葡萄酒中葡萄的DNA提取和分子鑒定研究進(jìn)展

高蘇娟，李志勇，高東微，劉 津，*

（1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院輕工食品學(xué)院，廣東 廣州 510225；2.廣東檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，廣東 廣州 510623）

葡萄酒中葡萄的DNA提取和分子鑒定研究進(jìn)展

高蘇娟1，李志勇2，高東微2，劉 津2，*

（1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院輕工食品學(xué)院，廣東 廣州 510225；2.廣東檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，廣東 廣州 510623）

分子生物學(xué)技術(shù)能夠?qū)ζ咸丫普鎮(zhèn)魏推焚|(zhì)鑒別提供直接的判別依據(jù)。解決葡萄酒中葡萄DNA提取的技術(shù)難題，并以此為基礎(chǔ)利用分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行葡萄酒中葡萄品種的鑒定，具有重大的研究和應(yīng)用價(jià)值。因此，本文綜述了近10余年來(lái)分子生物學(xué)技術(shù)在葡萄酒分子鑒定方面的研究進(jìn)展，從葡萄酒中葡萄DNA提取、DNA質(zhì)量評(píng)價(jià)和品種鑒定三方面進(jìn)行了闡述，尤其是將文獻(xiàn)中的DNA提取和下游檢測(cè)技術(shù)方案進(jìn)行了系統(tǒng)比較，就DNA提取部分按照葡萄DNA的富集、DNA粗提和多糖多酚的去除以及DNA純化回收3 個(gè)步驟進(jìn)行了深入的分析，并詳細(xì)介紹了以微衛(wèi)星標(biāo)記為代表的品種鑒定技術(shù)現(xiàn)狀。在此基礎(chǔ)上，本文還探討了基因檢測(cè)技術(shù)在葡萄酒真?zhèn)魏推焚|(zhì)鑒定方面的應(yīng)用前景。

葡萄酒；DNA提取；微衛(wèi)星標(biāo)記；品種鑒定

葡萄酒已然成為百姓餐桌上不可或缺的飲品，近兩年，我國(guó)進(jìn)口葡萄酒總銷(xiāo)量達(dá)325 億元，增長(zhǎng)超過(guò)70%［1］，然而“以假充真”、“以次充好”等頻頻見(jiàn)諸報(bào)端的葡萄酒品質(zhì)安全問(wèn)題，不僅侵害到消費(fèi)者的利益，也嚴(yán)重制約了葡萄酒行業(yè)的健康發(fā)展。

葡萄酒的價(jià)值與其品質(zhì)密切相關(guān)，高品質(zhì)的葡萄酒如莊園酒和特定產(chǎn)區(qū)的葡萄酒價(jià)值從一瓶幾百元到上萬(wàn)元不等，而普通的餐酒許多只需幾十元，即使享譽(yù)世界的法國(guó)拉菲莊園出產(chǎn)的波爾多葡萄酒也有不同級(jí)別檔次，其定價(jià)也從兩三百元到萬(wàn)余元不等，葡萄酒品質(zhì)鑒定則能為有效規(guī)范葡萄酒銷(xiāo)售市場(chǎng)提供科學(xué)依據(jù)和技術(shù)支撐。實(shí)際上，葡萄酒的品質(zhì)與葡萄品種、產(chǎn)地微氣候、釀造技術(shù)及其風(fēng)味有密切關(guān)系，其中最基本的、也是最容易量化考核的即是釀酒所用的葡萄品種及比例。目前，基于化學(xué)分析的葡萄酒品質(zhì)檢測(cè)技術(shù)已相對(duì)成熟，迄今蛋白質(zhì)或氨基酸［2-5］、酚類(lèi)物質(zhì)［6］、礦物質(zhì)［7］和芳香類(lèi)物質(zhì)［8］已用來(lái)分析和鑒定葡萄的品種或地理來(lái)源。多元醇、有機(jī)酸、多酚、單寧等多種葡萄酒中主要風(fēng)味化學(xué)成分的分析技術(shù)已經(jīng)建立并廣泛應(yīng)用于葡萄酒行業(yè)［9-12］，但葡萄酒中上述化學(xué)物質(zhì)的存在與多寡易受土壤成分、溫度條件以及發(fā)酵和陳釀過(guò)程的影響，只能從側(cè)面、間接地反映葡萄酒的真?zhèn)魏推焚|(zhì)［13］。由于釀酒葡萄品種對(duì)于葡萄酒品質(zhì)至關(guān)重要［14］，基于基因水平的、能夠提供相對(duì)直觀(guān)鑒別依據(jù)的葡萄酒真?zhèn)魏推焚|(zhì)分析技術(shù)備受關(guān)注。隨著葡萄品種基因鑒別方法的逐步發(fā)展和漸成體系，其在葡萄酒真?zhèn)魏推焚|(zhì)鑒別方面的應(yīng)用性研究已有突破性的進(jìn)展。隨著葡萄酒中葡萄DNA提取技術(shù)的建立，以分子標(biāo)記為代表的葡萄酒鑒別檢測(cè)技術(shù)也逐漸發(fā)展起來(lái)。本文對(duì)近10余年來(lái)葡萄酒中葡萄DNA的提取和分子鑒定的研究進(jìn)展進(jìn)行綜合評(píng)述，旨在為葡萄酒基因鑒偽技術(shù)的研究提供參考。

