賴明廣 青海濤 王立生 劉圣活

大腸癌是常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率一直呈上升趨勢(shì)，在全球惡性腫瘤發(fā)病率中已上升至第三位，并以每年2%的速度增長(zhǎng)［1］;在我國，大腸癌死亡率也上升至惡性腫瘤死亡率的第五位［2］。MicroRNA是近10多年來生命領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，其中miR－34a是重要的腫瘤抑制生長(zhǎng)的因子，它可以調(diào)節(jié)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程，已被證實(shí)在結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展中起著非常重要的作用;我們的前期研究也證實(shí)miR－34a可以增加SW480細(xì)胞對(duì)5－FU的敏感性［3－4］，但目前對(duì)miR－34a在腸癌中的作用仍缺少系統(tǒng)、全面的分析。本文第一部分利用生物信息方法篩選 miR－34a的靶基因，并分析靶基因所參與的信號(hào)通路與生物學(xué)功能;第二部分通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR－34a通過靶向調(diào)控SIRT1、NOTCH1基因的表達(dá)而抑制SW480細(xì)胞的增殖，為明確大腸癌的發(fā)病機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480來源于南方醫(yī)科大學(xué)附屬南方醫(yī)院消化病研究所，miR－34a mimics及其對(duì)照均購自上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司，胎牛血清購自杭州四季青公司，Lipofectamine2000購自 Invitrogen公司;DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司，兔抗人SIRT1、NOTCH1購自Cell Signaling公司，兔抗人β－actin、辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗及發(fā)光試劑盒均購自Santa Cruz公司。

1.2 方法

1.2.1 miR－34a靶基因預(yù)測(cè)及功能網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 通過檢索miRTarBase 數(shù)據(jù)庫(http://mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw)和 miRBase數(shù)據(jù)庫(http://www.mirbase.org/index.shtml)，篩選出已經(jīng)被實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了的miR－34a靶基因，使用Cytoscape3.2.1的ClueGo和CluePedia插件和DAVID 6.7數(shù)據(jù)庫對(duì)篩選出的靶基因進(jìn)行GO分析和功能富集分類，KEGG對(duì)miR－34a的所有靶基因進(jìn)行信號(hào)通路富集分析。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 SW480細(xì)胞培養(yǎng)于含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基，置37℃、5%C02、濕度充分條件下常規(guī)培養(yǎng)培養(yǎng)，每2～3 d傳代1次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)染前1天取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的SW480細(xì)胞，1.5×106/孔的細(xì)胞數(shù)鋪六孔板，待細(xì)胞融合率達(dá) 60%時(shí)用陽離子脂質(zhì)體Lipofectamine 2000分別將50 nmol/L miR－34amimic、negative control(對(duì)照組)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，轉(zhuǎn)染方法嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行;轉(zhuǎn)染成功或準(zhǔn)備好的細(xì)胞分組后進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 Western blot檢測(cè)基因 SIRT1、NOTCH1蛋白表達(dá) 利用Lipofectamine 2000將miR－34a mimics或 mimics的對(duì)照轉(zhuǎn)染至SW480細(xì)胞，48 h后收集各組細(xì)胞，用PBS洗滌細(xì)胞2次，加入細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞。BCA法蛋白定量后以每孔20 μg總蛋白上樣，跑膠分離，轉(zhuǎn)膜，兔抗人多克隆一抗 SIRT1(1∶500)和NOTCH1(1∶1 000)4℃孵育過夜，TBST洗膜，二抗 37℃孵育2 h，ECL法顯色，凝膠成像儀照相后保存。

1.2.4 MTT法檢測(cè)miR－34a對(duì) SW480細(xì)胞增殖的抑制作用

各組SW480細(xì)胞接種于96孔板中培養(yǎng)(5×103個(gè)/孔)，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。待檢測(cè)的細(xì)胞每孔加入 MTT(5.0 g/L)20 μl后置孵育4 h，棄去上清，再加入二甲基亞砜150 μl。30 min后用酶標(biāo)儀檢測(cè)570 nm處的光密度值，連續(xù)5 d。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用 SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，單因素方差分析，p＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR－34a特異性靶基因及通路富集分析

