曹研研，張洪斌*，李若菡，劉　昆

（合肥工業(yè)大學醫(yī)學工程學院，安徽 合肥　230009）

棘孢青霉菌發(fā)酵產(chǎn)右旋糖酐酶的條件優(yōu)化

曹研研，張洪斌*，李若菡，劉昆

（合肥工業(yè)大學醫(yī)學工程學院，安徽 合肥230009）

為優(yōu)化棘孢青霉菌F1001產(chǎn)右旋糖酐酶的發(fā)酵條件，以培養(yǎng)基裝載量、蛋白胨和右旋糖酐T70添加量為主要影響因素，結合其他發(fā)酵條件，在單因素試驗的基礎上，運用Box-Behnken試驗設計原理，探討培養(yǎng)基裝載量、蛋白胨和右旋糖酐T70添加量的最佳組合。結果表明，蛋白胨添加量3 g/L、右旋糖酐T70添加量14 g/L、培養(yǎng)基裝載量85 mL/250 mL，右旋糖酐酶活力最高可達到453 U/mL，比優(yōu)化前提高88%。通過測定發(fā)酵過程中酶活力、pH值、蛋白質含量的變化，進一步驗證發(fā)酵84 h酶活力達到最大，此時蛋白質含量達到最高，pH值達到3.9。

棘孢青霉；右旋糖酐酶；響應面分析；發(fā)酵條件

功能性低聚糖一般是由2～10 個單糖通過糖苷鍵連接起來形成直鏈或者支鏈的一類糖，它們常被作為益生元調(diào)整腸道菌群結構和調(diào)節(jié)腸道功能［1-2］。右旋糖酐酶能夠催化葡聚糖中的α-1，6糖苷鍵斷裂，釋放出異麥芽糖，異麥芽三糖等功能性低聚異麥芽糖［3］。而低聚異麥芽糖常作為益生元被應用于食品工業(yè)［4］，因此高酶活力的右旋糖酐酶制備功能性低聚糖逐漸成為一種新的發(fā)展趨勢。右旋糖酐酶作為生物催化劑，反應條件溫和且無污染，在制糖工業(yè)等過程中起到重要作用。右旋糖酐酶能減少甚至避免右旋糖酐帶來的經(jīng)濟問題，可改善糖產(chǎn)品的濾過性、設備平滑性、增加糖的回收率、降低產(chǎn)品的黏度［5］。此外，右旋糖酐酶還廣泛應用于醫(yī)藥、化工等多個行業(yè)［6-9］。

根據(jù)酶的作用位點和作用方式的不同，把右旋糖酐酶分為內(nèi)切右旋糖酐酶（endodextranases，EC3.2.1.11）和外切右旋糖酐酶（exodextranases EC3.2.1.70）。內(nèi)切右旋糖酐酶是隨機攻擊右旋糖酐內(nèi)部α-1，6糖苷鍵，產(chǎn)生小糖且效率較高。外切右旋糖酐酶是從大分子右旋糖酐的非還原端依次降解。右旋糖酐酶是一種誘導酶，右旋糖酐以及改良后的酮基右旋糖常作為誘導物［10］。

右旋糖酐酶在自然界中分布比較廣泛，在微生物、動物、人體組織以及燕窩胚芽鞘中都有發(fā)現(xiàn)［11-12］。然而人們對細菌、酵母菌、霉菌等［13-15］微生物產(chǎn)右旋糖酐酶的研究較多。一般霉菌所產(chǎn)的右旋糖酐酶是胞外內(nèi)切右旋糖酐酶，且比細菌和酵母菌產(chǎn)的右旋糖酐酶活力略高［16-17］。早在20世紀70年代，國外學者就開始研究真菌產(chǎn)右旋糖酐酶，Chaiet等［18］報道繩狀青霉能夠產(chǎn)生內(nèi)切右旋糖酐酶，90年代國內(nèi)最早由孫晉武等［19］篩選出淡紫擬青霉和焦曲霉產(chǎn)生右旋糖酐酶。盡管近年來對霉菌產(chǎn)右旋糖酐酶研究的較多，但是酶活力并不理想。朱慧霞等［20］研究的繩狀青霉菌發(fā)酵產(chǎn)右旋糖酐酶活力僅為18.963 U/mL，Mohamed等［21］報道的一株青霉-258產(chǎn)生的右旋糖酐酶活力為41.8 U/mL。這樣的酶活力在工業(yè)應用中會帶來產(chǎn)物分布不均勻、雜質較多、產(chǎn)品分離困難等問題。由于酶活力并不理想使大工業(yè)產(chǎn)酶受到限制，因此提高右旋糖酐酶活力具有重要研究和應用價值。本實驗室從土壤中篩選出F1001菌，并通過形態(tài)特征和ITS rDNA序列分析方法鑒定菌株［22］，對該菌株產(chǎn)右旋糖酐酶做了一些初步探索。本實驗在單因素試驗結果基礎上運用響應面分析優(yōu)化的方法詳細探索了棘孢青霉菌F1001產(chǎn)右旋糖酐酶最優(yōu)發(fā)酵條件，以期獲得最高酶活力。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

