劉煥奇，黃海涵，肖繼友，胡學(xué)遠(yuǎn)，王龍光

（1. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東青島　266109；2. 山東省青島第二中學(xué)，山東青島　266032；3. 煙臺(tái)市芝罘區(qū)動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，山東煙臺(tái)　264000）

不同系統(tǒng)進(jìn)化群雞源大腸桿菌耐藥性調(diào)查分析

劉煥奇1，黃海涵2，肖繼友3，胡學(xué)遠(yuǎn)1，王龍光1

（1. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東青島266109；2. 山東省青島第二中學(xué)，山東青島266032；3. 煙臺(tái)市芝罘區(qū)動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，山東煙臺(tái)264000）

［目的］通過(guò)系統(tǒng)進(jìn)化群和耐藥性分析，了解雞源大腸桿菌致病菌株的分布情況及耐藥特征，為有效控制雞大腸桿菌病提供依據(jù)。［方法］采用微量肉湯稀釋法測(cè)定菌株耐藥表型（M?C），采用PCR法檢測(cè)耐藥基因和系統(tǒng)進(jìn)化群分群試驗(yàn)，采用SPSS17.0軟件進(jìn)行差異顯著性分析。［結(jié)果］低致病群B1（38.1%）和非致病群A（34.0%）菌株分布相對(duì)較多，其次是高致病群D（21.2%）和B2（6.2%）；分離菌株對(duì)氨芐西林（87.2%）、四環(huán)素（87.0%）、復(fù)方新諾明（87.0%）和磺胺異噁唑（80.0%）耐藥嚴(yán)重，多重耐藥率高達(dá)98.86%，但對(duì)多粘菌素E敏感；耐藥基因sull（71.0%）、sul2（44.8%）、sul3（18.7%）、tetA（42.2%）、tetB（15.8%）、tetM（7.3%）均有檢出，tetC、tetO、tetK、tetL、tetW均未檢出，9.13%菌株同時(shí)攜帶3種sul基因，僅有一株菌同時(shí)攜帶3種tet基因。表型耐藥菌株攜帶耐藥基因的能力明顯高于非耐藥菌株（P＜0.05）。高致病群B2、D群耐藥程度較B1和A群嚴(yán)重，對(duì)氧氟沙星、慶大霉素、大觀霉素、頭孢噻呋、磺胺異噁唑、復(fù)方新諾明、奧格門(mén)丁等7種藥物差異顯著（P＜0.05）。［結(jié)論］我國(guó)雞源大腸桿菌高致病菌株檢出率高，且耐藥程度相對(duì)嚴(yán)重，在適宜條件下更易導(dǎo)致雞群發(fā)病且難以控制。

雞大腸桿菌；系統(tǒng)進(jìn)化群；致病性；耐藥性

禽致病性大腸桿菌（Escherichia .coli，E.coli）能引發(fā)禽大腸桿菌病，可引起胚胎死亡、臍炎、敗血癥、肉芽腫、卵黃性腹膜炎、全眼球炎、氣囊病、禽蜂窩織炎、腫頭綜合癥、腹膜炎、輸卵管炎、滑膜炎等一系列病癥，不僅給養(yǎng)禽業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，而且也與人類腸外致病性大腸桿菌密切相關(guān)。它是毒力基因和耐藥基因的貯存宿主，可引發(fā)人類食源性疾病，且耐藥性和致病性的結(jié)合可造成該類疾病更加難以預(yù)防與治療。系統(tǒng)進(jìn)化群分析是利用PCR技術(shù)對(duì)大腸桿菌分離菌株進(jìn)行分群檢測(cè)，主要依靠出現(xiàn)chuA、yjaA基因和TspE4.C2非編碼區(qū)區(qū)分，可快速獲得具有不同致病能力的菌株群，對(duì)研究其生態(tài)分布和遺傳進(jìn)化具有重要參考價(jià)值［1］。本研究采用PCR法對(duì)雞源大腸桿菌進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化群分析，了解不同系統(tǒng)進(jìn)化群雞源大腸桿菌致病菌株的分布情況，結(jié)合耐藥性檢測(cè)結(jié)果，分析致病菌群與低/非致病菌群之間的耐藥差異，對(duì)臨床合理用藥和細(xì)菌性疾病的防治具有重要的實(shí)際意義。

