張謙賈佳林智楊曉鋒郭宏濤王劍英Carol Sze Ki Lin

（1.深圳技師學院，深圳 518116；2.深圳市綠微康生物工程有限公司，深圳 518055；3.香港城市大學能源與環(huán)境學院，香港）

產(chǎn)脂肪酶黑曲霉搖瓶發(fā)酵條件優(yōu)化研究

張謙1賈佳2林智2楊曉鋒3郭宏濤2王劍英2Carol Sze Ki Lin3

（1.深圳技師學院，深圳 518116；2.深圳市綠微康生物工程有限公司，深圳 518055；3.香港城市大學能源與環(huán)境學院，香港）

黑曲霉Aspergillus niger G62s是一株具有遺傳穩(wěn)定的高產(chǎn)脂肪酶菌株。針對于G62s搖瓶發(fā)酵條件進行統(tǒng)計學優(yōu)化研究，以提高該菌株的產(chǎn)脂肪酶能力。首先，采用單因素方法對發(fā)酵接種量、搖瓶裝量、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間等因素進行考查，在此基礎(chǔ)上進行4因素3水平的響應(yīng)面分析（Response surface methodology，RSM）的統(tǒng)計學優(yōu)化。得到的優(yōu)化發(fā)酵條件是接種量1.9 %，搖瓶裝量56 mL（500 mL搖瓶），培養(yǎng)溫度30oC，培養(yǎng)時間75 h。在該優(yōu)化條件下，脂肪酶活性達到（212 9 ± 39.9）U/mL，相比初始的發(fā)酵條件提高16.7%。針對于影響G62s菌株產(chǎn)脂肪酶的4個發(fā)酵條件，在單因素實驗的基礎(chǔ)上通過RSM方法優(yōu)化，顯著提高了目標菌株脂肪酶產(chǎn)量。

黑曲霉；脂肪酶；單因素方法；響應(yīng)面分析方法；發(fā)酵條件優(yōu)化

脂肪酶（lipase，EC.3.1.1.3）又稱為三?；视王；饷福╰riacylglycerol acylhydrolase）是一類特殊的酯鍵水解酶，可以催化三酰甘油酯及其它一些水不溶性酯類的水解、醇解、酯化、轉(zhuǎn)酯化及酯類的逆向合成反應(yīng)［1-4］。脂肪酶是動物體內(nèi)脂肪代謝的關(guān)鍵酶，被廣泛應(yīng)用于飼料添加、洗滌業(yè)、油脂改良、食品加工等諸多領(lǐng)域，是一種有較大開發(fā)價值和應(yīng)用前景的多功能生物催化劑［5，6］。目前，脂肪酶的工業(yè)制備主要采用微生物發(fā)酵的方法。黑曲霉（Aspergillus niger）是一種工業(yè)上重要的微生物，被廣泛用于生產(chǎn)脂肪酶、纖維素酶、木聚糖酶等30多種酶制劑，且被美國FDA認定為GRAS（通常認為是安全的）菌株，其發(fā)酵產(chǎn)生的脂肪酶產(chǎn)品可以作為藥品、食品和飼料的輔料及添加劑等［7，8］。應(yīng)用黑曲霉進行脂肪酶生產(chǎn)的另一優(yōu)勢是，黑曲霉能夠?qū)⒅久阜置诘桨l(fā)酵液中，從而降低下游純化成本［9］。目前，運用工業(yè)育種技術(shù)、培養(yǎng)基和發(fā)酵條件優(yōu)化改良等方法進行提高菌種產(chǎn)量，降低發(fā)酵成本，是實現(xiàn)節(jié)能減排、提高企業(yè)競爭力的重要手段之一［10］。

響應(yīng)面分析方法（Response surface methodology，RSM）是采用多元二次回歸方程來擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，通過對函數(shù)響應(yīng)面和等高線的分析，能夠精確地研究各因子與響應(yīng)值之間的關(guān)系，尋求最優(yōu)工藝參數(shù)，解決多變量問題的一種統(tǒng)計方法。而Box-Behnken Design（BBD）是RSM常用的實驗設(shè)計方法之一，是以較少的試驗次數(shù)獲得最有效、最經(jīng)濟試驗設(shè)計和因素優(yōu)化的方法，并且適用于搖瓶實驗［11，12］。近年來，RSM方法廣泛應(yīng)用于各種微生物發(fā)酵不同品種的培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件及發(fā)酵工藝的優(yōu)化設(shè)計中［5，12-14］。