棘孢青霉菌（Penicillium aculeatum）F1001由合肥工業(yè)大學醫(yī)學工程學院制藥工程系篩選得到，4 ℃平板保存。右旋糖酐T70由本實驗室制備，烘干后常溫保存。

3，5-二硝基水楊酸（3，5-dinitrosalicylic acid，DNS）和考馬斯亮藍G250由實驗室自行配制，常溫避光保存。

1.2培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯20 g/L、葡萄糖2 g/L、瓊脂20 g/L，自然pH值，0.1 MPa滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：右旋糖酐T70 15 g/L、蛋白胨5 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、KCl 0.5 g/L、K2HPO4·3H2O 1 g/L、FeSO4·7H2O 0.01 g/L，pH 5.5，0.1 MPa滅菌20 min。

1.3培養(yǎng)方法

1.3.1斜面活化培養(yǎng)方法

挑菌在斜面上劃線，在28 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)84 h。

1.3.2搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)方法

從斜面上挑菌接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，揺瓶培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為：250 mL錐形瓶裝入80 mL培養(yǎng)基，在200 r/min、28 ℃條件下培養(yǎng)72 h。

1.3.3分析測定方法

右旋糖酐酶活力測定采用還原糖測定方法——DNS法［23］：發(fā)酵液在4 ℃、8 000 r/min離心5 min，取上清液，稀釋一定的倍數(shù)，調(diào)水浴鍋至35 ℃。將4 mL 0.02 mol/L pH 5.0的醋酸鹽緩沖液配制的30 g/L右旋糖酐T70溶液置于35 ℃保溫10 min，取1 mL稀釋的酶液加入。保溫1 h后取樣500 μL，加入DNS 375 μL，沸水煮沸5 min，冷卻至室溫定容至終體積5.375 mL。以滅活的酶液作為對照，每分鐘產(chǎn)生1 μmol還原糖所需的酶量定義為一個酶活力單位（U）。

蛋白質含量的測定采用Bradford法［24］，即采用考馬斯亮藍G250與稀釋一定倍數(shù)的發(fā)酵液在常溫下反應5 min后，在595 nm波長處測定吸光度。

發(fā)酵過程中pH值采用pH計測量：在最優(yōu)條件下發(fā)酵棘孢青霉，每12 h取樣一次，用標準溶液調(diào)節(jié)好的pH計進行測定。

1.4發(fā)酵培養(yǎng)條件的優(yōu)化

1.4.1單因素試驗

單因素試驗考察碳源、氮源、初始pH值等單因素對棘孢青霉F1001產(chǎn)右旋糖酐酶的影響。其他發(fā)酵條件不變，培養(yǎng)基的裝載量為80 mL/250 mL。碳源質量濃度為10 g/L，加入5 g/L右旋糖酐作為誘導物。所選碳源包括：果糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、葡萄糖、右旋糖酐T70、右旋糖酐T40、右旋糖酐T500。氮源包括有機氮源和無機氮源，有機氮源含有豐富的天然氨基酸有利于菌體的生長代謝，而無機氮源更容易被菌體利用，因此考察有機氮源和無機氮源聯(lián)合使用對棘孢青霉菌產(chǎn)酶的情況很有必要。本試驗選用蛋白胨、胰蛋白胨、酵母浸膏、牛肉膏4 種有機氮源，加入培養(yǎng)基的質量濃度為5 g/L，無機氮源包括（NH4）2SO4、NH4NO3、NaNO3、NH4Cl、尿素，加入培養(yǎng)基的質量濃度為10 g/L。所選用的初始pH值為4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0。