1　概 述

葡萄酒的分子鑒定包括葡萄酒中葡萄DNA的提取和下游分子生物學(xué)分析兩個(gè)部分，其中從葡萄酒中獲得高質(zhì)量的葡萄DNA是進(jìn)行下游分子生物學(xué)分析的基礎(chǔ)。植物基因組DNA提取方法已較為成熟，基于十六烷基三甲基溴化銨法（cetyltrimethyl ammonium bromide，CTAB）［15］和十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）法［16］等傳統(tǒng)方法，適于不同類(lèi)型植物材料的DNA提取方法［17-18］已經(jīng)廣泛應(yīng)用，甚至開(kāi)發(fā)成為商品化的植物DNA提取試劑盒［18］。然而，這些DNA提取方法均不適用于葡萄酒中的葡萄DNA提取。葡萄酒為高度深加工產(chǎn)品，其生產(chǎn)過(guò)程歷經(jīng)發(fā)酵、轉(zhuǎn)瓶、陳釀、澄清和過(guò)濾等諸多環(huán)節(jié)，成品葡萄酒中DNA含量極微，且由葡萄漿果引入葡萄酒中的大量的多酚類(lèi)（單寧）、多糖、有機(jī)酸等復(fù)雜的化學(xué)物質(zhì)，嚴(yán)重影響DNA提取質(zhì)量及下游的分子生物學(xué)分析，目前尚未見(jiàn)報(bào)道一種能夠達(dá)到應(yīng)用水平的葡萄酒DNA提取方法，也沒(méi)有成熟的商品化試劑盒。2000年至今，關(guān)于果汁、新酒或陳釀的葡萄酒中DNA提取及分析的研究報(bào)道［19-22］層出不窮。已有研究［13，23-27］表明：即使經(jīng)過(guò)發(fā)酵，葡萄酒中依然存在微量的葡萄DNA，采用分子生物學(xué)手段進(jìn)行用果汁或葡萄酒中的葡萄DNA分析是可行的；從葡萄酒中提取出足量且優(yōu)質(zhì)的葡萄DNA和篩選出葡萄特異性的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）引物是應(yīng)用分子生物學(xué)手段鑒別葡萄酒中葡萄品種的前提，也是目前葡萄酒基因鑒偽技術(shù)研究的關(guān)鍵點(diǎn)和難點(diǎn)；在成功地提取出適宜進(jìn)行下游分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的葡萄DNA后，可以進(jìn)行葡萄特異性基因的檢測(cè)，以判斷是否用葡萄原汁釀造；可以進(jìn)行微衛(wèi)星位點(diǎn)擴(kuò)增，通過(guò)與相關(guān)葡萄微衛(wèi)星位點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，從而鑒別出葡萄酒中的葡萄品種。