本文針對于產(chǎn)脂肪酶黑曲霉A. niger G62s菌株的搖瓶發(fā)酵條件進行優(yōu)化研究，采用單因素方法考察影響菌株發(fā)酵及產(chǎn)酶特性的接種量、搖瓶裝量、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間等條件，在此基礎(chǔ)上采用RSM對于4個主要影響產(chǎn)酶因素進行優(yōu)化，以提高菌株產(chǎn)脂肪酶的能力。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 黑曲霉A. niger為深圳綠微康生物工程有限公司提供的生產(chǎn)菌株，該菌株現(xiàn)保藏于公司酶制劑研究中心，保藏號：A. niger G62s。

1.1.2 試劑和儀器 主要試劑 酵母膏、蛋白胨、葡萄糖、玉米淀粉、豆粕、無機鹽、瓊脂等培養(yǎng)基所用試劑均為國產(chǎn)化學級試劑，蛋白Marker為美國thermo公司產(chǎn)品，脂肪酶分析所用試劑為分析級試劑。儀器 凈化工作臺，蘇州凈化設(shè)備廠；PHS-25型酸度計，杭州科曉化工儀器設(shè)備有限公司；Avanti J-30I型高效離心機，美國貝克曼庫爾特有限公司；TS-3112型雙層大容量搖床，上海儀純實業(yè)有限公司；JY600凝膠電泳儀，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基 斜面培養(yǎng)基（YPD）酵母膏10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，瓊脂 15 g，蒸餾水定容至1 000 mL，pH7.0。種子培養(yǎng)基 葡萄糖 30 g，NaNO37 g，NaH2PO40.5 g，K2SO40.1 g，蒸餾水定容至1 000 mL，pH 7.2。發(fā)酵培養(yǎng)基 葡萄糖 20 g，玉米淀粉 10 g，豆粕 30 g，橄欖油 5 g，NaNO310 g，NaH2PO42 g，K2SO40.2 g，CaCO35 g，蒸餾水定容至1 000 mL，pH7.2。

1.2 方法

1.2.1 菌株培養(yǎng)方法 斜面種子培養(yǎng)方法：將-80℃保藏的菌株冷凍管，用接種針取1環(huán)均勻涂布于斜面培養(yǎng)基表面，于30℃恒溫靜置培養(yǎng)7 d，制備成斜面種子，于3-5℃冰箱保存?zhèn)溆谩u瓶種子培養(yǎng)方法：將斜面種子用接種針取1環(huán)接種于裝有30 mL種子培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中，于30℃恒溫220 r/min振蕩培養(yǎng)20-32 h，見培養(yǎng)液渾濁，OD600值為0.24-0.5，得到搖瓶種子液備用。搖瓶發(fā)酵方法：選用500 mL搖瓶，發(fā)酵培養(yǎng)基裝量為50 mL。搖瓶接種量按照裝量的1.5%進行轉(zhuǎn)種。培養(yǎng)溫度為30℃恒溫培養(yǎng)，220 r/min振蕩培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)時間66 h。培養(yǎng)好的發(fā)酵液在10 000 r/min，4℃低溫下離心10 min，取上清液檢測脂肪酶活性。

侵入巖比較發(fā)育，主要為位于礦區(qū)南部約8km處面積約60km2花崗巖，為華力西中期第二次侵入花崗巖，呈不規(guī)則狀巖基侵入于大哈拉軍山組內(nèi)，亦見有閃長巖、花崗閃長巖、輝長巖、輝綠巖呈小巖株、巖脈存在。阿爾恰勒鉛鋅礦床附近主要見有輝綠巖脈。

1.2.2 單因素實驗方法 在搖瓶中分別對于發(fā)酵過程的接種量、搖瓶裝量、培養(yǎng)時間、培養(yǎng)溫度等進行單因素實驗，篩選出對酶活性影響較為顯著的因素和合理的取值范圍。

1.2.3 RSM方法 采用“Design-Expert 8.0”軟件，以脂肪酶活性為響應(yīng)值，對單因素實驗得到的較為顯著的影響因素進行RSM設(shè)計（表1）。采用BBD模型，得到4因素3水平共29組的試驗設(shè)計，實驗為3批，每批平行3瓶。實驗得到的數(shù)據(jù)在“ Design-Expert 8.0”軟件中的BBD模型對數(shù)據(jù)進行擬合和分析，通過ANOVA分析得到二次多項式，最終確定最優(yōu)化發(fā)酵條件。

