gluc、Gln、Lac和Amm等物質(zhì)的代謝速率會(huì)隨著TOI值的增大而減緩。在細(xì)胞生長過程中，細(xì)胞之間相互作用，胞內(nèi)各種代謝相關(guān)的酶活均會(huì)不斷變化［22，25］，最終導(dǎo)致不同TOI條件下細(xì)胞對(duì)各種營養(yǎng)代謝物的代謝速率不同。綜合這兩方面結(jié)果，不同TOI條件下，感染前細(xì)胞維持培養(yǎng)的時(shí)間長短不一，從而導(dǎo)致細(xì)胞密度不同、營養(yǎng)物的消耗量和代謝副產(chǎn)物的累積量不同。另外不容忽視的一點(diǎn)，不同TOI條件下感染流感病毒后MDCK細(xì)胞對(duì)乳酸對(duì)葡萄糖的轉(zhuǎn)化率和氨對(duì)谷氨酰胺的轉(zhuǎn)化效率也會(huì)有很大差別。Qlac/（-Qgluc）隨TOI設(shè)定值的增加而增大，表明隨著TOI的增大，進(jìn)入三羧酸循環(huán)（Tricarboxylic acid cycle，TCA）的 Gluc減少，Gluc的產(chǎn)能效率降低；而Qamm/（-Qgln）逐漸減小，表明隨著TOI的增大，進(jìn)入TCA的Gln增多，Gln的產(chǎn)能效率提高［25］。如前所述，培養(yǎng)后期細(xì)胞變得脆弱甚至出現(xiàn)凋亡，并且病毒擴(kuò)增過程也會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。而凋亡過程會(huì)致使線粒體膜通透性增加，出現(xiàn)能量缺陷［26］，需要更多的 Gluc 進(jìn)入糖酵解來補(bǔ)充能量［27］，同時(shí)生成乳酸［25］。與此同時(shí)，更多的Gln進(jìn)入回補(bǔ)TCA途徑，待Gln耗竭，便會(huì)誘導(dǎo)谷氨酰胺合酶活性，通過谷氨酸和氨合成谷氨酰胺，從而導(dǎo)致Qamm/（-Qgln）逐漸減?。?5］。另外，氨氣通過培養(yǎng)基揮發(fā)逃逸可能也是原因之一。綜上分析，MDCK細(xì)胞的生長狀態(tài)、代謝速率及代謝效率均有很大差別，表明不同TOI條件下MDCK細(xì)胞的狀態(tài)也會(huì)有很大差別。

另外，通過考察TOI對(duì)流感病毒擴(kuò)增過程的影響發(fā)現(xiàn)，TOI不同，則病毒的產(chǎn)量和單位細(xì)胞病毒產(chǎn)率也會(huì)有很大差別。更值得注意的一點(diǎn)，在此實(shí)驗(yàn)條件下CCI越高svy越低，這與文獻(xiàn)中提到的“細(xì)胞密度效應(yīng)”極為相似［19，28］。但經(jīng)進(jìn)一步研究TOI、CCI、svy 三者之間的關(guān)系可知，當(dāng)保持TOI不變時(shí)，這種“細(xì)胞密度效應(yīng)”則不復(fù)存在。換言之，svy高低更大程度上取決于TOI值的大小?？v觀全文研究結(jié)果，TOI之所以能對(duì)MDCK細(xì)胞中H1N1流感病毒擴(kuò)增過程產(chǎn)生顯著影響，其根源在于不同TOI條件下細(xì)胞自身狀態(tài)有很大差別［21］。據(jù)此，在今后的工藝開發(fā)工作中，可以不再受限于TOI，而通過人為合理調(diào)控細(xì)胞狀態(tài)的手段來提高流感病毒生產(chǎn)效率。但細(xì)胞狀態(tài)變化所包含的因素錯(cuò)綜復(fù)雜，而且目前對(duì)其界定也尚未十分明確。TOI不同可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞表面病毒受體、細(xì)胞周期分布、細(xì)胞凋亡、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制、營養(yǎng)組分濃度、代謝毒物積累程度以及其它未知微環(huán)境等眾多因素發(fā)生變化［3，13，19，29］，這些都有待進(jìn)一步詳細(xì)考察。

4 結(jié)論

在不同TOI條件下以H1N1流感病毒感染MDCK細(xì)胞，考察TOI對(duì)MDCK細(xì)胞生長與代謝動(dòng)力學(xué)以及H1N1流感病毒擴(kuò)增過程的影響。結(jié)果表明，雖將TOI設(shè)置為72h時(shí)H1N1流感病毒產(chǎn)量最高，但svy卻隨TOI增大而呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。繼而考察TOI、CCI與svy三者之間關(guān)系可知，該現(xiàn)象是由TOI不同所引起的細(xì)胞狀態(tài)改變所致，而非僅由高細(xì)胞密度導(dǎo)致。該研究揭示了由TOI不同導(dǎo)致的細(xì)胞狀態(tài)差異對(duì)MDCK細(xì)胞中H1N1流感病毒生產(chǎn)效率的重要性，表明有望通過調(diào)整細(xì)胞狀態(tài)的手段優(yōu)化動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)流感疫苗的工藝以提高生產(chǎn)效率。

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