1 材料

1.1實(shí)驗(yàn)菌株

438株雞源大腸桿菌（從表觀健康雞泄殖腔拭子分離獲得）以及O2標(biāo)準(zhǔn)菌株，均由中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心動(dòng)物產(chǎn)品安全監(jiān)測(cè)室提供。大腸桿菌ATCC25922，購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.2主要試劑和儀器

胰蛋白胨大豆肉湯、LB肉湯、Mueller-Hinton肉湯、瓊脂粉，購(gòu)自北京陸橋生物技術(shù)有限公司；GoTaqGreen Master Mix、DNA Marker DL2000和瓊脂糖，購(gòu)自TaKaRa公司；96孔藥敏板、含氨芐西林/AM、奧格門(mén)丁/AC、頭孢噻呋/CEF、慶大霉素/GM、大觀霉素/SPT、四環(huán)素/TE、多西環(huán)素/DOX、氟苯尼考/FFC、磺胺異噁唑/SF、復(fù)方新諾明/SXT、氧氟沙星/OFL、恩諾沙星/ENR、多粘菌素E/CLE等13種藥物，購(gòu)自天津市金章科技發(fā)展有限公司；

電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海愛(ài)朗SL?-700型）、快速渦勻器（深圳天南海北SK-1）、PCR儀（B?ORAD）、電泳儀（北京六一儀器廠）和Gel Doc XR凝膠成像分系統(tǒng)（B?O-RAD）。

2 方法

2.1系統(tǒng)進(jìn)化群分群試驗(yàn)

chuA和yjaA基因以及DNA片段TspE4.C2等3對(duì)引物序列由上海生物工程有限公司合成，具體見(jiàn)表1。根據(jù)分群標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化群分群［2］。

表1　chuA基因、yjaA基因和DNA片段 TspE4.C2的引物序列

PCR擴(kuò)增體系25 μL，包括上下游引物各0.5 μL、模板2 μL。

PCR反應(yīng)條件：94℃ 5 min，94℃ 45 s，60℃45 s，72℃ 50 s，共35個(gè)循環(huán)，72℃ 5 min。

2.2耐藥表型檢測(cè)

按CLS?推薦的微量肉湯稀釋法進(jìn)行測(cè)定和判讀，具體實(shí)驗(yàn)步驟根據(jù)藥敏板說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

2.3耐藥基因型檢測(cè)

根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)及GenBank中發(fā)表的基因序列，使用Primer5.0軟件分別設(shè)計(jì)出磺胺和四環(huán)素類抗藥基因共11對(duì)特異性引物，引物序列（表2）由上海生物工程有限公司合成。

表2　磺胺和四環(huán)素類藥物耐藥基因引物序列

PCR擴(kuò)增體系25μL，包括上下游引物各0.5μL、模板2μL。

PCR反應(yīng)條件：sull、sul2、sul3，94℃5min，94℃45s，60℃45s，72℃50s，35個(gè)循環(huán)，72℃5min。tetA、tetB、tetC、tetM、tetO、tetL、tetK、tetW，94℃5min，94℃45s，60℃45s，72℃45s，30個(gè)循環(huán)，72℃5min。

2.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS17.0軟件對(duì)兩組樣本率X2檢驗(yàn)或兩尾Fisher精確檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。當(dāng)P＜0.05時(shí)差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1系統(tǒng)進(jìn)化群分群結(jié)果

438株雞源大腸桿菌中，B1群和A群菌相對(duì)較多，分別占38.1%（167/438）和34.0%（149/438），D群占21.2%（93/438），而B(niǎo)2群菌株最少為6.2%（27/438）。不同基因片段PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果見(jiàn)圖1。