1.2.4 SDS-PAGE電泳分析 取發(fā)酵液上清20 μL，加入5 μL Loading Buffer（5×），進行SDS-PAGE電泳分析，電泳完畢后用考馬斯亮藍R250染色過夜，然后脫色獲得清晰的電泳條帶為止。

1.2.5 脂肪酶活性測定方法 以堿滴定法測定發(fā)酵液中脂肪酶活性。取1 mL發(fā)酵液上清液，加入5 mL橄欖油和4 mL的glycine-NaCl緩沖液（pH9.4，50 mmol/L）振蕩混勻，在36℃孵育15 min，加入20 mL的95%乙醇和10 mL的30% NaCl溶液終止反應(yīng)。脂肪酶活性單位定義為，在一定溫度和pH條件下，1 min水解底物產(chǎn)生1 μmol的可滴定的脂肪酸，即為1個酶活單位，以U/mL表示［15，16］。

表1 BBD方法試驗的變量范圍

2 結(jié)果

2.1 搖瓶發(fā)酵條件的單因素優(yōu)化

首先采用單因素實驗，對接種量、搖瓶裝量、發(fā)酵培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)溫度等4個主要的發(fā)酵條件進行初步的研究。根據(jù)A.niger G62s菌種的發(fā)酵特性，確定各個待考察因素水平，對于各個因素的取值范圍比較寬，以保證試驗結(jié)果能夠覆蓋高值點。取值范圍為接種量為0.5%-4.0%，搖瓶裝量為30-100 mL，發(fā)酵培養(yǎng)溫度為25-45℃，發(fā)酵培養(yǎng)時間為48-96 h（圖1-圖4）。

圖1 搖瓶接種量對于脂肪酶活性的影響（n=9）

圖2 搖瓶裝量對于脂肪酶活性的影響（n=9）

圖3 培養(yǎng)溫度對于脂肪酶活性的影響（n=9）

圖4 培養(yǎng)時間對于脂肪酶活性的影響（n=9）

G62s菌株在接種量為0.5%時發(fā)酵不穩(wěn)定，增加接種量有利于菌株產(chǎn)脂肪酶。當接種量增加至2%時，發(fā)酵液的脂肪酶活性最高。而接種量繼續(xù)增加，在大于2.5%時菌株產(chǎn)酶能力隨之降低（圖1）。搖瓶裝量的改變主要是影響通氣量，當搖瓶裝量≥50 mL時，菌株產(chǎn)酶能力趨于穩(wěn)定，隨著搖瓶裝量的增加，菌種的產(chǎn)酶能力沒有顯著降低（圖2），說明該菌株發(fā)酵過程對于搖瓶裝量和通氣量的要求不高。培養(yǎng)溫度可以影響菌種產(chǎn)脂肪酶的穩(wěn)定性和能力。本實驗的結(jié)果（圖3）顯示，適于G62s產(chǎn)脂肪酶的發(fā)酵培養(yǎng)溫度在30-32℃之間，溫度過低或過高都不利于脂肪酶的產(chǎn)生。最適發(fā)酵培養(yǎng)時間則為66-78 h，延長發(fā)酵培養(yǎng)時間到84 h脂肪酶活性顯著降低（圖4）。通過單因素考察，確定發(fā)酵條件為：接種量為2.0%，搖瓶裝量為50 mL（500 mL搖瓶），培養(yǎng)溫度為30℃，培養(yǎng)時間為72 h。

在單因素實驗基礎(chǔ)上，采用Design-Expert 8.0軟件RSM的BBD設(shè)計，針對于影響發(fā)酵的接種量（A），搖瓶裝量（B），培養(yǎng)溫度（C），培養(yǎng)時間（D）進行優(yōu)化分析，以脂肪酶活性為響應(yīng)值（Y），選擇4因素，3水平，共29組實驗，其中有6組為中心點重復(fù)實驗（表2）。

表2 BBD實驗設(shè)計及結(jié)果

將得到的數(shù)據(jù)，輸入至Design-Expert 8.0軟件中，進行多元回歸擬合，得到Y(jié)值對編碼自變量A、B、C、D的二元多次回歸方程為：

Y = 2 085.8 + 70.67 A + 33.75 B + 63.92 C + 83.33 D - 43.25 AB + 10.5 AC - 77.25 AD - 54.75 BC - 19.75 BD - 54.5 CD - 100.15 A2- 26.53 B2- 75.02 C2- 77.9 D2

