王媛媛 胡明潔 張靜 黃銀久 湯必奎 陳昌杰 吳守偉

利多卡因?qū)瘘S色葡萄球菌外毒素TSST-1刺激的特應(yīng)性皮炎患者外周血單一核細胞的影響

王媛媛 胡明潔 張靜 黃銀久 湯必奎 陳昌杰 吳守偉

目的 探討利多卡因?qū)瘘S色葡萄球菌外毒素激活特應(yīng)性皮炎患者單一核細胞的影響。方法抽取6例特應(yīng)性皮炎患者外周血，常規(guī)分離培養(yǎng)單一核細胞。以金黃色葡萄球菌外毒素刺激共孵育，同時加入不同濃度的利多卡因。3H-TdR摻入法檢測單一核細胞增殖，酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測Th1和Th2細胞因子的釋放。Western印跡法檢測利多卡因?qū)εc中毒性休克綜合征毒素1（TSST-1）刺激的特應(yīng)性皮炎患者單一核細胞共孵育的HaCaT細胞中間絲相關(guān)蛋白的表達。結(jié)果 TSST-1（100 μg/L）顯著刺激了特應(yīng)性皮炎患者單一核細胞的增殖（SI=75± 2.12，P<0.05），并刺激 α 腫瘤壞死因子、γ干擾素、白細胞介素（IL）2、IL-12、IL-4、IL-5、IL-13細胞因子的釋放（均P<0.05）。CCK-8檢測結(jié)果顯示，與空白對照組相比，100 μmol/L利多卡因顯著抑制了TSST-1刺激的特應(yīng)性皮炎患者單一核細胞的增殖（SI=58±3.14，P<0.05），亦顯著抑制了TSST-1刺激的特應(yīng)性皮炎患者外周血IL-4、IL-5、IL-13、α腫瘤壞死因子以及γ干擾素的釋放，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P<0.05）。Western印跡法結(jié)果顯示，100 μmol/L利多卡因阻斷了HaCaT細胞中間絲相關(guān)蛋白表達的下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。結(jié)論 利多卡因?qū)SST-1刺激的特應(yīng)性皮炎患者單一核細胞的激活具有明顯的抑制作用。

特應(yīng)性皮炎；金黃色葡萄球菌；外毒素類；利多卡因；單核細胞

資料和方法

一、資料

鹽酸利多卡因和TSST-1均購于美國Sigma公司，IP細胞裂解液、苯甲基磺酰氟（Phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）和SDS-PAGE蛋白樣本上樣緩沖液（5X）均購于上海碧云天生物技術(shù)研究所。DMEM-高糖細胞培養(yǎng)基，胎牛血清和無血清原代人表皮角質(zhì)形成細胞培養(yǎng)基和膠原酶II均購于美國Gibco Brl公司。中間絲相關(guān)蛋白（FLG）引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司設(shè)計合成。HaCaT細胞購于武漢大學(xué)保藏中心，細胞因子ELISA檢測試劑盒購于上海博谷生物科技有限公司，Transwell裝置購于美國Becton Dickinson公司。

二、對象

2013年8月至2014年3月，在蚌埠醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院皮膚科門診確診的6例AD患者（10～68歲，平均28.55歲），均符合Hanifin-Rajak診斷標準［7］，SCORAD 評分 5～57.6，平均 38.27。6 例患者在納入本研究前2周內(nèi)均未服用糖皮質(zhì)激素、未接受免疫抑制劑治療以及局部未應(yīng)用糖皮質(zhì)激素類藥物。本研究已通過本院倫理委員會批準，研究對象均簽署知情同意書。

三、方法

1.PBMC的分離純化：無菌采集靜脈血10 ml注入盛有10 ml D-Hanks液（含2.5%的枸櫞酸鈉200 μl）的試管中混勻，用 Ficoll Hypaque 分離方法進行分離。分離后將細胞接種于培養(yǎng)瓶中，置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱2～4 h后吸出培養(yǎng)基，用37℃預(yù)熱的培養(yǎng)基清洗3遍，將未貼壁細胞洗脫。待細胞生長至80%～90%單層融合狀態(tài)時，給予無血清培養(yǎng)基靜止12 h以上，然后給予不同處理。

