肖尚 鄧崇飛 柯軍 鄢成偉 孫文正 楊彬

（廣東東陽(yáng)光藥業(yè)有限公司，東莞 523000）

pH對(duì)重組CHO細(xì)胞生長(zhǎng)、單抗表達(dá)及質(zhì)量的影響

肖尚 鄧崇飛 柯軍 鄢成偉 孫文正 楊彬

（廣東東陽(yáng)光藥業(yè)有限公司，東莞 523000）

在1 L反應(yīng)器中探究pH對(duì)CHO細(xì)胞生長(zhǎng)、單抗表達(dá)及質(zhì)量的影響。在1 L反應(yīng)器中對(duì)pH進(jìn)行探究，實(shí)驗(yàn)研究表明當(dāng)pH為7.05時(shí)最適合CHO細(xì)胞生長(zhǎng)和抗體表達(dá)，在此條件下培養(yǎng)時(shí)第9天獲得最高細(xì)胞密度1.54×107cells/mL，在第11天獲得最高抗體濃度1 355.71 mg/L。pH對(duì)pCO2、乳酸積累、抗體的單體含量、電荷異質(zhì)性和糖基化也有較大影響，當(dāng)pH在6.95至7.25之間時(shí)，高pH培養(yǎng)能夠降低乳酸積累和pCO2，但是會(huì)導(dǎo)致抗體的堿性峰增加。pH兩項(xiàng)培養(yǎng)能夠降低細(xì)胞活力，從而提高抗體表達(dá)量。

pH；CHO細(xì)胞；抗體；pCO2；電荷異質(zhì)性

單抗類藥物的出現(xiàn)為人類一些自身免疫病、癌癥等疑難病的診斷與治療開辟了廣闊前景，在為人類健康作出突出貢獻(xiàn)的同時(shí)也為企業(yè)帶來(lái)非?？捎^的收入，已成為近年來(lái)銷售額最高的一類生物技術(shù)藥物［1-3］。雖然哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)要求高、抗體表達(dá)能力低、生產(chǎn)成本高，但具有其它表達(dá)系統(tǒng)無(wú)法取代的優(yōu)勢(shì)：能夠準(zhǔn)確的完成糖基化、折疊、鏈內(nèi)及鏈間二硫鍵的形成等一系列翻譯后修飾，因此其表達(dá)的抗體在分子結(jié)構(gòu)、理化特性和生物學(xué)功能方面更接近天然產(chǎn)物［4］。自1996年以來(lái)，F(xiàn)DA批準(zhǔn)的生物技術(shù)產(chǎn)品中，有2/3以上是通過(guò)哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)生產(chǎn)的［5］。中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞（Chinese hamster ovary，CHO）由于具有抗剪切力，易于放大培養(yǎng)的優(yōu)勢(shì)，是目前使用最廣泛的哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)［6］。目前使用最廣泛的CHO表達(dá)系統(tǒng)是二氫葉酸還原酶（DHFR）和谷氨酰胺合成酶（Glutaminesynthetase，GS）表達(dá)系統(tǒng)。

目前國(guó)內(nèi)很多科研院校和企業(yè)的宿主細(xì)胞抗體表達(dá)水平都很低，抗體濃度多處于1 000 mg/L以內(nèi)［7］，很難用于實(shí)際生產(chǎn)。而在發(fā)達(dá)國(guó)家，宿主細(xì)胞抗體表達(dá)量往往都在1 000 mg/L以上［8-10］。其次，我國(guó)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)還不成熟，與發(fā)達(dá)國(guó)家差距較大。目前我國(guó)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)更多的工作是為了提高抗體的表達(dá)量而很少關(guān)注抗體的質(zhì)量。動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)已成為我國(guó)抗體類藥物走向產(chǎn)業(yè)化、實(shí)現(xiàn)其經(jīng)濟(jì)價(jià)值，滿足市場(chǎng)需求的瓶頸［3］。