3.2耐藥表型檢測(cè)結(jié)果

438株雞源大腸桿菌對(duì)13種藥物的藥敏試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。耐藥嚴(yán)重的是氨芐西林、四環(huán)素和磺胺類（耐藥率≥80%），多粘菌素E最為敏感；多重耐藥問(wèn)題突出，433株為多重耐藥菌株，多重耐藥率高達(dá)98.9%，耐7種藥以上的菌株占77.2%。結(jié)果見(jiàn)表3。

3.3耐藥基因檢測(cè)結(jié)果

菌株P(guān)CR產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示sul2基因檢出率最高，檢出率為71.0%，其次是sull（44.8%）和sul3（18.7%）。同時(shí)攜帶3種磺胺類耐藥基因的檢出率為9.1%（40株）；tetA檢出率為42.2%，tetB為15.8%，tetM為7.3%，其中有1株菌同時(shí)攜帶3種tet基因，tetC、tetO、tetL、tetK、tetW未檢出。耐藥基因檢出情況見(jiàn)表4；PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果分別見(jiàn)圖2和圖3。

圖1　不同基因片段PCR產(chǎn)物電泳圖

表3　438株雞源大腸桿菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果

表4 雞E.coli耐藥基因檢測(cè)情況

藥物種類　　引物　　引物序列（5 ' -3 '）　　產(chǎn)物大小（b p）四環(huán)素類t e t K　F：T A T T T T G G C T T T G T A T T C T T T C A T　1 1 5 9 R：G C T A T A C C T G T T C C C T C T G A T A A t e t L　F：A T A A A T T G T T T C G G G T C G G T A A T　1 0 7 7 R：A A C C A G C C A A C T A A T G A C A A T G A T t e t W　F：G A G A G C C T G C T A T A T G C C A G C　1 6 8 R：G G G C G T A T C C A C A A T G T T A A C

3.4耐藥表型與耐藥基因型相關(guān)性分析

差異比較分析顯示，表型耐藥菌株攜帶耐藥基因的能力顯著高于非耐藥菌株（p＜0.05），說(shuō)明耐藥性與耐藥基因攜帶有關(guān)，即耐藥表型與基因型呈一定相關(guān)性。但耐藥基因檢出率低于其相應(yīng)抗菌藥耐藥率，可能是含有其它耐藥基因或耐藥機(jī)制，見(jiàn)表5。

圖2　sull，sul2 和sul3 PCR電泳產(chǎn)物結(jié)果

圖3　tetA，tetB 和tetM PCR電泳產(chǎn)物結(jié)果

表5　耐藥表型與耐藥基因型相關(guān)性分析

表6　不同系統(tǒng)進(jìn)化群大腸桿菌菌株耐藥情況比較

3.5 不同系統(tǒng)進(jìn)化群大腸桿菌菌株耐藥結(jié)果比較

高致病群B2和D群菌株的耐藥程度相對(duì)嚴(yán)重，其中OFL、GM、SPT、EFT、SF、SXT、A/C等7種藥物差異顯著（P＜0.05）；多重耐藥問(wèn)題相對(duì)突出，高耐菌株比例高于B1和A群菌株，79.2%的菌株耐8～12種藥物，具體見(jiàn)表6。

3.6不同系統(tǒng)進(jìn)化群大腸桿菌菌株耐藥基因比較

通過(guò)系統(tǒng)進(jìn)化群與耐藥基因型差異顯著性分析，可見(jiàn)sull、sul2、tetA、tetB、tetM基因多見(jiàn)于高致病群B2和D群（P＜0.05），但sul3在不同系統(tǒng)進(jìn)化群中的分布無(wú)明顯差（P=0.486）。說(shuō)明部分耐藥基因與大腸桿菌致病性存在一定相關(guān)性，見(jiàn)表7。