2.利多卡因?qū)BMC的細胞毒性檢測：PBMC（105細胞/孔）鋪96孔板，每孔設(shè)3復(fù)孔，待細胞貼壁 2 h 后，加入不同濃度（0、10、100、1 000 μmol/L）利多卡因，同時設(shè)加入PBS的空白對照組，培養(yǎng)7 d，之后，每組取3孔，向各孔中加入10 μl的CCK-8溶液，37℃下孵育4 h。隨后采用酶標儀于波長在450 nm處檢測吸光度A值，650 nm作為參考波長進行雙波長測定。

3.細胞增殖和細胞因子檢測：分離的PBMC（105細胞/孔）分別以 TSST-1（100 μg/L）或豆蔻酰佛波醇乙酯（PMA）和鈣離子載體刺激，同時加入不同濃度的（0、10、100、1 000 μmol/L）利多卡因，同培養(yǎng)7 d。用3H-TdR摻入法測定淋巴細胞增殖：每孔加入 0.5 ～ 1 μCi的3H-TdR（50 μl）繼續(xù)培養(yǎng)6 ～ 12 h，離心吸去上清液，用200 μl冷PBS洗滌1次（15 000×g離心10 min）。用DYQ-Ⅱ型多頭細胞收集儀收集樣品，于玻璃纖維素膜上，蒸餾水抽洗至少2次；濾膜于60～80℃，30 min烘干（或75℃烤箱過夜），然后將濾膜放入裝有5 ml閃爍液中（貼細胞的面朝上），閃爍瓶暗處放置15 min；Beckman LS-9800型液體閃爍計數(shù)儀計數(shù)（測定放射性cpm值）。

4.共培養(yǎng)實驗：HaCaT細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清，1%青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，采用高鈣培養(yǎng)環(huán)境（CaCl2，10 mmol/L）上調(diào)FLG的表達。角質(zhì)形成細胞和T細胞共培養(yǎng)體系共培養(yǎng)體系：用內(nèi)置0.4 μm聚碳酸酯膜的 Transwell裝置共培養(yǎng)HaCaT-PBMC。HaCaT細胞（105/ml）接種于12孔Transwell培養(yǎng)板下室，PBMC（2 × 106/ml）接種于 12孔Transwell培養(yǎng)板上室。在共培養(yǎng)體系內(nèi)，先以含慶大霉素（40 mg/L）、10%人AB血清的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h；隨后用PBS洗滌1次，加入無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng) 24 h；將 TSST-1（100 μg/L）加入 Transwell裝置上室的 PBMC，同時加入不同濃度（0、10、100、1 000 μmol/L）的利多卡因，設(shè)空白對照組，培養(yǎng)72 h，將未接受TSST-1的刺激PBMC共培養(yǎng)的HaCaT細胞作為對照。

5.RNA的抽提和分析：收集HaCaT細胞離心后留下細胞團塊和適量上清（2×106細胞/100 μl），充分振蕩直至無細胞團塊。取100 μl放入微量離心管中。按RNA抽提試劑盒說明書抽提總RNA，冰上配制RT反應(yīng)液，建立20 μl反應(yīng)體系，用DNA擴增儀進行逆轉(zhuǎn)錄。用熒光實時定量PCR檢測FLG表達（以β肌動蛋白為內(nèi)參照）。引物序列：FLG：正向5′-CAAATCCTGAAGAATCCAGATGAC-3′，反向 5′-TGCTTGAGCCAACTTGAATACC-3′；β 肌動蛋白：正向 5′-GTCTTCCCCTCCATCGTG-3′，反向 5′-AGGG TGAGGATGCCTCTCTT-3′。