目前動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的主流方式是利用攪拌式生物反應(yīng)器進(jìn)行流加培養(yǎng)，相應(yīng)的反應(yīng)器放大設(shè)計(jì)和操作成為新的挑戰(zhàn)，這其中的主要關(guān)鍵技術(shù)涉及剪切力、氧傳遞、均一性、二氧化碳分壓（pCO2）控制、pH控制、滲透壓及抗體的質(zhì)量等問(wèn)題［11-15］。本研究主要探究pH對(duì)CHO細(xì)胞生長(zhǎng)、抗體表達(dá)及質(zhì)量、pCO2等的影響，以期為國(guó)內(nèi)細(xì)胞培養(yǎng)工藝和QbD方法運(yùn)用時(shí)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 CHO細(xì)胞 所用CHO細(xì)胞為GS-CHO，表達(dá)抗TNFα抗體，由本實(shí)驗(yàn)自主構(gòu)建并保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基 所用基礎(chǔ)培養(yǎng)基為CD EfficientFeedTMB，購(gòu)買至Gibco公司。所用流加培養(yǎng)基為Acti CHO Feed-A CD和Acti CHO Feed-B CD，均購(gòu)買至PAA公司。

1.1.3 主要儀器 細(xì)胞活力分析儀（上海睿鈺生物科技有限公司）；1 L生物反應(yīng)器（荷蘭Applikon生物技術(shù)公司）；NOVA多參數(shù)生化分析儀（美國(guó)Nova生物有限公司）；高效液相色譜安（安捷倫科技有限公司）。

1.2方法

1.2.1 培養(yǎng)方法 將液氮冷凍保藏的CHO細(xì)胞復(fù)蘇后，裝入一次性搖瓶在37℃、130 r/min、8%的CO2條件下進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，每3 d傳代1次，傳代密度為5×105個(gè)/mL。最后將細(xì)胞以10×105個(gè)/ mL的密度接入1 L反應(yīng)器進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞計(jì)數(shù)及活力分析 臺(tái)盼藍(lán)染色后由細(xì)胞活力分析儀自動(dòng)計(jì)數(shù)及分析活力。

1.2.3 葡萄糖、谷氨酸、管氨酰胺、乳酸、銨根、pCO2測(cè)定 使用NOVA多參數(shù)生化分析儀測(cè)定。

1.2.4 HPLC法檢測(cè)抗TNFα抗體濃度 用0.1 mol/L磷酸緩沖液以2 mL/min流速平衡HPLC系統(tǒng)15 min至基線平穩(wěn)，于系統(tǒng)程序中設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)曲線法程序。進(jìn)樣50 μL于進(jìn)樣器，以2 mL/min流速洗脫，記錄有關(guān)數(shù)據(jù)，并進(jìn)行處理。

1.2.5 HPLC法檢測(cè)抗TNFα抗體電荷異質(zhì)性 進(jìn)樣體積100 μL，流速1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm，樣品盤溫度8℃，柱溫40℃，運(yùn)行時(shí)間22 min。

1.2.6 毛細(xì)管電泳測(cè)定抗TNFα單抗純度 毛細(xì)管電泳系統(tǒng)分別用1 mol/ L NaOH 洗5 min、水洗5 min及分離緩沖液洗10 min。每次進(jìn)樣前，分別用0.1 mol/L NaOH 及分離緩沖液洗1 min 后即可進(jìn)樣。毛細(xì)管長(zhǎng)30.2 cm，有效長(zhǎng)度20 cm，檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm，柱溫25℃，樣品盤15℃。

1.2.7 HPLC-MS檢測(cè)抗TNFα抗體糖基化 色譜條件（色譜柱：Agilent-C8，75×2.1 mm，5 μm，300埃）：進(jìn)樣體積2 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm，流速0.5 mL/min，柱溫75℃，樣品盤溫度8℃；