2　葡萄酒中葡萄DNA的提取

2.1釀造環(huán)節(jié)對(duì)葡萄酒中葡萄DNA的影響

研究表明，葡萄酒生產(chǎn)過(guò)程的發(fā)酵、轉(zhuǎn)瓶、陳釀、澄清和過(guò)濾等步驟都會(huì)減少葡萄酒中葡萄DNA的含量并破壞其質(zhì)量。在葡萄酒發(fā)酵過(guò)程的不同階段取樣提取DNA的效果差別很大：在發(fā)酵進(jìn)行的初期，雖然細(xì)胞被破壞、發(fā)酵的葡萄組織逐漸消融，但是提取的葡萄DNA卻有所上升；但是在發(fā)酵的中后期，DNA的質(zhì)和量都急劇下降［19］。大多數(shù)研究者認(rèn)為在進(jìn)行澄清和過(guò)濾等步驟后，葡萄酒中的DNA含量會(huì)驟然減少［22］，但是Drábek等［28］認(rèn)為澄清和過(guò)濾的步驟對(duì)葡萄酒中DNA的含量影響不大，因?yàn)榇蠖鄶?shù)葡萄DNA已經(jīng)在澄清步驟之前損失，能夠存留的DNA則完全溶解于液相，直徑只有2 nm，能夠通過(guò)孔徑0.4 ?m的濾膜［12，28］。市售葡萄酒裝瓶的時(shí)間越久，從中提取出葡萄DNA的難度越大［13，19，25］。

Siret等［19-20］從發(fā)酵階段的葡萄酒中每天取樣并提取其DNA，發(fā)現(xiàn)在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，利用從發(fā)酵罐里的固相中提取獲得的DNA能夠有效地進(jìn)行微衛(wèi)星序列擴(kuò)增，而從液相中提取的DNA在進(jìn)行微衛(wèi)星序列擴(kuò)增時(shí)重復(fù)性較差。對(duì)不同加工工藝的市售葡萄酒進(jìn)行DNA提取和微衛(wèi)星序列擴(kuò)增，提取和擴(kuò)增效果類(lèi)似于發(fā)酵階段液相中的情況。Savazzini等［25］從發(fā)酵后陳釀一年的葡萄酒中提取出了葡萄DNA并進(jìn)行了微衛(wèi)星位點(diǎn)分析。Pereira等［13］從處于發(fā)酵階段的葡萄酒以及裝瓶后2～6 a的市售葡萄酒中均成功提取了葡萄DNA，并能成功地進(jìn)行微衛(wèi)星序列的擴(kuò)增。

可見(jiàn)，從初始發(fā)酵的葡萄果汁至發(fā)酵各個(gè)階段乃至市售的陳年葡萄酒中均可能提取得到適于微衛(wèi)星序列擴(kuò)增的葡萄DNA，這是對(duì)葡萄酒進(jìn)行葡萄基因鑒別檢測(cè)的物質(zhì)基礎(chǔ)。只有解決了葡萄酒中葡萄DNA提取的難題，開(kāi)展葡萄酒基因鑒偽技術(shù)研究才有探討的可能。

2.2葡萄酒DNA提取及純化

葡萄酒中葡萄DNA提取是葡萄酒基因鑒偽技術(shù)研究首要解決的問(wèn)題，主要的難點(diǎn)有兩方面：即如何將微量DNA從相對(duì)大量的酒樣中富集，以及如何將DNA與葡萄酒中大量的多酚類(lèi)、多糖等雜質(zhì)分離。本文將目前已報(bào)道文獻(xiàn)中的葡萄酒中DNA提取方法按照DNA富集、DNA粗提、DNA純化回收3 個(gè)階段進(jìn)行了分類(lèi)匯總列于表1。目前已報(bào)道的葡萄酒或葡萄汁中DNA提取方法可分為三類(lèi)，即以CTAB法為基礎(chǔ)進(jìn)行改良的方法［13，19-22，25，28，31-32］、以SDS法為基礎(chǔ)改良的方法［26-27］和硅石（silica）吸附法［23］，其中以CTAB法改良的報(bào)道居多。除了采用硅石吸附法［23］提得的DNA未進(jìn)行下游的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)外，其余方法均用提取得到的DNA成功進(jìn)行微衛(wèi)星序列分析，少部分文獻(xiàn)中［25，27-28，31］還成功地進(jìn)行了葡萄特異性基因的PCR或?qū)崟r(shí)熒光定量PCR分析，表明基因水平進(jìn)行葡萄酒品質(zhì)分析鑒別盡管難度較大但并非不可行。表1中各種葡萄酒中DNA提取方法中采用的技術(shù)策略分析如下。

表1　葡萄果汁和葡萄酒中葡萄DNA提取和下游檢測(cè)技術(shù)方案Table 1 Summaries of DNA extraction and downstream detection protocols for grape juice and wines