6.Western印跡分析：細胞總蛋白的提?。杭毎碳そY(jié)束后用冰PBS洗1次，每孔加入100 μl細胞裂解液RIPI，冰上裂解30 min，收集至1.5 ml離心管，4℃ 15 000×g離心15 min，收集上清液，測定蛋白含量。每個樣品取30 μg進行電泳，電壓調(diào)節(jié)至75 V，待條帶至分離膠處時調(diào)節(jié)電壓至110 V。將PVDF膜放入以TBST做稀釋液的一抗（FLG工作濃度 1∶500，β 肌動蛋白抗體工作濃度 1∶1 000），置于4℃結(jié)合過夜。過夜的PVDF膜以TBST清洗3次，每次10 min；將膜放入辣根過氧化酶標記二抗（羊抗兔、羊抗小鼠IgG抗體工作濃度1∶2 000）孵育1 h，TBST洗膜3次 ×10 min；ECL顯色，觀察結(jié)果。

結(jié) 果

一、細胞活力檢測

CCK-8法檢測結(jié)果表明，利多卡因在100 μmol/L時對AD患者PBMC的活力無明顯影響，在1 000 μmol/L時顯著影響AD患者PBMC的活力（圖1）。因此，后面的實驗利多卡因均采用 ≤100 μmol/L的劑量。

二、利多卡因?qū)SST-1誘導(dǎo)的AD患者PBMC增殖的影響

圖1 利多卡因?qū)μ貞?yīng)性皮炎患者外周血單一核細胞細胞活力的影響

圖2 利多卡因?qū)χ卸拘孕菘司C合征毒素1（TSST-1）和豆蔻酰佛波醇乙酯（PMA）+鈣離子載體刺激的6例特應(yīng)性皮炎患者外周血單一核細胞的增殖反應(yīng)

圖3 利多卡因?qū)χ卸拘孕菘司C合征毒素1刺激的特應(yīng)性皮炎患者外周血單一核細胞釋放白細胞介素（IL）-4、IL-5、IL-13、腫瘤壞死因子（TNF）α、干擾素（IFN）γ、IL-2、IL-10及 IL-12的影響

結(jié)果顯示，100 μmol/L的利多卡因顯著降低了TSST-1刺激的AD患者PBMC的增殖（圖2，P<0.05）。100 μmol/L的利多卡因同樣可以抑制PMA和鈣離子載體刺激的AD患者PBMC的增殖。

圖4 利多卡因顯著抑制與中毒性休克綜合征毒素1激活的特應(yīng)性皮炎患者單一核細胞共孵育的HaCaT細胞內(nèi)中間絲相關(guān)蛋白

三、利多卡因?qū)SST-1誘導(dǎo)的AD患者PBMC部分炎癥因子的影響

檢測結(jié)果表明，TSST-1顯著誘導(dǎo)了AD患者PBMC細胞因子的釋放，其中包括以下細胞因子：腫瘤壞死因子 α（TNF-α）、干擾素 γ（IFN-γ）、白細胞介素（IL）-2、IL-12、IL-4、IL-5、IL-13。利多卡因（100 μmol/L）顯著抑制了TSST-1誘導(dǎo)的AD患者PBMC 內(nèi) IL-4、IL-5、IL-13、TNF-α 和 IFN-γ 的產(chǎn)生（P<0.05），但對 IL-2、IL-10 和 IL-12的釋放無顯著影響（圖3）。

四、利多卡因顯著抑制了與TSST-1激活的AD患者PBMC共孵育的HaCaT內(nèi)FLG表達的下調(diào)

與TSST-1激活的AD患者PBMC共孵育的HaCaT細胞內(nèi)FLG蛋白的表達較單獨培養(yǎng)的HaCaT細胞內(nèi)FLG蛋白的表達明顯下調(diào)，P<0.01。在上述共培養(yǎng)體系內(nèi)，利多卡因（100 μmol/L）顯著阻斷了TSST-1激活的AD患者PBMC誘導(dǎo)的HaCaT細胞FLG蛋白的下調(diào)（圖4）。