質(zhì)譜條件：儀器模式Auto MS/MS，離子模式Dual AJS ESI源，陽(yáng)離子，干燥氣體N2，12 L/min，325℃；碰撞電壓260 V；工作電壓65 V；毛細(xì)管電壓4 000 V；夾套氣體溫度（流速）：350℃，12 L/min；氣體溫度325℃；VCap：3 500 V；噴頭電壓1 000 V；分離器電壓65 V；OCT 1 RF Vpp電壓750 V；質(zhì)量范圍500-3 200 m/z。

1.2.8 HPLC法檢測(cè)抗TNFα抗體多聚體含量 取25 μL樣品加緩沖液1 mL稀釋，上樣10 μL，流速0.5 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm。

2 結(jié)果

2.1 單相pH培養(yǎng)對(duì)CHO細(xì)胞的影響

在1 L反應(yīng)器中探究pH對(duì)CHO細(xì)胞生長(zhǎng)、抗體表達(dá)等生理代謝的影響，選擇研究的pH范圍為6.95至7.25，用CO2和7.5%的碳酸氫鈉來(lái)控制pH，pH控制的死區(qū)范圍為±0.05，實(shí)驗(yàn)平行數(shù)為2。1 L反應(yīng)器初始培養(yǎng)體積為400 mL，接種密度為1.0E+ 06 cells/mL，OD控制在40%；轉(zhuǎn)速第0天到第5天為150 r/min，之后為196 r/min，培養(yǎng)溫度均為37℃恒溫。培養(yǎng)初期用空氣調(diào)節(jié)OD，當(dāng)通入的空氣量超過(guò)0.1V VM之后改通純氧。培養(yǎng)至第3天后每隔24 h流加9.6 mL cti CHO Feed-A CD和0.96 mL Acti CHO Feed-B CD。共培養(yǎng)11 d，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。

圖1 pH對(duì)CHO細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

一般pH低于6.8或者大于7.3不適于CHO細(xì)胞的生長(zhǎng)。通過(guò)圖2發(fā)現(xiàn)隨著pH的增加活細(xì)胞密度和抗體表達(dá)量都呈現(xiàn)出先增大后降低的趨勢(shì)。對(duì)于本實(shí)驗(yàn)所用CHO細(xì)胞，最優(yōu)pH為7.05，在此條件下培養(yǎng)第9天獲得最大細(xì)胞密度1.54×107個(gè)/mL，第11天獲得最高抗體濃度1 355.71 mg/L，但當(dāng)pH為6.95時(shí)在第9天獲得最大的每天單細(xì)胞抗體表達(dá)量（SPR）為26.04 pg。

圖2 pH對(duì)CHO細(xì)胞抗體表達(dá)的影響

動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)pCO2受各種因素的影響：pH、通氣、培養(yǎng)基成分、細(xì)胞代謝等。在本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)的過(guò)程中pCO2呈現(xiàn)出先下降后上升的趨勢(shì)（圖3），這主要是由于CHO細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)前期產(chǎn)生乳酸，中和培養(yǎng)基中堿性物質(zhì)，導(dǎo)致pCO2降低（圖4）。后期由于營(yíng)養(yǎng)需求較大，乳酸產(chǎn)生的速率較低甚至被消耗，且細(xì)胞密度較高，細(xì)胞代謝產(chǎn)生大量CO2，無(wú)法及時(shí)排出，導(dǎo)致pCO2上升。對(duì)于相同的培養(yǎng)基，當(dāng)培養(yǎng)時(shí)設(shè)定的pH值越低，pCO2值越大，可能是由于需要更多的CO2去降低培養(yǎng)基的pH。

從表1中可以看出pH對(duì)抗體的非還原純度和電荷異質(zhì)性有影響，對(duì)多聚體影響不大。隨著pH的增大，抗體非還原純度呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在pH為7.05時(shí)獲得最大抗體非還原純度96.85%；隨著pH的增加，抗體主峰在下降，堿性峰在上升，酸性峰總體呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，但變化量很小。表2說(shuō)明pH對(duì)抗體的糖基化有影響，隨著pH的增大G2F、G1F含量在下降，G0F、G1F-GN含量在上升。