在該擬合方程的基礎(chǔ)上，對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析和模型方差分析（表3）。結(jié)果顯示，模型決定系數(shù)R2=0.934 5， 信噪比Adeq Precision = 13.22，表明方程的擬合度與可信度較高，實驗誤差較小。所選用的模型的P值檢驗顯著（P＜0.000 1），說明方程擬合度較好。失擬項P = 0.098 3（P＞0.05），說明失擬項差異不顯著，模型產(chǎn)生的殘差值是由隨機誤差引起。由此可以認為該模型的選擇合理，并且能夠?qū)憫?yīng)值Y進行分析和預(yù)測。

根據(jù)表3對于模型所列4個變量的方差分析，在檢驗項P＜0.05的說明該項的影響是顯著的，否則為不顯著。該模型的一次項A，B，C，D、二次項A2，C2，D2以及交互項中AD，BC，CD對于Y值影響顯著（P ＜ 0.05）。其中，交互項AD影響最大（P=0.003＜0.05），即接種量與培養(yǎng)時間之間的交互作用最大。而其他的3個交互項AB、AC、BD，則對于Y值影響不顯著（P ＞ 0.05）。

表3 脂肪酶活性的回歸方程及模型方差分析a

根據(jù)方差分析得出AD、BC、CD交互項對于Y值的影響（圖5）。進一步對于回歸方程進行求導(dǎo)，得到極值點，即Y最大化時各個因素水平的取值。由軟件預(yù)測可得，接種量（A）為1.9%，搖瓶裝量（B）為56 mL（500 mL搖瓶），培養(yǎng)溫度（C）為30℃，培養(yǎng)時間（D）為75 h。并預(yù)測在此優(yōu)化的條件下，G62s菌株的產(chǎn)脂肪酶活性為2 121 U/mL。

圖5 因素交互作用對于脂肪酶活性的響應(yīng)面分析

2.3 SDS-PAGE分析結(jié)果

按照RSM優(yōu)化前后的發(fā)酵條件對于G62s菌株的發(fā)酵液進行SDS-PAGE分析，結(jié)果（圖6）顯示在箭頭所指位置出現(xiàn)了明顯的蛋白條帶，說明發(fā)酵條件優(yōu)化前后所產(chǎn)脂肪酶的相對分子量沒有改變。根據(jù)軟件Gel-pro 3.0計算，該條帶的分子量約為33.2 kD。

圖6 G62s的SDS-PAGE分析

2.4 驗證實驗

按照RSM優(yōu)化后的搖瓶發(fā)酵條件對于G62s菌株進行驗證實驗，并檢測脂肪酶活性，以驗證RSM得到的預(yù)測值。試驗進行3批，每批平行3瓶。結(jié)果（表4）可見，優(yōu)化的發(fā)酵條件其脂肪酶活性為2 129 ± 39.9 U/mL，與預(yù)測值相符（相差0.4%）。與初始發(fā)酵條件下發(fā)酵比較，脂肪酶活性提高16.7%（C.V. = 1.87%，P ＜ 0.01，差異顯著），說明經(jīng)過RSM優(yōu)化后菌株的產(chǎn)脂肪酶活性獲得了穩(wěn)定提高。