討 論

AD患者的皮損處常出現(xiàn)可產(chǎn)生金葡菌超抗原的金葡菌定植［1-4］。近期研究發(fā)現(xiàn)，AD患者的皮膚宿主CD4+Foxp3+T細胞，經(jīng)金葡菌超抗原刺激后，表現(xiàn)出類似于Th2細胞樣的功能，這一過程可能加劇了AD［5］。金葡菌超抗原還具有通過刺激抗原提呈細胞擴大抗原特應(yīng)性的Th1細胞免疫反應(yīng)的能力，可能與AD患者慢性期免疫反應(yīng)有關(guān)［2，6-7］。金葡菌超抗原還可以通過上調(diào)與人表皮角質(zhì)形成細胞直接接觸的記憶型T細胞比率來參與AD的發(fā)病進程，這類T細胞可以遷移至皮損處，隨后被激活。目前研究發(fā)現(xiàn)，T細胞和單一核細胞釋放的TNF-α、IL-4和IL-13可以顯著下調(diào)人表皮角質(zhì)形成細胞內(nèi)FLG的表達，可能導(dǎo)致了皮膚屏障功能的缺陷［8-11］。

在本研究中，我們觀察了利多卡因?qū)SST-1刺激的AD患者PBMC的增殖和細胞因子產(chǎn)生的影響。另外，通過FLG在與SE激活的AD患者PBMC共孵育的人表皮角質(zhì)形成細胞細胞系HaCaT細胞內(nèi)的表達，驗證利多卡因是否可抑制TSST-1對AD患者PBMC的激活，以此為利多卡因作為抗炎而非麻醉藥物治療AD提供理論依據(jù)。我們首次發(fā)現(xiàn)，利多卡因（100 μmol/L）可以顯著抑制TSST-1刺激后的AD患者PBMC的增殖。另外，利多卡因（100 μmol/L）還顯著抑制了TSST-1誘導(dǎo)的AD患者PBMC部分Th1細胞因子和Th2細胞因子的釋放。上述研究提示，利多卡因?qū)γ庖呒毎赡芫哂忻庖哒{(diào)節(jié)作用。我們模仿體內(nèi)的環(huán)境，通過在與TSST-1共同刺激的AD患者PBMC共培養(yǎng)的HaCaT細胞內(nèi)FLG的表達，來檢測利多卡因是否可以抑制AD患者PBMC的激活。我們的研究結(jié)果顯示，利多卡因可以明顯阻斷與TSST-1共同刺激的AD患者PBMC共培養(yǎng)的HaCaT細胞內(nèi)FLG的下調(diào)。我們認為這與利多卡因能夠顯著抑制激活的AD患者PBMC釋放TNF-α、IL-4和IL-13有關(guān)。本文研究結(jié)果提示，利多卡因?qū)鹌暇舛舅丶せ畹难装Y性T細胞可能具有抑制作用，或許有助于皮膚屏障功能的修復(fù)。

糖皮質(zhì)激素是臨床上常用的一種治療AD的藥物。在AD的治療中，目前糖皮質(zhì)激素藥物由于其對皮膚屏障帶來的負面影響正在受到質(zhì)疑。局部應(yīng)用糖皮質(zhì)激素類藥物可能導(dǎo)致皮膚屏障恢復(fù)延遲，表皮變薄甚至導(dǎo)致抗菌肽的嚴重下調(diào)［12-14］。本研究表明，利多卡因?qū)鹌暇舛舅丶せ畹腁D患者PBMC具有抑制作用，并表現(xiàn)出修復(fù)皮膚屏障功能的潛力。利多卡因或許可作為一種新的治療AD的藥物進行研發(fā)。

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Effects of lidocaine on peripheral blood mononuclear cells from patients with atopic dermatitis stimulated by theStaphylococcus aureusexotoxin TSST-1