1.4.2響應面試驗設計

1.4.2.1 Plackett-Burman試驗設計

在單因素試驗結果的基礎上以及各種發(fā)酵條件中對右旋糖酐T70、蛋白胨和NaNO3的添加量以及培養(yǎng)基裝載量、初始pH值、發(fā)酵溫度、接種量和發(fā)酵時間8 個因素進行八因素二水平的Plackett-Burman試驗設計，選用N=12的試驗設計，找出影響其產(chǎn)酶的重要因素，做兩組平行試驗取平均值。

1.4.2.2最陡爬坡試驗

根據(jù)Plackett-Burman試驗結果，找出重要因素。把擬合出的方程相關系數(shù)作為爬坡方向和步長變化的依據(jù)。然后進行最陡爬坡試驗，找到接近最大響應區(qū)域的中心組合點。

1.4.2.3中心組合試驗設計與響應面分析方法

根據(jù)最陡爬坡試驗的結果，對培養(yǎng)基裝載量、右旋糖酐T70和蛋白胨添加量進行中心組合試驗。以右旋糖酐酶酶活力為響應值，設計三因素三水平試驗，試驗次數(shù)N=15的響應面分析試驗。其中12 個為析因點，3 個為零點，零點試驗進行3 次，以估計誤差。做兩組平行試驗，試驗結果取3 次試驗的平均值。用統(tǒng)計軟件Design-Expert 8.0.6對試驗進行回歸分析，其中回歸系數(shù)的顯著性用t檢驗評價，回歸方程的顯著性用F檢驗評價，方程的擬合程度由相關性系數(shù)R2決定。

1.5驗證實驗

對響應面分析方法得出的模型進行驗證，做兩組平行試驗取平均值。發(fā)酵條件為：NaNO3添加量3 g/L、蛋白胨添加量3 g/L、右旋糖酐T70添加量14 g/L，其他培養(yǎng)基成分不變，pH 4.5，棘孢青霉菌按照體積分數(shù)2%接入裝85 mL/250 mL培養(yǎng)基中，在200 r/min、28 ℃條件下培養(yǎng)84 h。在此發(fā)酵過程中，分別對發(fā)酵液的pH值、上清液的右旋糖酐酶活力以及蛋白質含量的變化進行探究，找出有利于產(chǎn)酶的一般規(guī)律。

2　結果與分析

2.1單因素試驗篩選最適碳源、氮源、初始pH值

2.1.1最適碳源的篩選

本實驗選取8 種不同碳源，分別是果糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、葡萄糖、右旋糖酐T70、右旋糖酐T40、右旋糖酐T500，質量濃度均為10 g/L。圖1是各種碳源對棘孢青霉菌產(chǎn)右旋糖酐酶的結果。其中右旋糖酐T70、右旋糖酐T500為碳源時酶活力較高，酶活力分別為240.8 U/mL和259.1 U/mL，考慮到大分子右旋糖酐不易溶于水，所以選用右旋糖酐T70。

圖1　碳源對棘孢青霉菌產(chǎn)右旋糖酐酶活力的影響Fig.1　Effect of carbon sources on the activity of dextranase

2.1.2最適氮源的篩選

關于最佳氮源的篩選，首先篩選出最佳有機氮源，然后篩選出最佳無機氮源。利用有機氮源含有豐富的氨基酸和無機氮源容易被菌體利用的原則，找出兩類氮源對棘孢青霉菌產(chǎn)右旋糖酐酶最佳配比。圖2所示為最佳有機氮源和無機氮源分別為蛋白胨和NaNO3。二者單獨作為氮源時，酶活力均達到230 U/mL以上。二者共同作為氮源時，酶活力明顯提高，因此把蛋白胨和NaNO3作為影響因素列入Plackett-Burman試驗設計中進行下一步考察。

圖2　氮源對棘孢青霉菌產(chǎn)右旋糖酐酶活力的影響Fig.2　Effect of nitrogen sources on the activity of dextranase

2.1.3初始pH值的選擇

配制初始pH值分別為4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0的培養(yǎng)基，其他成分按照1.2節(jié)所述配制。結果如圖3所示，pH 4.5時，棘孢青霉菌產(chǎn)右旋糖酐酶活力最高，隨著pH值的增加，酶活力降低。當培養(yǎng)基溶液偏于中性時，酶活力幾乎為0 U/mL。

