石學(xué)慧　張素蘭　曹夏　王凌燕　段霞　劉未艾　張志萍△

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，湖南長(zhǎng)沙410005；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南長(zhǎng)沙410208）

·研究報(bào)告·

巨刺對(duì)局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織VEGF和Ang-1蛋白表達(dá)的影響*

石學(xué)慧1張素蘭2曹夏2王凌燕2段霞2劉未艾1張志萍1△

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，湖南長(zhǎng)沙410005；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南長(zhǎng)沙410208）

目的觀察巨刺對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織VEGF和Ang-1蛋白表達(dá)的影響，探討巨刺治療腦缺血再灌注損傷可能的作用機(jī)制。方法雄性SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為空白組、假手術(shù)組、模型組、健側(cè)針刺（即巨刺法）組、患側(cè)針刺組。各組再分為3 d和14 d兩個(gè)亞組。采用改良線栓法制備腦缺血再灌注損傷大鼠模型。于再灌注24 h后，健側(cè)針刺組針刺人中、百會(huì)及電針健側(cè)穴位；患側(cè)針刺組針刺人中、百會(huì)及電針患側(cè)穴位。電針選用疏密波，每次持續(xù)刺激30 min，每日1次。分別于3 d和14 d光鏡下觀察大鼠缺血腦組織結(jié)構(gòu)；采用免疫組化法（S-ABC法）測(cè)定大腦皮質(zhì)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）和血管生成素-1（Ang-1）蛋白表達(dá)的變化。結(jié)果針刺治療后大鼠缺血區(qū)腦組織損傷程度明顯改善，其中健側(cè)針刺組較患側(cè)針刺組改善明顯；健側(cè)針刺組、患側(cè)針刺組VEGF及Ang-1的表達(dá)均較模型組增多（P＜0.05）；而健側(cè)針刺組的表達(dá)較患側(cè)針刺組顯著增多（P＜0.05）。結(jié)論巨刺能夠明顯改善再灌注損傷大鼠缺血區(qū)腦組織損傷程度，其機(jī)制可能與上調(diào)腦組織VEGF和Ang-1表達(dá)有關(guān)。

巨刺腦缺血再灌注損傷血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子血管生成素-1腦組織

近年來我國(guó)缺血性腦血管病發(fā)病呈現(xiàn)年輕化的趨勢(shì)，且致殘率居高不下。研究表明，缺血缺氧刺激和臨床溶栓藥物的使用在血管再通、血流供應(yīng)恢復(fù)的同時(shí)往往帶來再灌注損傷。腦缺血再灌注損傷是指缺血腦組織恢復(fù)血供后，腦組織損傷反而進(jìn)一步加重。針灸不僅能治療缺血性腦病，而且對(duì)防治腦缺血再灌注損傷方面也取得了一定成效［1］。巨刺治療中風(fēng)偏癱古已有之，現(xiàn)代報(bào)道亦療效滿意，并且具有普通針刺所不具備的可配合運(yùn)動(dòng)療法、不加重患側(cè)痙攣程度等優(yōu)點(diǎn)。然而相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究較少，缺乏客觀的指標(biāo)說明其治療機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血后微血管新生促進(jìn)血流恢復(fù)和氧供的同時(shí)為神經(jīng)再生和突觸發(fā)生創(chuàng)造了條件，影響神經(jīng)功能恢復(fù)，也決定著預(yù)后。而血管生成與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）和血管生成素（Ang）這兩種主要的促血管生成因子密切相關(guān)。VEGF作用于血管形成早期，促進(jìn)原始血管網(wǎng)形成；Ang則作用于隨后的血管改建，促進(jìn)形成成熟的血管網(wǎng)。因此本實(shí)驗(yàn)觀察巨刺對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織VEGF和血管生成素-1（Ang-1）蛋白表達(dá)的影響，探討巨刺治療腦缺血再灌注損傷可能的作用機(jī)制。現(xiàn)報(bào)告如下。

1　材料與方法

1.1動(dòng)物清潔級(jí)健康SD雄性大鼠140只，體質(zhì)量（260±20）g，湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，在實(shí)驗(yàn)前與實(shí)驗(yàn)中分批購(gòu)入，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（湘）2013-0004，飼養(yǎng)溫度20～25℃，相對(duì)濕度50%～70%。