2.2 兩相pH對(duì)CHO細(xì)胞的影響

在1 L反應(yīng)器中探究在第9天將pH從初始7.05轉(zhuǎn)成6.95時(shí)對(duì)細(xì)胞抗體表達(dá)的影響，結(jié)果如圖5所示。pH能夠影響許多酶的活性，從而對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)、抗體表達(dá)、抗體質(zhì)量等有比較大的影響。圖6顯示出當(dāng)pH從7.05調(diào)至6.95，活細(xì)胞密度和細(xì)胞活率都有所下降，但由于pH變化幅度比較小，所以對(duì)細(xì)胞沒(méi)有造成嚴(yán)重的損傷，活細(xì)胞密度和細(xì)胞活率下降程度不大。

圖3 pH對(duì)pCO2的影響

圖4 pH對(duì)乳酸積累的影響

表1 pH對(duì)抗體純度及電荷異質(zhì)性的影響

表2 pH對(duì)抗體糖基化的影響

圖5 pH兩項(xiàng)培養(yǎng)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

圖6 pH兩項(xiàng)培養(yǎng)對(duì)抗體表達(dá)的影響

pH調(diào)整后SPR值有所上升，使得最后獲得的抗體濃度比單項(xiàng)pH培養(yǎng)時(shí)要高。這些可能是由于細(xì)胞自身的代謝和抗體表達(dá)都需要消耗營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和能量，而抗體在后期大量表達(dá)，導(dǎo)致后期營(yíng)養(yǎng)和能量需求比較大，流加的營(yíng)養(yǎng)和細(xì)胞自身所產(chǎn)生的能量不能同時(shí)滿足細(xì)胞生長(zhǎng)和抗體表達(dá)所需。當(dāng)pH調(diào)至6.95后細(xì)胞密度和活率有所降低，減少了由于細(xì)胞自身生理代謝所消耗的營(yíng)養(yǎng)和能量，就使得有更多的營(yíng)養(yǎng)和能量用于抗體合成。

3 討論

以動(dòng)物細(xì)胞為載體生產(chǎn)單克隆抗體已越來(lái)越受到重視，但目前國(guó)內(nèi)的研究更多的停留在培養(yǎng)基開發(fā)［20］和工藝開發(fā)［7］上，很少關(guān)注單抗的質(zhì)量屬性。目前國(guó)際制藥巨頭已經(jīng)深入理解和實(shí)施QbD 理論，將工藝與藥品的質(zhì)量聯(lián)系起來(lái)，做到藥品的質(zhì)量是生產(chǎn)出來(lái)的而不是檢測(cè)出來(lái)。而國(guó)內(nèi)的企業(yè)對(duì)工藝與產(chǎn)品質(zhì)量之間的聯(lián)系研究不夠深入，不能很好的實(shí)施QbD理論。本研究考察了pH對(duì)CHO的生長(zhǎng)、活力及單抗的表達(dá)量、非還原純度（純化后）、電荷異質(zhì)性、糖基化、多聚體的影響，將生產(chǎn)工藝與單抗質(zhì)量建立聯(lián)系。

pH設(shè)定點(diǎn)的不同會(huì)對(duì)細(xì)胞內(nèi)許多酶的活性產(chǎn)生重要影響從而對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)、活力以及單抗表達(dá)有很大的影響，這在國(guó)內(nèi)外有很多文獻(xiàn)報(bào)道。pH兩相培養(yǎng)能夠降低細(xì)胞活力，從而將更多地營(yíng)養(yǎng)和能量提供給抗體合成，提高單抗表達(dá)量。

由于CHO細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)前期產(chǎn)生大量乳酸，中和培養(yǎng)基中堿性物質(zhì)，使得CO2溢出培養(yǎng)基，導(dǎo)致pCO2降低。后期細(xì)胞培養(yǎng)營(yíng)養(yǎng)需求大，乳酸從積累變成消耗，且細(xì)胞密度較高，細(xì)胞代謝產(chǎn)生大量CO2，無(wú)法及時(shí)排出，導(dǎo)致pCO2上升，所以pCO2呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。