通過檢測(cè)miRTarBase和miRBase數(shù)據(jù)庫，篩選出已經(jīng)驗(yàn)證的 miR－34a靶基因共56個(gè);包括 NOTCH1、SIRT1、BCL2、VEGFA、NOTCH2、FOXP1等，用 DAVID數(shù)據(jù)庫中的 KEGG對(duì)篩選出的靶基因進(jìn)行信號(hào)通路富集分析，取p＜0.001;FDR＜0.05;共富集到8條通路，包含Pathways in cancer，Small cell lung cancer以及本文研究的Colorectal cancer，具體見表1。

表1 miR－34a靶基因通路富集情況

2.2 靶基因基因基因富集分析與互作網(wǎng)絡(luò)圖

為了探究miR－34a靶基因之間是否存在相互作用，我們將篩選出的56個(gè)基因借助 Cytoscape3.2.1軟件中的 ClueGo和CluePedia插件進(jìn)行分析并繪制基因互作網(wǎng)絡(luò)。分析發(fā)現(xiàn)這些基因調(diào)控相關(guān)的生物學(xué)功能，根據(jù)參與程度前三位分別為Wnt Signaling Pathway and Pluripotency、Pathways in cancer、MicroRNAs in cancer，也包含Notch signaling pathway(見圖1);互作網(wǎng)絡(luò)圖顯示了靶基因之間的相互作用和生物學(xué)功能分類，其中基因SIRT1、NOTCH1是相互作用網(wǎng)絡(luò)圖中的重要節(jié)點(diǎn)，提示他們可能扮演著重要的角色(見圖2)。

2.3 miR－34a通過負(fù)向調(diào)控SIRT1、NOTCH1表達(dá)阻滯SW480細(xì)胞的增殖

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比較，miR－34amimics轉(zhuǎn)染組的SIRT1、NOTCH1蛋白水平明顯下降，兩者比較差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (p＜0.01)(見圖3);細(xì)胞生長(zhǎng)曲線顯示miR－34a mimics轉(zhuǎn)染組細(xì)胞與對(duì)照組細(xì)胞相比，長(zhǎng)速度明顯減慢，在接種5 d后比較兩組有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 (p＜0.01)(見圖4)。結(jié)果提示 miR－34a可能通過負(fù)性調(diào)控 SIRT1、NOTCH1的表達(dá)而抑制SW480細(xì)胞的增殖。

3 討論

MicroRNA是一種大小為19－25bp的單鏈、小分子、非編碼RNA，它可以通過與其靶mRNA的3＇－UTR區(qū)結(jié)合，引發(fā)mRNA降解或抑制靶基因的表達(dá);miRNA在腫瘤的形成過程中扮演重要角色［5］。miR－34家族是近年來研究較多的一個(gè)microRNA家族，包括miR－34a、miR－34b和miR－34c三個(gè)成員，他們?cè)诙喾N腫瘤中均表達(dá)下調(diào)，其表達(dá)水平的下調(diào)影響了腫瘤干細(xì)胞的維持、腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移和化療抵抗［6］。MiR－34a被認(rèn)為是潛在的抑制腫瘤生長(zhǎng)的因子，miR－34a啟動(dòng)子區(qū)存在p53蛋白結(jié)合位點(diǎn)而受到p53的直接調(diào)控，同時(shí)它們又調(diào)控p53本身及其下游通路關(guān)鍵基因的表達(dá)，參與p53信號(hào)通路的調(diào)控;在DNA損傷等因素刺激下，p53促進(jìn)miR－34a表達(dá)上調(diào)，通過miR－34a抑制多個(gè)靶蛋白的表達(dá)，從而引起細(xì)胞周期阻滯、衰老和凋亡，抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展［4，7］。最近研究發(fā)現(xiàn)，低氧的環(huán)境可以促進(jìn)miR－34a表達(dá)的下調(diào)，進(jìn)而促進(jìn)上皮細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)［8］;另有報(bào)道 miRNA －34a在肝癌、前列腺癌、結(jié)腸癌和胰腺癌中低表達(dá)，進(jìn)一步研究提示miRNA－34a的降低可能會(huì)改變腫瘤生存的微環(huán)境，與腫瘤的發(fā)生相關(guān)［6，9－11］。本文通過檢測(cè)miRTarBase和miRBase數(shù)據(jù)庫，篩選出已經(jīng)驗(yàn)證的miR－34a靶基因共56個(gè)，進(jìn)一步靶基因通路富集分析發(fā)現(xiàn)多與腫瘤相關(guān)，文中列出富集度高，且FDR較低的8個(gè)生物學(xué)通路;對(duì)miRNA－34a的靶基因功能富集分析結(jié)果顯示W(wǎng)nt信號(hào)通路富集度最高。Wnt信號(hào)通路由一系列癌基因和抑癌基因編碼的蛋白質(zhì)組成，與腫瘤發(fā)生、發(fā)展等病理生理過程密切相關(guān)，預(yù)測(cè)結(jié)果符合miR－34a大多數(shù)實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果，同時(shí)可以根據(jù)預(yù)測(cè)結(jié)果和構(gòu)建的靶基因相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，指導(dǎo)下一步臨床和實(shí)驗(yàn)研究。