2.2.1葡萄酒中DNA富集

葡萄酒中微量DNA片段的富集是DNA提取的第一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)。由表1可知，4 ℃低溫離心取沉淀、真空冷凍干燥以及硅石吸附是目前富集葡萄酒中DNA的3 種有效方式。為了更充分富集溶于液相中分子質(zhì)量較小的DNA片段，提高DNA的得率，Savazzini等［25］在原酒中分別加入1/9 體積1.2 mol/L NaCl、0.7 倍體積異丙醇或1/6 體積醋酸鈉并于－20 ℃放置1～2 周，然后進(jìn)行DNA提取，結(jié)果表明3 種試劑均能顯著提高DNA得率，且異丙醇沉淀后提取的DNA得率稍遜于NaCl和醋酸鈉沉淀，但純度較高；Pereira等［13］比較了添加0.7 倍體積異丙醇－20 ℃放置24 h、48 h、1 周或2 周對(duì)DNA得率以及下游PCR效果的影響，認(rèn)為－20 ℃放置2 周為最佳，對(duì)于紅葡萄酒尤其如此。Drábek等［28］在真空冷凍干燥市售葡萄酒時(shí)，加入0.5 mol/L的EDTA和線(xiàn)性聚丙烯酰胺，也獲得了可用于熒光定量PCR分析的DNA。

2.2.2DNA粗提以及多糖和多酚的去除

葡萄酒中富含源于葡萄漿果的多糖和多酚等物質(zhì)［33］，不僅干擾DNA的提取，也抑制下游的分子生物學(xué)檢測(cè)［27］。CTAB是一種去污劑，它既可以裂解細(xì)胞，又可以有效沉淀多糖，因此，在Tris-HCl-EDTA（pH 8.0）的弱堿性緩沖液中，1～3 g/100 mL的CTAB配合1.4 mol/L NaCl是普遍采用的葡萄酒中DNA提取緩沖液（表1），Zeng Jie等［34］認(rèn)為對(duì)于多糖與次生物質(zhì)含量較高的材料，DNA提取液中提高CTAB質(zhì)量濃度至3 g/100 mL則效果更好。SDS法是經(jīng)典的DNA提取方法，由于SDS不具有沉淀多糖的能力，較少用于多糖多酚含量較多的材料中DNA的提?。?7］，但經(jīng)改良（加入2%（體積分?jǐn)?shù)，下同）β-巰基乙醇）可以從葡萄酒和葡萄汁中提取獲得可用于微衛(wèi)星位點(diǎn)分析的DNA［26］，另有Nakamura等［27］將SDS法與耐熱R-淀粉酶和蛋白酶K合用，從市售葡萄酒中提取獲得了DNA，并成功進(jìn)行葡萄特異性基因的PCR分析。

由表1可知，數(shù)種改良的CTAB法和SDS方法中，普遍添加了1%～2% β-巰基乙醇、PVP40或PVPP 1～6 g/100 mL。因?yàn)棣?巰基乙醇為抗氧化劑，可避免酚類(lèi)氧化；PVP或PVPP則能絡(luò)合多酚和萜類(lèi)物質(zhì)，可阻止多酚物質(zhì)氧化為醌，兩者配合使用能有效防止多酚的污染［13，17］。經(jīng)DNA提取緩沖液裂解得粗提DNA后，通常用苯酚-氯仿-異戊醇（25∶24∶1，V/V）抽提或者中性水飽和苯酚與氯仿-異戊醇（24∶1）分次抽提，以去除蛋白質(zhì)和多糖等雜質(zhì)。Pereira等［13］通過(guò)實(shí)驗(yàn)表明，盡管酚抽提會(huì)增加DNA中酚污染的機(jī)率，但該環(huán)節(jié)依然是葡萄酒中DNA提取過(guò)程中不可或缺的，另外加入蛋白酶K以去除蛋白也是必要的。

2.2.3DNA純化回收

通常采用添加0.6～0.8 倍體積異丙醇或2 倍體積無(wú)水乙醇至DNA粗提液，并于低溫-20 ℃過(guò)夜沉淀的方式獲得相對(duì)較純的DNA，NaCl、醋酸銨以及醋酸鈉等鹽類(lèi)物質(zhì)能夠幫助達(dá)到更好的沉淀效果（表1）；另外，商業(yè)化的DNA提取或純化試劑盒被用來(lái)進(jìn)一步純化所提得的DNA，以滿(mǎn)足下游微衛(wèi)星位點(diǎn)分析或熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)對(duì)DNA純度的需求［20，22，28-29］。