1.2實(shí)驗(yàn)材料電針儀，M6805-Ⅰ型；華佗牌31號(hào)0.5寸無菌針灸針；VEGF、Ang-1免疫組化（S-ABC法）試劑盒由武漢博士德生物工程有限公司提供。

1.3模型制備造模方法參照Z(yǔ)ea Longa線栓法制備模型［2］，栓塞2 h后拔出魚線再灌注。假手術(shù)組不阻塞大腦中動(dòng)脈，插線深度5 mm左右，其余手術(shù)步驟同模型組。造模動(dòng)物在自然蘇醒后，按照Z(yǔ)ea-Longa神經(jīng)缺損體征評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分［2］。造模后即刻評(píng)分，為1～3分者納入實(shí)驗(yàn)，未達(dá)標(biāo)準(zhǔn)者剔除。

1.4分組與干預(yù)采用隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組、假手術(shù)組各20只；造模組60只，造模后再分為模型組、健側(cè)針刺組、患側(cè)針刺組；各組再分為3 d亞組和14 d亞組，各10只；其余40只備用?？瞻捉M、假手術(shù)組、模型組正常喂養(yǎng)3 d和14 d。健側(cè)針刺組（即巨刺組）針刺人中、百會(huì)及健側(cè)肢體曲池、合谷、足三里、三陰交行電針治療；患側(cè)針刺組針刺人中、百會(huì)及患側(cè)肢體曲池、合谷、足三里、三陰交行電針治療。取穴定位、針刺深度均參照中國(guó)針灸學(xué)會(huì)實(shí)驗(yàn)針灸研究會(huì)華興邦等制定的《常用動(dòng)物腧穴圖譜》［3］。電針治療波形選用疏密波，電流強(qiáng)度1 mA，以大鼠觸須、耳朵微動(dòng)為度，每次持續(xù)刺激30 min。在缺血再灌注24 h后行第1次電針治療，每日1次。

1.5標(biāo)本采集與檢測(cè)每組大鼠分別于3 d和14 d行最后一次治療后取材，深度麻醉后以預(yù)冷的0.9%氯化鈉注射液左心室灌流沖洗，換經(jīng)預(yù)冷的4%多聚甲醛固定，斷頭取腦，制備石蠟切片，取大腦皮質(zhì)缺血區(qū)為觀察部位，以相鄰切片用于HE染色和免疫組化。HE染色后于400倍光鏡下觀測(cè)各組皮質(zhì)區(qū)缺血腦組織形態(tài)學(xué)改變。免疫組化檢測(cè)腦組織缺血區(qū)及周圍VEGF、Ang-1的表達(dá)情況：免疫組化步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。結(jié)果判定以胞漿染成棕黃色為陽(yáng)性細(xì)胞。每例大鼠選3張切片，每張切片隨機(jī)選3個(gè)視野進(jìn)行攝像（400倍），用IPP6.0圖像處理分析軟件分別對(duì)VEGF、Ang-1的陽(yáng)性細(xì)胞的平均光密度進(jìn)行分析。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。計(jì)量資料以（±s）表示，均進(jìn)行正態(tài)性、方差齊性檢驗(yàn)，各組組間差異采用單因素方差分析，若方差齊時(shí)采用LSD檢驗(yàn)，不服從正態(tài)性和（或）方差不齊時(shí)用非參數(shù)檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1各組腦組織常規(guī)病理染色結(jié)果見圖1?？瞻捉M、假手術(shù)組大腦皮質(zhì)：細(xì)胞層次整齊，結(jié)構(gòu)完整，具有完整細(xì)胞核和豐富的胞漿，染色均勻。模型組大腦皮質(zhì)：細(xì)胞數(shù)顯著減少，細(xì)胞層次模糊、不完整，排列疏松，細(xì)胞形態(tài)腫脹不規(guī)則，梗死灶邊緣可見壞死細(xì)胞。健側(cè)針刺組：細(xì)胞數(shù)多于模型組，層次豐富，排列緊密，部分神經(jīng)細(xì)胞完整，壞死細(xì)胞數(shù)量較模型組明顯減少?；紓?cè)針刺組：與健側(cè)針刺組比較，組織結(jié)構(gòu)較疏松，間質(zhì)稍見水腫，壞死細(xì)胞數(shù)量較健側(cè)針刺組稍多。