研究結(jié)果表明pH對(duì)單抗的電荷異質(zhì)性和半乳糖糖基化有較大影響，半乳糖糖基化對(duì)抗體的ADCC和CDC效應(yīng)有重要影響。隨著pH的增加，抗體主峰在下降，堿性峰在上升，酸性峰總體呈現(xiàn)較小趨勢(shì)的下降，G2F、G1F含量在下降，G0F、G1F-GN含量在上升?？贵w非還原純度對(duì)單抗的免疫源性有重要影響，pH對(duì)單抗的非還原純度（純化后）有影響，隨著pH的增大，呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在pH為7.05時(shí)獲得最大抗體非還原純度96.85%。

由于pH對(duì)單抗的質(zhì)量有重要影響，并且細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)pH值偏離設(shè)計(jì)空間的可能性較大，因此在運(yùn)用QbD方法生產(chǎn)單抗藥物時(shí)，對(duì)pH進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估可將pH列為關(guān)鍵工藝參數(shù)。

4 結(jié)論

當(dāng)pH為7.05時(shí)最適合本實(shí)驗(yàn)室CHO細(xì)胞生長(zhǎng)和抗體表達(dá)。在本研究的pH范圍內(nèi)，高pH培養(yǎng)能夠降低pCO2，但是卻促進(jìn)了乳酸的積累；抗體的非還原純度隨著pH的增加呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢(shì)；較高的pH會(huì)導(dǎo)致堿性峰增高，主峰降低，但對(duì)酸性峰影響不大；當(dāng)培養(yǎng)的pH增加時(shí)G2F、G1F含量在下降，G0F、G1F-GN含量在上升。pH兩項(xiàng)培養(yǎng)能夠降低后期細(xì)胞活力和促進(jìn)抗體表達(dá)。。

［1］胡顯文， 陳惠鵬， 張數(shù)庸. 全球生物制藥產(chǎn)業(yè)概況［J］. 中國(guó)醫(yī)藥生物技術(shù)， 2009， 4（2）：85-89.

［2］張潔， 張松. 單克隆抗體藥物的研究進(jìn)展［J］. 中國(guó)藥業(yè)，2006， 15（14）：61-62.

［3］ 張?jiān)d. 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)工程［M］. 北京：化學(xué)工業(yè)出版社. 2007.

［4］Lim Y， Wong NSC， Lee YY， et al. Engineering mammalian cells in bioprocessing-current achievements and future perspectives［J］. Biotechnology and Applied Biochemistry， 2010， 55（4）：175-189.

［5］Chu L， Robinson DK. Industrial choices for protein production by large-scale cell culture［J］. Curr Opin Biotechnol， 2001， 12：180-187.

［6］Birch JR， Racher AJ. Antibody production［J］. Adv Drug Deliv Rev， 2006， 58：671-685.

［7］范里， 趙亮， 孫亞婷， 等. 表達(dá)TNFR-Fc融合蛋白的GS-CHO細(xì)胞動(dòng)態(tài)流加培養(yǎng)過(guò)程的設(shè)計(jì)［J］. 生物工程學(xué)報(bào)， 2010， 26（2）：216-222.

［8］Li J， Wong CL， Vijayasankaran N， et al. Feeding lactate for CHO cell culture processes：Impact on culture metabolism and performance［J］. Biotechnology and Bioengineering， 2012， 109（5）：1173-1186.

［9］Kshirsagar R， McElearney K， Gilbert A， et al. Controlling trisulfide modification in recombinant monoclonal antibody produced in fed batch cell culture［J］. Biotechnology and Bioengineering， 2012，109（10）：2523-2532.

［10］ Gilbert A， McElearney K， Kshirsagar R， et al. Investigation of metabolic variability observed in extended fed batch cell culture［J］. Biotechnology Progress， 2013， 29（6）：1519-1527.