3　DNA質(zhì)量評(píng)價(jià)

在優(yōu)化葡萄酒中DNA提取條件的過(guò)程中，合適的DNA質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)尤為重要。分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中通常采用分光光度法測(cè)定提取產(chǎn)物260 nm與280 nm波長(zhǎng)處的吸光度，據(jù)此計(jì)算DNA的濃度并初步判定其純度。然而，從葡萄酒中提取的DNA，除了含有源于葡萄漿果的葡萄DNA，還有源于發(fā)酵過(guò)程中酵母等微生物的DNA，因此，分光光度法并不能判定提取的DNA是否含有葡萄內(nèi)源DNA。采用微衛(wèi)星序列分析、普通PCR或熒光定量PCR進(jìn)行葡萄特異性基因分析則能夠直接判定所提得的DNA中是否含有葡萄特異性基因。表2列出了目前文獻(xiàn)中報(bào)道的可用于葡萄酒中葡萄特異性基因分析的PCR引物與探針信息，以供參考。

表2　葡萄內(nèi)源基因PCR引物和探針Table 2 Primers and probes for PCR of endogenous genes in grape

4　葡萄品種的鑒定

葡萄酒的品質(zhì)與葡萄品種、水土和釀造技術(shù)等密切相關(guān)，特別是高品質(zhì)葡萄酒對(duì)釀酒采用的葡萄品種及其配比有著嚴(yán)格的要求。為了保障高級(jí)葡萄酒的品質(zhì)，許多國(guó)家如法國(guó)、意大利和葡萄牙等都實(shí)行了原產(chǎn)地保護(hù)規(guī)定，只允許使用特定產(chǎn)區(qū)有限的少數(shù)幾個(gè)葡萄品種進(jìn)行釀酒［14］。近年來(lái)，分子標(biāo)記技術(shù)如限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（random amplified polymorphic DNA，RAPD）、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）和微衛(wèi)星標(biāo)記（simple sequence repeats，SSR）等已經(jīng)成功的應(yīng)用于葡萄品種鑒定［35］。SSR標(biāo)記技術(shù)利用SSR兩端的保守序列設(shè)計(jì)出一對(duì)特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)凝膠電泳或毛細(xì)管電泳等手段檢測(cè)出擴(kuò)增條帶的多態(tài)性，從而鑒別出不同的葡萄品種。SSR分子標(biāo)記技術(shù)具有對(duì)DNA的濃度和純度要求較低，即便部分降解的DNA也能進(jìn)行分析鑒定等特點(diǎn)，因此廣泛應(yīng)用于葡萄酒中葡萄品種的鑒定。

Siret等［20］利用從發(fā)酵階段的葡萄酒中提取的DNA，用VVMD5、VVMD7、VVMD21、VVMD24和VVMD32這5 個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，能夠有效的鑒別單一品種發(fā)酵葡萄酒中的Chardonnay B、Clairette B、Syrah N和Grenache，對(duì)兩個(gè)葡萄品種混合發(fā)酵的葡萄酒能夠成功的鑒別出含量為30%的異源葡萄品種。Siret等［20］還提出對(duì)于葡萄酒這種深加工的產(chǎn)品，應(yīng)該將檢測(cè)目標(biāo)針對(duì)線(xiàn)粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）或葉綠體DNA（chloroplast DNA，cpDNA），因其含量相對(duì)于細(xì)胞核DNA更豐富，且線(xiàn)粒體和葉綠體DNA為環(huán)形，對(duì)熱處理等具有較高的抗性。Savazzini等［25］能夠成功地從發(fā)酵后超過(guò)1 a的葡萄酒中擴(kuò)增出微衛(wèi)星序列，但用Genotyper軟件分析發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增得到的微衛(wèi)星序列與不同葡萄品種葉片的微衛(wèi)星序列仍存在差異，認(rèn)為可能與低DNA濃度和高多酚、多糖和其他PCR抑制劑有關(guān)；Baleiras-Couto等［26］應(yīng)用6 種細(xì)胞核SSR和2 種葉綠體SSR微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)5 種單一品種發(fā)酵和2 種雙品種混合發(fā)酵葡萄酒進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)在雙品種發(fā)酵的葡萄酒中某一葡萄品種比例越高則擴(kuò)增信號(hào)越強(qiáng)，且葉綠體SSR比細(xì)胞核SSR更適用于葡萄酒的檢測(cè)。García-Beneytez等［22］在一個(gè)PCR反應(yīng)體系中同時(shí)擴(kuò)增VVS5、VVMD7、VVS2、VVMD5、ZAG47、ZAG62、ZAG79和VVS29共7 個(gè)微衛(wèi)星序列，并成功地鑒別了單一品種發(fā)酵的葡萄酒中葡萄品種，該方法依據(jù)上述微衛(wèi)星位點(diǎn)擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小差異或PCR時(shí)標(biāo)記的熒光不同，可以在同一反應(yīng)體系中同時(shí)進(jìn)行不同微衛(wèi)星位點(diǎn)的檢測(cè)，從而有效地節(jié)省DNA、時(shí)間和金錢(qián)，在微衛(wèi)星標(biāo)記鑒別未知樣品中存在的多種葡萄品種方面也具有較好的應(yīng)用潛力。

