楊拉維 王亞紅 楊 騰 陳 婷 何惠娟 劉 剛

楊拉維 王亞紅 楊 騰 陳 婷 何惠娟 劉 剛:廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 廣東湛江 524001

近年來，肺癌的死亡率日益升高，調(diào)查發(fā)現(xiàn)肺癌已經(jīng)取代肝癌成為國際上惡性腫瘤死亡的第一大原因［1］。研究表明，大氣污染物是肺癌的主要危險(xiǎn)因素［2］，其中大氣顆粒物是我國城市空氣中的主要污染物之一。直徑小于或等于2.5 μm 的細(xì)顆粒物(PM2.5)在大氣顆粒物中占相當(dāng)大的比重，約為70%，是空氣中對(duì)人體健康危害最大的一類，隨著工業(yè)的發(fā)展和機(jī)動(dòng)車的增加，大氣中顆粒物污染越來越嚴(yán)重，如果長(zhǎng)期吸入顆粒物污染的空氣，必將嚴(yán)重危害人類健康［3－4］。

細(xì)胞自身代謝和外源性的刺激都產(chǎn)生活性氧(ROS)，ROS可損害各種細(xì)胞成分，包括蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸，大量的研究表明ROS 能引起DNA 氧化損傷［5－6］，DNA 氧化損傷和癌癥的發(fā)生是密切相關(guān)的。

細(xì)胞內(nèi)8－羥基鳥嘌呤(8 －oxoG)是氧化損傷的產(chǎn)物之一，具有高的致突變性，8 －oxoG 與許多腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。細(xì)胞內(nèi)特異識(shí)別并切除8 －oxoG 的酶稱為8 －羥基鳥嘌呤DNA糖苷酶，簡(jiǎn)稱OGG1［7－8］。OGG1 基因位于人染色體3P25 區(qū)域，屬于管家基因［9］。OGG1 基因編碼產(chǎn)物OGG1 蛋白是一個(gè)帶有AP 裂解酶活性的雙功能DNA 糖苷酶。研究結(jié)果表明OGG1 的活性與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)［10－11］。

本實(shí)驗(yàn)室前期研究了不同城市PM2.5 的成分和細(xì)胞炎癥的關(guān)系［12］，發(fā)現(xiàn)不同成分的PM2. 5 能誘導(dǎo)DNA 損傷，研究了OGG1 和肺癌的關(guān)系［13］，發(fā)現(xiàn)OGG1 和肺癌有顯著的相關(guān)性，因此，我們研究OGG1 對(duì)PM2.5 造成人肺上皮細(xì)胞DNA 損傷的保護(hù)作用，并探討可能的保護(hù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

(QJS －120F 智能中流量多級(jí)顆粒采樣器(錦州利誠)，QJS－100 中流量多級(jí)顆粒切割器(錦州利誠)，CO2培養(yǎng)箱(Thermo公司)，酶標(biāo)儀(Thermo)，F(xiàn)ACSCalibur 流式細(xì)胞儀(BD 公司)，共聚焦顯微鏡(Leica，Bensheim，Germany)，Beas － 2b 細(xì)胞，DMEM 高糖(Hyclone)，胎牛血清(杭州四季青)，脂質(zhì)體2000 轉(zhuǎn)染試劑盒(Jnvitrogen，USA)，MTT(Sigma)，DCFH(Sigma)，彗星實(shí)驗(yàn)檢測(cè)試劑盒CometAssay?Kit (Trevigen，USA).

1.2 PM2.5 的采集和制備

采集PM2.5 使用QJS－120F 中流量多級(jí)顆粒采樣器，配置QJS－100 中流量多級(jí)顆粒物切割器，采樣地點(diǎn)廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究中心六樓，采樣流量100 L/min，連續(xù)采集72 h。將載有PM2.5 顆粒樣品的纖維濾膜放入超純水中，超聲振蕩15 min 以洗脫顆粒物，然后將樣品真空冷凍干燥24 h，稱重，加入一定量PBS 配制成儲(chǔ)備液，高壓滅菌，4 ℃保存，臨用前震蕩混勻。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及染毒

人肺上皮細(xì)胞(beas－2b)用含10%胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)液，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，細(xì)胞融合80% 時(shí)用0.25%胰蛋白酶消化傳代或用于實(shí)驗(yàn)。將前期研究已構(gòu)建的OGG1 過表達(dá)載體按照Lipofectamine 2000 說明書操作，轉(zhuǎn)染進(jìn)beas－2b，并通過Western blot 檢測(cè)beas－2b 內(nèi)OGG1 表達(dá)水平。將正常beas－2b 細(xì)胞和轉(zhuǎn)染了OGG1 過表達(dá)載體細(xì)胞分別正常培養(yǎng)到細(xì)胞融合80% 時(shí)，分別加入終濃度為100 μg/ml 的PM2.5，染毒24 h。

1.4 細(xì)胞內(nèi)活性氧水平

分別收集染毒后的細(xì)胞，0.25%胰酶消化離心收集細(xì)胞，用PBS 漂洗兩次，加入終濃度為5 μmol/L 的DCFH －DA 染色液，37 ℃作用30 min，PBS 漂洗兩次，流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞內(nèi)二氯熒光素的平均熒光強(qiáng)度，檢測(cè)轉(zhuǎn)染OGG1 對(duì)細(xì)胞內(nèi)活性氧水平的影響。

1.5 細(xì)胞DNA 損傷的檢測(cè)