表7　耐藥基因型與系統(tǒng)進(jìn)化群相關(guān)性

4 討論

大腸桿菌系統(tǒng)進(jìn)化群可以分為4個(gè)群：A、B1、B2和D，依靠chuA、yjaA基因和TspE4.C2非編碼區(qū)區(qū)分。A和B1群常存在于共生株，而B(niǎo)2和D群屬于攜帶毒力相關(guān)基因的條件腸外病原體［1］。系統(tǒng)進(jìn)化群的分布不僅是由動(dòng)物種類，而且是由其健康狀態(tài)和地理位置決定的。Pilar Corte’s等［3］研究發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)進(jìn)化群在豬和雞分布顯著不同，豬中A群菌株更加流行，而D群和禽源分離株相關(guān)。Tetsuo Asai等［4］研究發(fā)現(xiàn)不同病死動(dòng)物大腸桿菌系統(tǒng)進(jìn)化群分布不同，A（49.4%）和D（44.9%）主要分布于雞源大腸桿菌，且B2群僅分離自患病雞。Obeng AS等［5］研究了南澳大利亞251株禽大腸桿菌，結(jié)果發(fā)現(xiàn)32.3%～39.4%的分離株屬于共生群（A和B1），11.2%～17.1%屬于毒力群（B2和D），17株多重耐藥菌株屬于B2和D群。巴西和日本的研究也顯示，B2群很少出現(xiàn)在健康牛、雞和豬大腸桿菌中［6］。Rodriguez等［7］研究美國(guó)患病家禽大腸桿菌發(fā)現(xiàn)，A群（38%）和D群（28%）分布較多，B2群檢出率為19%。本實(shí)驗(yàn)顯示，共生群A和B1檢出率與其他國(guó)家相似，但高致病群存在差異，D群菌株檢出率比多數(shù)國(guó)家高出10%，并從健康雞中分離到B2群菌株，其它國(guó)家未見(jiàn)報(bào)道。說(shuō)明我國(guó)雞大腸桿菌毒力較強(qiáng)，在適宜條件下更易導(dǎo)致家禽發(fā)病。

近年來(lái)禽源大腸桿菌的耐藥譜不斷擴(kuò)大，耐藥程度日趨嚴(yán)重，多重耐藥問(wèn)題突出。只帥等［8］對(duì)陜西省304份雞大腸桿菌進(jìn)行了耐藥性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)多數(shù)抗菌藥的耐藥率超過(guò)了50%。李昆明等［9］檢測(cè)了河南17株禽大腸桿菌對(duì)24種抗菌藥的耐藥情況，對(duì)21種藥物耐藥率大于70%，其中10種藥物的耐藥率高達(dá)90%～100%。楊澤曉等［10］對(duì)四川87株大腸桿菌進(jìn)行26種抗菌藥的耐藥性檢測(cè)，受試菌株均有不同程度多重耐藥，對(duì)青霄素G（100%）、強(qiáng)力霉素（89.66%）、復(fù)方阿莫西林（85.20%）、四環(huán)素（82.76%）、頭孢氨芐（63.22%）、頭孢噻吩（52.87%）和復(fù)方新諾明（51.72%）的耐藥性較強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)顯示，438株雞源大腸桿菌耐藥情況與以往報(bào)道相似，對(duì)氨芐西林（87.2%）、四環(huán)素（87.0%）、復(fù)方新諾明（87.0%）和磺胺異噁唑（80.0%）耐藥嚴(yán)重，且耐藥譜較廣，77.2%菌株對(duì)7種以上藥物耐藥。