獲取SSR分子標(biāo)記的相關(guān)信息可以通過(guò)查閱文獻(xiàn)，也可以通過(guò)訪(fǎng)問(wèn)SSR分子標(biāo)記數(shù)據(jù)庫(kù)，主要的公開(kāi)的葡萄微衛(wèi)星標(biāo)記數(shù)據(jù)庫(kù)見(jiàn)表3。瑞士葡萄SSR分子標(biāo)記數(shù)據(jù)庫(kù)（Swiss Vitis Microsatellite Database）截至2014年6月收錄了171 份本國(guó)葡萄品種的SSR信息，該數(shù)據(jù)庫(kù)中利用6 個(gè)SSR標(biāo)記（VVMD5、VVMD7、VVMD27、VVS2、VrZAG62、VrZAG79），區(qū)分了171 份葡萄品種。意大利葡萄SSR分子標(biāo)記數(shù)據(jù)庫(kù)（Grape Microsatellite Collection，GMC）能通過(guò)葡萄品種名稱(chēng)、微衛(wèi)星位點(diǎn)和名稱(chēng)首字母進(jìn)行檢索，檢索的結(jié)果包括微衛(wèi)星位點(diǎn)、等位基因1和2的長(zhǎng)度、品種名稱(chēng)、作者、引用文獻(xiàn)和片段分析方法這7 項(xiàng)內(nèi)容。

表3　葡萄微衛(wèi)星標(biāo)記數(shù)據(jù)庫(kù)Table 3 Databases of grapevine microsatellite markers

3　結(jié) 語(yǔ)

隨著人們對(duì)葡萄酒文化的逐漸熟悉和鐘愛(ài)，我國(guó)進(jìn)口葡萄酒消費(fèi)市場(chǎng)急速膨脹。令人不齒的是，市場(chǎng)上出現(xiàn)了“以假亂真”、“以次充好”、甚至“葡萄酒里不含葡萄原汁”等種種亂象，深刻影響了葡萄酒文化的宣傳推廣，極大打擊了葡萄酒消費(fèi)市場(chǎng)的健康發(fā)展，嚴(yán)重侵害了消費(fèi)者的正當(dāng)權(quán)益。面對(duì)目前葡萄酒魚(yú)龍混雜的局面，研究并建立葡萄酒真?zhèn)魏推焚|(zhì)鑒別檢驗(yàn)技術(shù)能夠?yàn)槠咸丫剖袌?chǎng)的科學(xué)監(jiān)管提供有效的技術(shù)武器。

高品質(zhì)葡萄酒對(duì)葡萄品種及比例均有具體的要求，通過(guò)基因檢測(cè)技術(shù)可以有效的鑒別出葡萄酒中所含有的葡萄品種及其比例，從而能夠?yàn)殍b別葡萄酒的真?zhèn)魏推焚|(zhì)提供一種直接判定的依據(jù)。經(jīng)過(guò)諸多研究者的共同努力，葡萄酒中葡萄的DNA提取和分子鑒定已取得喜人進(jìn)展，主要表現(xiàn)為：1）果汁和發(fā)酵階段葡萄酒中葡萄DNA提取以及SSR技術(shù)鑒定部分葡萄品種的方法已基本確立（表1）；2）能夠從市售葡萄酒中提取獲得葡萄的DNA，并在品種鑒定方面進(jìn)行了有益嘗試。