圖1　光鏡下各組大鼠缺血腦組織結(jié)構(gòu)（400倍）

2.2各組動(dòng)物VEGF和Ang-1表達(dá)水平比較見表1?？瞻捉M、假手術(shù)組的腦缺血及周圍組織均有少量VEGF和Ang-1表達(dá)，兩者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與空白組、假手術(shù)組相比，其他3組的VEGF、Ang-1表達(dá)均顯著增加（P＜0.01）；與模型組比較，健側(cè)針刺組和患側(cè)針刺組VEGF、Ang-1表達(dá)較前者上升（P＜0.05）；健側(cè)針刺組與患側(cè)針刺組相比，前者優(yōu)于后者（P＜0.05）。

表1　各組大鼠3 d、14 d后大腦皮質(zhì)VEGF、Ang-1蛋白表達(dá)的比較（±s）

表1　各組大鼠3 d、14 d后大腦皮質(zhì)VEGF、Ang-1蛋白表達(dá)的比較（±s）

與空白組、假手術(shù)組比較，△P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05；與健側(cè)針刺組比較，☆P＜0.05。

組別n空白組10假手術(shù)組10模型組10健側(cè)針刺組10患側(cè)針刺組10 3 d亞組0.138±0.035 0.124±0.031 0.260±0.052△0.375±0.064△*0.316±0.066△*☆14 d亞組0.132±0.026 0.141±0.036 0.242±0.052△0.359±0.065△*0.298±0.063△*☆

3　討論

“巨刺”首見于《內(nèi)經(jīng)》，屬于九刺法之一。早在元代杜思敬的《濟(jì)生拔粹·針經(jīng)摘英集》就有關(guān)于巨刺治療腦卒中的明確記載。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為缺血性中風(fēng)是由于氣血瘀滯、腦脈痹阻、竅閉神匿、肌膚筋脈失于濡養(yǎng)，肢體失用所致。而巨刺法是運(yùn)用全身經(jīng)絡(luò)系統(tǒng)相互溝通、聯(lián)系的特點(diǎn)，通過刺激健側(cè)經(jīng)絡(luò)，調(diào)動(dòng)正氣，借健側(cè)經(jīng)絡(luò)間接達(dá)到疏通患側(cè)氣血，改善患側(cè)肢體經(jīng)絡(luò)阻滯不通、針感較差、不容易得氣的特點(diǎn)。因此，本實(shí)驗(yàn)以針刺健側(cè)肢體作為實(shí)驗(yàn)組，以針刺患肢作對(duì)照。通過人中、百會(huì)醒腦調(diào)神導(dǎo)氣；內(nèi)關(guān)調(diào)理心神、疏通氣血；曲池疏通肢體經(jīng)絡(luò)；足三里補(bǔ)虛健運(yùn)、調(diào)和氣血；三陰交補(bǔ)三陰、益肝腎、調(diào)氣血。根據(jù)經(jīng)絡(luò)理論，人體經(jīng)絡(luò)系統(tǒng)是通過臟腑組織和奇經(jīng)八脈相互溝通，且部分經(jīng)絡(luò)左右交叉。因此，左右側(cè)經(jīng)絡(luò)在生理上是互相聯(lián)系，在病理上是相互影響。現(xiàn)代解剖學(xué)同樣可以為巨刺治療中風(fēng)偏癱提供理論依據(jù)［4］。