耐藥表型與攜帶的耐藥基因呈一定相關(guān)性，但不同的國(guó)家和地區(qū)sul和tetA優(yōu)勢(shì)基因并不一樣，很多研究報(bào)道發(fā)現(xiàn)sul1是磺胺類藥物分布最廣的基因［11-12］，而腸道桿菌所攜帶的四環(huán)素類抗藥基因主要是tetA、tetB和tetC［13-14］。本實(shí)驗(yàn)也顯示，分離菌株對(duì)磺胺類和四環(huán)素類藥物耐藥與其攜帶的sul1（71.00%）、sul2（44.75%）、sul3（18.72%）以及tetA（42.2%）、tetB（15.8%）、tetM（7.3%）有關(guān)。

已有報(bào)道系統(tǒng)進(jìn)化群可能與耐藥性的散播有關(guān)聯(lián)［15］。本研究也發(fā)現(xiàn)，除了四環(huán)素外，B2和D群菌株對(duì)其余12種抗菌藥的耐藥率均高于B1和A群菌株，其中OFL、GM、SPT、EFT、SF、SXT、A/C等 7種藥物差異顯著（P＜0.05）；79.17%的B2和D群菌株耐8～12種藥物，而B(niǎo)1和A群耐8～12種藥物的菌株則有56.92%。說(shuō)明高致病群B2和D群菌株的耐藥程度相對(duì)嚴(yán)重，但與Johnson J.R.和Picard B等［9-10］報(bào)道臨床B2大腸桿菌分離株的抗菌藥耐藥性低于非B2分離株的結(jié)果不一致。

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（責(zé)任編輯：朱迪國(guó)）

Antibiotical Resistance Investigation and Analysis of Chicken Originated E.coli Strains of Different Phylogenetic Groups

Liu Huanqi1，Huang Haihan2，Xiao jiyou3，Hu Xueyuan1，Wang Longguang1
（1. Department of Animal Science，Qingdao Agricultural University，Qingdao，Shandong 266109；2. Qingdao No.2 Middle School of Shandong Province，Qingdao，Shandong 266061；3. Zifu District Animal Health Supervision ?nstitute，Yantai，Shandong264000）

［Objective］The aim of the study is to know the distribution and drug-resistance of pathogenic poultry-originated E.coli strains through phylogenetic group and drug resistance analysis，and provide

for prevention and control of chicken colibacillosis.［Method］The antimicrobial susceptibility （M?C） was detected by mini broth dilution susceptibility test，the resistance gene and phylogenetic groups were detected by PCR and the significance of difference was analyzed by SPSS17.0 software. ［Result］The low pathogenic group B1（38.13%） and the nonpathogenic group A（34.02%）were more distributed than the highly pathogenic group D （21.23%） and B2（6.16%）. The resistance of 438 E.coli isolates to ampicillin （87.2%），tetracycline （87.0%），sulfamethoxazole/trimethoprim （87.0%） and sulfisoxazole（80.0%） was serious，multiple resistance rate was up to 98.86%，but the isolates were sensitive to colistin E. The resistance gene sull （71.0%），sul2 （44.8%），sul3 （18.7%），tetA （42.2%），tetB （15.8%） and tetM （7.3%） existed in E.coli isolates，but tetC，tetO，tetK，tetL and tetW were not found.9.13% isolates carried 3 sul genes，and only 1 isolate carried 3 tet genes. The ability of resistant isolates to carry resistance genes was significantly higher than the non-resistant ones（P＜0.05）. The resistance of the strains from highly pathogenic group B2and D was higher than the strains from group B1and A，and there was significant difference to the seven drugs such as ofloxacin，gentamicin，spectinomycin，ceftiofur，sulfisoxazole，sulfamethoxazole/trimethoprim，amoxicillin/clavulanic acid （P＜0.05）.［Conclusion］The ratio of highly pathogenic strains of chicken-originated E.coli in China was high，and the drug-resistance was relatively serious，likely result in poultry diseases under the suitable conditions and difficulty to control .

chicken originated E.coli；phylogenetic groups；pathogenicity；drug-resistance.

S852.61

B

1005-944X（2015）11-0016-06

“十二五”科技基礎(chǔ)性工作專項(xiàng)（項(xiàng)目編號(hào)：2012FY111000）