表4 發(fā)酵條件的驗證試驗（n = 9）

3 討論

近年來，微生物發(fā)酵產(chǎn)生代謝物的研究越來越多，由于培養(yǎng)基的內(nèi)在條件（培養(yǎng)基組成、濃度等）及外在條件（發(fā)酵溫度、時間、通氣量等）都會影響微生物的生長與代謝產(chǎn)物的積累，因此對于發(fā)酵培養(yǎng)條件的優(yōu)化成為了研究的熱點［17］。在微生物的發(fā)酵實驗中單因素方法可以最直接、有效地反應(yīng)各個因素對于菌株影響，廣泛應(yīng)用于發(fā)酵條件的優(yōu)化和菌株的特性考察［18-20］。響應(yīng)面法是一種有效的統(tǒng)計方法，可以在更廣泛的范圍內(nèi)考慮因素的組合、預(yù)測響應(yīng)值，比一次次的單因素分析方法和正交試驗更有效，因此，響應(yīng)面法會更加廣泛應(yīng)用于發(fā)酵培養(yǎng)基工藝條件優(yōu)化的研究中。響應(yīng)面分析的關(guān)鍵因素包括：選擇合適的研究對象及合適的實驗水平，建立一個可信的有效的模型。評估相關(guān)性，預(yù)測響應(yīng)值考察模型的準確性等［17，21］。王揮等［22］采用單因素試驗和RSM對黑曲霉產(chǎn)單寧酶的搖瓶發(fā)酵條件進行優(yōu)化，確定單寧濃度、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間為發(fā)酵產(chǎn)酶影響最大的因素。其最適產(chǎn)酶條件為：培養(yǎng)溫度31.7℃，轉(zhuǎn)速180 r/min，單寧濃度1.5%，初始pH6.0，接種量10%，裝液量20%，培養(yǎng)時間72 h，得到的酶活力最高值1 141.82 U/mL。吳茜茜等［23］采用單因素試驗和RSM優(yōu)化設(shè)計了黑曲霉（A. niger PZ321）發(fā)酵異淀粉酶的搖瓶培養(yǎng)條件，篩選出硝酸銨、接種量、培養(yǎng)溫度3個主要因素，確定了最優(yōu)化培養(yǎng)條件為接種量2%，30℃培養(yǎng)72 h，酶活為137.3 μ/mL；比基礎(chǔ)培養(yǎng)基提高了1.71倍。本研究通過單因素方法結(jié)合BBD優(yōu)化，得到了影響G62s菌株脂肪酶產(chǎn)量的主要影響因素，分析各因素之間的相互關(guān)系，得到了最優(yōu)化的搖瓶發(fā)酵條件。其中，搖瓶接種由最初的1.5%提高到1.9%；搖瓶裝量由50 mL提高到56 mL；培養(yǎng)溫度30℃不變；培養(yǎng)時間由66 h延長到75 h，在最佳搖瓶發(fā)酵條件組合下，黑曲霉G62s的脂肪酶產(chǎn)量可以增至（2 129±39.9）U/mL，提高了16.7%。本研究結(jié)果與上述報道比較，盡管發(fā)酵的酶有差異，但是均為黑曲霉的發(fā)酵，其優(yōu)化結(jié)果基本一致。G62s菌株發(fā)酵SDS-PAGE分析結(jié)果顯示，搖瓶發(fā)酵條件改變沒有影響脂肪酶的相對分子量。說明采用單因素試驗和RSM優(yōu)化法，對提高黑曲霉脂肪酶產(chǎn)量是很有效的。

4 結(jié)論

黑曲霉G62s優(yōu)化后的搖瓶發(fā)酵條件：在裝液量56 mL的500 mL搖瓶中，1.9%接種量，于30℃培養(yǎng)時間75 h可得到最優(yōu)化的脂肪酶產(chǎn)量。

G62s菌株在優(yōu)化后的發(fā)酵條件下發(fā)酵得到脂肪酶活性為（2 129±39.9）U/mL，與模型預(yù)測值相符，脂肪酶活性提高16.7%，而且發(fā)酵穩(wěn)定。在單因素實驗的基礎(chǔ)上通過RSM方法優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)條件，顯著提高了目標菌株的脂肪酶產(chǎn)量。

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（責任編輯 李楠）

The Optimization of Flask Fermentation Conditions for the Production of Extracellular Lipase from Aspergillus niger

Zhang Qian1Jia Jia2Lin Zhi2Yang Xiaofeng3Guo Hongtao2Wang Jianying2Carol Sze Ki Lin3
（1. Shenzhen Institute Technology，Shenzhen 518116；2. Shenzhen Leveking Bio-engineening Co.，LTD，Guangdong Shenzhen 518055；3. School of Energy and Environment，City University of Hong Kong，Hong Kong）

Aspergillus niger G62s is a genetically stable strain of producing high-yield lipase. This work is to have statistic optimization for the flask fermentation conditions of G62s aiming at increasing the capacity of strain yielding lipase. Firstly， using single-factor test， the effects of these 4 parameters， i.e.， the inoculation amount， working volume， culture temperature and culture time， on the lipase yield were studied. Then the key parameters of fermentation conditions were statistically optimized through the response surface methodology（RSM）with 4 factors in 3 levels. The optimal conditions were 1.9% inoculum size in 56 mL working volume（in 500 mL flasks）at 30oC for 75 h. Using these conditions，the activity of lipase reached 212 9±39.9 U/mL， increased 16.7% comparing to that of the initial fermentation conditions. In conclusion， based on the single-factor test of 4 fermentation factors affecting the lipase yield of G62s， optimization by RSM significantly increased the yield of the target strain.

Aspergillus niger；lipase；single-factor test；response surface methodology；optimization of fermentation conditions

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.12.033

2015-03-18

深圳市科技創(chuàng)新委員會技術(shù)創(chuàng)新計劃項目（CXZZ20130425111508558）

張謙，男，高級工程師，研究方向：工業(yè)微生物及發(fā)酵工程；E-mail：qianz@yeah.net