Wang Yuanyuan,Hu Mingjie,Zhang Jing,Huang Yinjiu,Tang Bikui,Chen Changjie,Wu Shouwei.Department of Biological Sciences,Bengbu Medical College,Bengbu 233030,Anhui,China

Wu Shouwei,Email:nlicau@126.com

Objective To investigate the effect of lidocaine onStaphylococcus aureusexotoxin-stimulated peripheral blood mononuclear cells （PBMCs）from patients with atopic dermatitis （AD）.Methods Peripheral blood samples were collected from 6 patients with AD,and PBMCs were isolated by a routine method.Then,the PBMCs were stimulated by theStaphylococcus aureusexotoxin toxic shock syndrome toxin-1 （TSST-1）in the absence or presence of lidocaine at varying concentrations.The3H-TdR incorporation method was performed to detect the proliferation of monocytes,and enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）to quantify the levels of T helper type 1 （Th1）and Th2 cytokines released by PBMCs.Human HaCaT keratinocytes were co-cultured with lidocaine-and TSST-1-stimulated PBMCs from patients with AD for 72 hours,then,Western blot was conducted to examine the expression of filaggrin protein in HaCaT cells.Results TSST-1（100 μg/L）significantly enhanced the proliferation of PBMCs from patients with AD （stimulation index=75±2.12,P<0.05）,as well as the release of tumor necrosis factor-α（TNF-α）,interferon（IFN）-γ,interleukin（IL）-2,IL-12,IL-4,IL-5 and IL-13 by the PBMCs（allP<0.05）.Compared with the blank control group,100 μmol/L lidocaine significantly inhibited the TSST-1-stimulated proliferation of PBMCs from patients with AD （stimulation index=58±3.14,P<0.05）,as well as the release of IL-4,IL-5,IL-13,TNF-α and IFN-γ by the stimulated PBMCs （allP<0.05）.Western blot showed that 100 μmol/L lidocaine significantly blocked the down-regulation of filaggrin expression in HaCaT cells （P<0.01）.Conclusion Lidocaine has a significant inhibitory effect on the activation of TSST-1-stimulated PBMCs from patients with AD.

Atopic dermatitis;Staphylococcus aureus;Exotoxins;Lidocaine;Monocytes特應(yīng)性皮炎（atopic dermatitis,AD）患者常出現(xiàn) 金黃色葡萄球菌（簡稱金葡菌）定植，且皮損處較非皮損處定植明顯［1-2］。金葡菌能夠釋放外毒素，中毒性休克綜合征毒素1（toxic shock syndrome toxin,TSST-1）是其中最主要的一種，具有超抗原的特性，可以結(jié)合主要組織相容性Ⅱ類分子，低選擇性地激活表達某些受體Vβ鏈家族的T細胞。TSST-1可通過誘導(dǎo)T細胞增殖和細胞因子釋放的方式誘發(fā)或加重AD患者的皮炎［3］。研究發(fā)現(xiàn)，與健康對照相比，TSST-1可刺激AD患者外周血單一核細胞（PBMC）釋放更多的 Th2 細胞因子［4］。文獻［5］報道，利多卡因具有抗炎作用，在過敏性疾病的治療中可作為免疫調(diào)節(jié)類藥物使用。最新研究發(fā)現(xiàn)，利多卡因可以顯著抑制金葡菌外毒素SEA和SEB刺激的AD患者PBMC的激活，但金葡菌其他類型的外毒素對其影響尚未見報道［6］。在本研究中，我們研究了利多卡因?qū)SST-1刺激的AD患者PBMC的增殖和細胞因子產(chǎn)生的影響。

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.01.010

安徽省高校省級優(yōu)秀青年人才基金重點項目（2013SQRL050ZD）；蚌埠醫(yī)學(xué)院科技發(fā)展基金（Bykf13A01）

233030安徽，蚌埠醫(yī)學(xué)院生物科學(xué)系

吳守偉，Email：nlicau@126.com

2014-03-30）

（本文編輯：吳曉初）