圖3　初始pH值對產(chǎn)右旋糖酐酶的影響Fig.3　Effect of initial pH on dextranase production

2.2Plackett-Burman試驗設計篩選重要影響因素

根據(jù)棘孢青霉菌所需營養(yǎng)的基本原則和發(fā)酵條件影響因素的一般規(guī)律，選取8 個因素進行試驗，每個因素有低水平和高水平，原始條件是高低水平的中間位置，試驗次數(shù)N=12。Plackett-Burman試驗設計結果見表1。

表1　Plackett-Burman試驗設計及結果Table 1 Plackett-Burman design with experimental results

表2　Plackett-Burman試驗設計各因素水平效應評價Table 2　Evaluation of the effects of factors at two different levels in Plackett-Burman design　ign

采用響應面法［25］對發(fā)酵條件中主效應分析結果見表2，經(jīng)過分析檢驗，得到可信度＞95%的3 個因素為：培養(yǎng)基裝載量、右旋糖酐T70添加量和蛋白胨添加量。

2.3最陡爬坡試驗

根據(jù)Plackett-Burman試驗結果分析，可以看出培養(yǎng)基裝載量、右旋糖酐T70添加量和蛋白胨添加量對棘孢青霉產(chǎn)右旋糖酐酶有顯著影響。其他因素對產(chǎn)酶情況的影響不顯著，因此在下一步對培養(yǎng)基的優(yōu)化中不予考慮。由回歸方程的各項系數(shù)可知，培養(yǎng)基裝載量（X1）前面的系數(shù)為正值，蛋白胨添加量（X3）和右旋糖酐T70添加量（X6）系數(shù)為負值，這表明增大培養(yǎng)基裝載量，降低蛋白胨添加量和右旋糖酐T70添加量對產(chǎn)右旋糖酐酶有利。因此，對培養(yǎng)基裝載量、右旋糖酐T70添加量和蛋白胨添加量這3 個因素進行最陡爬坡試驗［26］。試驗設計如表3所示，兩組平行試驗，結果取3 次平均值。由試驗結果可知，3號試驗的酶活力最高，3號試驗中，培養(yǎng)基裝載量為85 mL/250 mL，所以3號試驗的各種條件接近于中心組合試驗的中心點。

表3　最陡爬坡試驗設計與結果Table 3 Steepest ascent design with experimental results

2.4Box-Behnken試驗設計和結果分析

表4　Box-Behnken試驗設計與結果Table 4　Box-Behnken design with experimental results

對Box-Behnken試驗設計與結果見表4，結果分析見表5，同時擬合出一個二次多項式方程：

該方程表明了培養(yǎng)基裝載量、蛋白胨添加量和右旋糖酐T70添加量與右旋糖酐酶活力的關系?；貧w方程的決定系數(shù)R2為0.983 5，離回歸標準差0.286 2，表明該回歸方程的擬合度較好。

表5　響應面回歸方程分析Table 5 Analysis of variance （ANOVA） for the response surface quadratic model

圖4　培養(yǎng)基裝載量和蛋白胨添加量的交互作用對產(chǎn)右旋糖酐酶的影響Fig.4　Effect of medium volume and peptone content on dextranase production

圖5　培養(yǎng)基裝載量和右旋糖酐T70添加量的交互作用對產(chǎn)右旋糖酐酶的影響Fig.5　Effect of culture volume and dextran T70 content on dextranase production

圖6　右旋糖酐T70添加量和蛋白胨添加量的交互作用對產(chǎn)右旋糖酐酶的影響Fig.6　Effect of dextran T70 content and peptone content on dextranase production

圖4～6為響應面立體分析圖，從圖中可直觀地看出各因子對響應者的變化趨勢，且回歸模型存在最大值，穩(wěn)定點（X1、X3、X6）的代碼值為（0、0、0），對應的實際值為培養(yǎng)基的裝載量為85 mL/250 mL、蛋白胨添加量為3 g/L、右旋糖酐T70添加量為14 g/L，其達到的酶活力最大值為453 U/mL。通過對最優(yōu)產(chǎn)酶發(fā)酵條件的模型進行驗證，進行3 次驗證實驗，結果產(chǎn)酶量分別為454、452、450 U/mL，平均值452 U/mL，與模型的預測值基本一致，因此該模型能夠較好地預測實際產(chǎn)右旋糖酐酶情況。而發(fā)酵條件未優(yōu)化前測得的右旋糖酐酶活力為240.8 U/mL，因此優(yōu)化后右旋糖酐酶的活力比未優(yōu)化的酶活力提高了88%。