［11］ Berrios J， Altamirano C， Osses N， et al. Continuous CHO cell cultures with improved recombinant protein productivity by using mannose as carbon source：Metabolic analysis and scale-up simulation［J］. Chemical Engineering Science， 2011， 66（11）：2431-2439.

［12］ Garcia-Ochoa F， Gomez E. Bioreactor scale-up and oxygen transfer rate in microbial processes：an overview［J］. Biotechnology Advances， 2009， 27（2）：153-176.

［13］ Martínez VS， Dietmair S， Quek LE， et al. Flux balance analysis of CHO cells before and after a metabolic switch from lactate production to consumption［J］. Biotechnology and Bioengineering，2013， 110（2）：660-666.

［14］ Takuma S， Hirashima C， Piret JM. Dependence on glucose limitation of the pCO2 influences on CHO cell growth， metabolism and IgG production［J］. Biotechnology and Bioengineering， 2007， 97（6）：1479-1488.

［15］ Xing Z， Kenty BM， Li ZJ， et al. Scale-up analysis for a CHO cell culture process in large-scale bioreactors［J］. Biotechnology and Bioengineering， 2009， 103（4）：733-746.

［16］Takuma S， Hirashima C， Piret JM. Dependence on glucose limitation of the pCO2influences on CHO cell growth， metabolism and IgG production［J］. Biotechnology and Bioengineering， 2007，97（6）：1479-1488.

［17］Gray DR， Chen S， Howarth W， et al. CO2in large-scale and highdensity CHO cell perfusion culture［J］. Cytotechnology， 1996， 22（1-3）：65-78.

［18］ Kimura R， Miller WM. Effects of elevated pCO2and/or osmolality on the growth and recombinant tPA production of CHO cells［J］. Biotechnology and Bioengineering， 1996， 52（1）：152-160.

［19］ Goudar CT， Matanguihan R， Long E， et al. Decreased pCO2 accumulation by eliminating bicarbonate addition to high celldensity cultures［J］. Biotechnology and Bioengineering， 2007， 96（6）：1107-1117.

［20］ 馬愛瑛， 周棟， 李敏. CHO 工程細(xì)胞株低血清培養(yǎng)的初探［J］.生物技術(shù)通報(bào)， 2009（11）：154-157.

（責(zé)任編輯李楠）

The Effects of pH on Cell Growth，Monoclonal Antibody Expression and Quality of a Recombinant CHO Strain

Xiao Shang Deng Chongfei Ke Jun Yan Chengwei Sun Wenzheng Yang Bin
（Sunshine Lake Pharma Co.，Ltd，Dongguan 523000）

It was to study the effect of pH on the growth， monoclonal antibody expression and produce quality of a rewmbinant CHO strain. The results showed that the optimal pH for cell growth and the production of monoclonal antibody（mAb）was 7.05. Under this pH， a peak viable cell density was 1.54×107cells/mL at day 9 and the highest harvested antibody concentration was 1 355.71 mg/L after cultivating for 11 days. In addition， pH significantly affected the accumulation of pCO2and lactate in cell cultures， as well as the expressed product’s quality including its monomer ratio， charge variant species， and glycosylation pattern. While pH ranging from 6.95 to 7.25， cell cultures at higher pH reduced pCO2and the accumulation of lactate， but led the alkaline peak of antibody increase. Cultures at 2 sets of pH decreased the cell activity，therefore increased the expression of antibody.

pH；CHO cell；antibody；pCO2；charge variants

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.12.037

2015-03-10

廣東省引進(jìn)創(chuàng)新科研團(tuán)隊(duì)計(jì)劃（201101Y0104990178）

肖尚，男，碩士研究生，研究方向：動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)；E-mail：xiaoshang@hecpharm.com

楊彬，男，工程師，碩士研究生，研究方向：?jiǎn)慰股a(chǎn)；E-mail：547860796@qq.com