缺血性腦血管病的現(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療主要有超早期溶栓治療、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞，其目的在于盡快恢復(fù)血供和重建神經(jīng)結(jié)構(gòu)。而神經(jīng)細(xì)胞的增殖并不是單獨(dú)發(fā)生的，神經(jīng)前體細(xì)胞的增殖與血管的生成密切相關(guān)。因此通過對(duì)血管再生的研究就可以大致了解和掌握神經(jīng)元再生的情況。VEGF是已知的促進(jìn)血管生長(zhǎng)作用最強(qiáng)的細(xì)胞因子，VEGF/VEGFR系統(tǒng)激活使內(nèi)皮細(xì)胞增生并誘導(dǎo)新生血管形成，增加受累腦組織再灌注及供氧量，從而減輕缺血再灌注損傷。Ang-1可以抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，減輕腦缺血后血腦屏障的滲漏從而減少梗死體積，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的出芽與遷移。研究表明，針灸治療缺血性腦病具有促進(jìn)血管新生的作用［5］。因此，本研究以VEGF、Ang-1為檢測(cè)指標(biāo)。而局灶性腦缺血大鼠缺血腦組織VEGF在缺血第3日達(dá)高峰［6］。Ang-1于第14日達(dá)高峰［7］。故本實(shí)驗(yàn)分別于3 d和14 d檢測(cè)缺血腦組織VEGF、Ang-1的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)觀察到，手術(shù)創(chuàng)傷對(duì)腦內(nèi)血管內(nèi)皮細(xì)胞VEGF及Ang-1的表達(dá)無明顯影響；模型組VEGF及Ang-1的表達(dá)上升，說明腦缺血時(shí)，腦組織在一定程度上會(huì)自發(fā)性地出現(xiàn)血管新生，這與劉媛媛等的研究結(jié)果相一致［8］；健側(cè)針刺組、患側(cè)針刺組VEGF及Ang-1的表達(dá)均較模型組明顯增多，而健側(cè)針刺組較患側(cè)針刺組明顯，說明針刺可以改善腦缺血再灌注損傷大鼠缺血腦組織損傷程度，實(shí)現(xiàn)對(duì)腦缺血損傷的保護(hù)作用，而巨刺的效果更明顯。巨刺可調(diào)節(jié)促血管生成相關(guān)因子，改善腦缺血后病側(cè)腦的血液循環(huán)，通過促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增生并誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞遷移，新生血管形成，改善腦病灶及周圍腦細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)，從而改善缺血區(qū)腦組織的損傷程度。其作用可能是通過上調(diào)VEGF、Ang-1來實(shí)現(xiàn)的，這可能是巨刺治療腦缺血再灌注損傷的機(jī)制之一。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道相符合［9］。但有文獻(xiàn)報(bào)道VEGF也增加血管的通透性，可以導(dǎo)致腦水腫進(jìn)而加重缺血性腦損害［10］。因此，巨刺的作用機(jī)制可能是多層次的，具體是哪些因子在起主導(dǎo)作用，又或是抑制了哪些細(xì)胞因子，有待進(jìn)一步的研究。本研究提示了針刺與VEGF、Ang-1可能存在必然聯(lián)系，從血管生成的角度初步探討巨刺治療缺血再灌注損傷的作用機(jī)制，為進(jìn)一步探索巨刺的作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Effects of Opposing Needling on the Expression of VEGF and Ang-1 in Brain Tissue in Rats with Focal Cerebral Ischemia-reperfusion Injury

SHI Xuehui，ZHANG Sulan，CAO Xia，et al.The Second Affiliated Hospital，Hunan University of TCM，Hunan，Changsha 410005，China

Objective：To observe the effects of opposing needling on the expression of VEGF and Ang-1 in brain tissue in rats with focal cerebral ischemia-reperfusion injury and explore the possible mechanism of the opposing needling for treating rats with focal cerebral ischemia-reperfusion injury.Methods：One hundred SD male rats were randomly divided into the blank group，the sham-operated group，the model group，the unaffected-side acupuncture group（opposing needling group）and the affected-side acupuncture group，with twenty rats in each group.And groups were divided into 3d subgroup and 14d subgroup.The model of focal cerebral ischemia-reperfusion was established by inserting nylon thread into the internal carotid artery.Twenty-four hours after reperfusion，Unaffected-side acupuncture group，as well as Affected-side acupuncture group，was treated with"renzhong"，"baihui"and electro-acupuncture.Electro-acupuncture was chosen with constant stimulation of the density wave for thirty minutes every day.The ultrastructure of brain tissue on 3 rd and 14 th day after focal cerebral ischemia reperfusion was observed with the optical microscope.And the expression of VEGF and Ang-1 in cerebral cortex tissue was detected with immunehistochemical method.Results：The degree of ischemic brain tissue damage in rats was improved significantly after acupuncture.But the unaffected-side acupuncture group had an more obvious improvement than that of the affected-side acupuncture group.In comparison with the sham group，the expression of VEGF and Ang-1 in unaffected-side acupuncture group and affected-side acupuncture group increased significantly（P＜0.05）.And the expression of VEGF and Ang-1 in unaffected-side acupuncture group was more than that in the affected-side acupuncture group（P＜0.05）.Conclusion：Opposing needling can greatly improve the injury of ischemia reperfusion of brain tissue in rats，which may be related to its effect in up regulating VEGF an-d Ang-1 after the ischemia-reperfusion injury.

Opposing needling；Ischemia-reperfusion；VEGF；Ang-1；Brain tissue

R285.5

A

1004-745X（2015）09-1525-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.09.007

2015-04-22）

湖南省科技計(jì)劃項(xiàng)目（S2014S2033）

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