2.5產(chǎn)酶培養(yǎng)基相關參數(shù)的變化

發(fā)酵過程中每12 h取樣一次，144 h結束發(fā)酵，分別測發(fā)酵液的pH值、上清液的右旋糖酐酶活力以及蛋白質含量。每組實驗有兩組平行對照，取3 組實驗的平均值。結果見圖7。

圖7　產(chǎn)酶培養(yǎng)基發(fā)酵過程中相關參數(shù)的變化Fig.7　Changes in parameters related to dextranase production during fermentation

由圖7a可知，第24小時開始檢測到右旋糖酐酶活力，36～72 h期間，酶活力呈線性增長， 72～84 h時，酶活力增長趨勢處于平穩(wěn)狀態(tài)，84 h時酶活力達到最高值453 U/mL，此后酶活力開始下降。由圖7b可知，發(fā)酵開始時pH值由初始的5.5逐漸降低直至96 h時pH值降至最低，隨著發(fā)酵的繼續(xù)pH值又呈現(xiàn)上升趨勢，144 h后pH值開始呈堿性。由圖7c可知，蛋白質含量隨著時間的變化逐漸增大至84 h后蛋白質含量波動較小，發(fā)酵液上清稀釋5 倍后通過吸光度表現(xiàn)出來。發(fā)酵產(chǎn)酶過程中，酶活力、pH值、蛋白質含量均是不斷變化的，三者之間也有著復雜的關系。驗證了在84 h時酶活力達到最高，此時發(fā)酵液的pH值為3.9，蛋白質含量最高。

3　結 論

本實驗用響應面分析對右旋糖酐酶產(chǎn)生菌棘孢青霉F1001發(fā)酵條件進行優(yōu)化，取得了較好的效果。根據(jù)響應面結果分析，最佳產(chǎn)酶條件為：當培養(yǎng)基裝載量為250 mL錐形瓶裝85 mL培養(yǎng)基、蛋白胨添加量為3 g/L、右旋糖酐T70添加量為14 g/L，右旋糖酐酶酶活力模型值最大可達到453 U/mL。在優(yōu)化后的條件下?lián)u瓶發(fā)酵產(chǎn)右旋糖酐酶平均值為452 U/mL與模型預測值接近，發(fā)酵產(chǎn)酶比優(yōu)化前提高了88%。通過測定發(fā)酵過程中酶活力、pH值、蛋白質含量的變化，進一步驗證發(fā)酵84 h酶活力達到最大，此時蛋白含量達到最高，pH值為3.9。

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Optimization of Fermentation Conditions for Dextranase Production by Penicillium aculeatum

CAO Yanyan， ZHANG Hongbin*， LI Ruohan， LIU Kun
（School of Medical Engineering， Hefei University of Technology， Hefei230009， China）

The fermentation conditions for dextranase production by Penicillium aculeatum F1001 were optimized using a Box-Behnken design with response surface methodology. The optimal fermentation conditions were determined as follows： peptone 3 g/L， dextran T70 14 g/L， and medium loading， 85 mL in a 250-mL flask. Under these conditions，dextranase activity was 453 U/mL， indicating an 88% improvement over that before optimization. The changes in dextranase activity， pH and protein content during the fermentation process verified that dextranase activity reached its highest level at 84 h， when the pH was 3.9.

Penicillium aculeatum； dextranase； response surface analysis； fermentation conditions

Q815

A

1002-6630（2015）23-0215-06

10.7506/spkx1002-6630-201523040

2015-01-14

安徽省自主創(chuàng)新專項（合肥工業(yè)大學2013秋實計劃）（2013AKKG0391）；省級大學生創(chuàng)新訓練計劃項目（2015CXCYS093）

曹研研（1990—），女，碩士研究生，研究方向為生物制藥與酶工程。E-mail：caoyan168@126.com

張洪斌（1970—），男，教授，博士，研究方向為生物制藥與酶工程。E-mail：zhb5678@163.com