同時(shí)，從已有的研究報(bào)道中也凸顯出實(shí)現(xiàn)從基因水平簡(jiǎn)便、快速、直接地對(duì)葡萄酒品質(zhì)進(jìn)行鑒別仍有不少技術(shù)難題亟待解決：1）目前尚無(wú)成熟穩(wěn)定的葡萄酒DNA提取方法體系建立，尤其是市售和紅葡萄酒中高質(zhì)量DNA提取仍是發(fā)展葡萄酒基因鑒別技術(shù)的關(guān)鍵及限速環(huán)節(jié)。在該環(huán)節(jié)，可以從以下方面進(jìn)行有益的嘗試，諸如通過(guò)溫度梯度控制或加入糖原等助沉劑以縮短DNA富集（沉淀）時(shí)間；選用磁珠和特異性吸附膜等方法進(jìn)行DNA的純化，以避免常規(guī)純化過(guò)程中大量使用苯酚、氯仿等有機(jī)試劑造成的污染；針對(duì)不同發(fā)酵階段、白葡萄酒或紅葡萄酒DNA提取的共性難點(diǎn)開(kāi)發(fā)相應(yīng)的DNA提取試劑盒等方面以?xún)?yōu)化DNA的提取。2）葡萄酒中葡萄DNA品種鑒別依舊困難重重，其主要限制性體現(xiàn)在難以獲得葡萄品種特異性的基因序列，且各品種微衛(wèi)星位點(diǎn)擴(kuò)增產(chǎn)物差異較小，某些品種間產(chǎn)物大小差異僅為幾個(gè)堿基對(duì)，甚至僅是個(gè)別堿基的不同，即使借助于分辨率相對(duì)較高的毛細(xì)管電泳或芯片凝膠電泳也難以鑒別，而將擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序，通過(guò)序列分析確定品種則不失為更可行的方法。因此，建立并共享釀酒葡萄微衛(wèi)星序列數(shù)據(jù)庫(kù)勢(shì)在必行。

綜上所述，基因檢測(cè)技術(shù)將在葡萄酒的真?zhèn)魏推焚|(zhì)鑒別檢測(cè)方面發(fā)揮越來(lái)越重要的作用，隨著研究方法和技術(shù)的日新月異，從基因水平簡(jiǎn)便、快速、直接地判別葡萄酒是否由葡萄原汁釀制，以及由何種釀制， 建立葡萄酒“指紋”體系指日可待。

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A Review on Grape （Vitis vinifera L.） DNA Extraction and Molecular Identification for Wines

GAO Sujuan1， LI Zhiyong2， GAO Dongwei2， LIU Jin2，*
（1. College of Food Science and Technology， Zhongkai University of Agriculture and Engineering， Guangzhou 510225， China；2. Guangdong Inspection and Quarantine Technology Center， Guangzhou 510623， China）

Molecular biology techniques can provide direct authenticity and quality identification of wines. The resolution of technical problems on grape DNA extraction from wines and the subsequent application of molecular marker techniques in grapevine identification are of great interest among researchers and of high practical value. A literature review on molecular biology techniques used for grapevine identification for wines in recent decades is given in this paper， including grape DNA extraction from wines， DNA quality evaluation and grapevine identification. A systematic comparison of DNA extraction and downstream detection protocols reported in the literature is provided as well as a detailed analysis of the three steps involved in DNA extraction namely DNA enrichment， crude DNA extraction and subsequent removal of polyphenol and polysaccharide， and DNA purification. The technical advances in grapevine identification represented by microsatellite marker technology are displayed. Meanwhile， the application prospects of gene detection technologies in authenticity and quality identification of wines are discussed in this paper.

wine； DNA extraction； microsatellite marker； grapevine identification

TS255.7

A

1002-6630（2015）15-0282-06

10.7506/spkx1002-6630-201515052

2014-08-08

國(guó)家質(zhì)檢總局科技計(jì)劃項(xiàng)目（2014IK102）；廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局科技計(jì)劃項(xiàng)目（2013GDK24）；仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新基金項(xiàng)目（2014A17）

高蘇娟（1981—），女，講師，博士，研究方向?yàn)樯锕こ?。E-mail：gaoshj@126.com

劉津（1983—），女，工程師，碩士，研究方向?yàn)槭称窓z測(cè)。E-mail：ivfhonline@126.com