圖3 miR－ 34a對(duì)SW480細(xì)胞SIRT1、NOTCH1蛋白表達(dá)的影響;兩組比較，＊＊p＜0.01

圖4 miR－34a對(duì)SW480細(xì)胞增殖的影響;兩組比較，＊＊p＜0.01

作為miR－34a的靶基因，SIRT1和NOTCH1均參與了腫瘤的生成和發(fā)展過程［4，12］。SIRT1是存在于哺乳動(dòng)物中與 Sir2同源性最高的依賴NAD+的Ⅲ組蛋白類去乙?；?，它在蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄后修飾及轉(zhuǎn)錄調(diào)控中起重要作用，它修飾參與信號(hào)通路傳導(dǎo)的下游蛋白，可調(diào)節(jié)下游的 P53、NF－kβ、叉頭基因家族(FOXO)等蛋白活性，參與細(xì)胞衰老、炎癥反應(yīng)及凋亡調(diào)節(jié)，同時(shí)在基因沉默、表觀遺傳學(xué)修飾、轉(zhuǎn)錄調(diào)控及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要的生物學(xué)功能［13－14］。SIRT1能催化 p53蛋白 c端賴氨酸382殘基去乙?；?，參與調(diào)節(jié)p53的轉(zhuǎn)錄因子活性，抑制p53依賴性凋亡途徑［11］。NOTCH1屬于 NOTCH基因家族成員之一，已知NOTCH1在包括腸道、血液、腦組織、皮膚等組織中均有表達(dá)，它通過信號(hào)傳遞調(diào)節(jié)細(xì)胞之間的相互作用［15－16］;分子流行病學(xué)調(diào)查顯示NOTCH1功能失活是結(jié)直腸癌患者預(yù)后不良的重要標(biāo)志［17］。NOTCH1既是 NOTCH信號(hào)通路的核心分子，也是Wnt信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子，在癌基因的失活或激活中起重要作用［18］。本文結(jié)果顯示，miR－34a mimics轉(zhuǎn)染后，SW480細(xì)胞的SIRT1、NOTCH1蛋白水平明顯下降;細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR－34a mimics轉(zhuǎn)染后的SW480細(xì)胞的生長(zhǎng)速度明顯減慢。本文研究結(jié)果初步表明，miR－34a可能通過負(fù)向調(diào)控 SIRT1、NOTCH1而抑制SW480細(xì)胞的增殖。

總之，本研究通生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)miR－34a可能通過多個(gè)信號(hào)通路參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展;實(shí)驗(yàn)研究驗(yàn)證了在大腸癌細(xì)胞中miR－34a可能通過負(fù)向調(diào)控 SIRT1、NOTCH1而抑制SW480細(xì)胞的增殖，為大腸癌的發(fā)生機(jī)制及腫瘤標(biāo)志物的篩選等研究工作提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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