分別收集染毒后的細(xì)胞，用冰冷PBS 重懸細(xì)胞到1 ×105/ml，按1∶10(體積比)將細(xì)胞(1×105/ml)和融化的低熔點(diǎn)瓊脂糖LMA(37 ℃)混合，并取50 μl 加到玻片孔，將玻片放入4 ℃冰箱避光10 min 使LMA 凝固，將玻片浸泡在裂解液中，置于冰上或4 ℃裂解30 ～60 min。甩干玻片多余的裂解液，將玻片浸入新制的解旋液中避光解旋20 ～60 min。加950 ml 預(yù)冷的電泳液，將玻片放入玻片孔處，21 V，電泳30 min。將玻片取出置于水中5 min，兩次，然后置于70%酒精中5 min，低于45 ℃下干燥10 ～15 min，加入100 μl 稀釋好的SYBR Green 到凝膠孔里，置于冰箱5 min，在室溫避光干燥玻片，最后用熒光顯微鏡或者共聚焦顯微鏡觀察。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS15.0 軟件進(jìn)行分析，所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)至少3 次。結(jié)果表示為(±SD)。

2 結(jié)果

2.1 OGG1 抑制PM2.5 誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)活性氧水平升高

免疫印跡的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明OGG1 過表達(dá)載體成功轉(zhuǎn)染進(jìn)了beas－2b 細(xì)胞，并且編碼OGG1 蛋白的產(chǎn)生，使轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的OGG1 蛋白水平明顯高于未轉(zhuǎn)染組。流式細(xì)胞儀的檢測(cè)結(jié)果表明PM2.5 能誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS 的水平升高，并且OGG1 能夠顯著的抑制PM2.5 導(dǎo)致的細(xì)胞ROS 升高(p＜0.01)(見圖1)。這種對(duì)ROS 的抑制能力可能和OGG1 對(duì)8－oxoG 切除能力相關(guān)。

2.2 OGG1 抑制PM2.5 誘導(dǎo)的DNA 損傷

單細(xì)胞凝膠電泳的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明PM2.5 能夠?qū)е耣eas－2b細(xì)胞DNA 的損傷，損傷可能是由于PM2.5 誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞內(nèi)高濃度的ROS 所導(dǎo)致的，對(duì)比對(duì)照組，OGG1 過表達(dá)能夠顯著的抑制PM2.5 導(dǎo)致的DNA 損傷(p＜0.01)(見圖2)。OGG1 對(duì)DNA損傷的保護(hù)可能是同其抑制細(xì)胞內(nèi)ROS 作用相關(guān)。

圖1 免疫印跡檢測(cè)OGG1 的過表達(dá)及OGG1 對(duì)beas－2b 細(xì)胞ROS 的影響

圖2 彗星實(shí)驗(yàn)檢測(cè)OGG1 對(duì)PM2.5 造成beas－2b 細(xì)胞DNA 損傷的修復(fù)作用

3 討論

近些年來，隨著工業(yè)的發(fā)展和機(jī)動(dòng)車的增加，空氣污染越來越嚴(yán)重。作為空氣質(zhì)量最重要的指標(biāo)，PM2.5 指數(shù)已經(jīng)在全國各大城市實(shí)行了實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。國內(nèi)最近統(tǒng)計(jì)研究表明，惡性腫瘤中肺癌的死亡病例數(shù)排第一位［14］，越來越多的研究表明，PM2.5與哮喘、肺癌等一系列的肺部疾病的產(chǎn)生存在相關(guān)性。本實(shí)驗(yàn)研究表明，PM2.5 能夠誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生，能夠?qū)е录?xì)胞DNA 的損傷，這與之前的研究報(bào)道一致［15－16］。不同來源的PM2.5 的成分已經(jīng)被研究得非常清楚，主要是多環(huán)芳烴(PAHs)和過渡金屬元素［17］，隨著對(duì)PM2.5 研究的深入，如何保護(hù)機(jī)體、減少PM2.5 對(duì)機(jī)體造成的損傷顯得非常重要。

OGG1 是非常重要的堿基切除修復(fù)酶之一，在清除8 － oxoG，保護(hù)細(xì)胞功能方面發(fā)揮重要的作用。研究表明細(xì)胞核中的OGG1 的表達(dá)和蛋白活性都高于線粒體，線粒體中的氧化損傷和突變積累比細(xì)胞核更快。

致癌物苯并芘Bap 是多環(huán)芳烴的重要成分之一，有研究表明Bap 能夠降低OGG1 的活性，誘導(dǎo)肺癌的產(chǎn)生［18］，也有研究表重金屬導(dǎo)致的基因突變與OGG1 的活性降低有關(guān)［19］，因此PM2.5的致癌很可能與PM2.5 降低OGG1 的活性相關(guān)。

本研究表明，OGG1 的過表達(dá)對(duì)PM2.5 造成的DNA 損傷有明顯的修復(fù)和減輕作用，但對(duì)于該修復(fù)和保護(hù)作用的具體分子機(jī)制還沒有研究清楚，可能是和清除細(xì)胞內(nèi)的ROS、保護(hù)線粒體的功能相關(guān)，PM2.5 是如何對(duì)線粒體造成的損傷以及OGG1 保護(hù)線粒體功能的分子機(jī)制需要后續(xù)試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。而基于OGG1 對(duì)PM2.5 造成的DNA 損傷有明顯的修復(fù)和減輕作用，OGG1 可能成為PM2.5 導(dǎo)致的肺部疾病的一個(gè)治療靶點(diǎn)。

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