西沙野生諾尼葉片內(nèi)生菌的分離與初步鑒定

白飛榮, 劉 洋,*, 曹艷花, 姚 粟, 李金霞, 譚望橋, 程 池,*

（1.中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，北京 100015；2.海南諾尼生物工程開(kāi)發(fā)有限公司，海南?？?570125）

西沙野生諾尼葉片內(nèi)生菌的分離與初步鑒定

白飛榮1, 劉 洋1,*, 曹艷花1, 姚 粟1, 李金霞1, 譚望橋2, 程 池1,*

（1.中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，北京 100015；2.海南諾尼生物工程開(kāi)發(fā)有限公司，海南海口 570125）

主要研究西沙群島野生諾尼葉片中可培養(yǎng)內(nèi)生菌的多樣性。利用常規(guī)平板分離方法進(jìn)行菌株分離。通過(guò)測(cè)定真菌核糖體基因翻譯間隔序列（ITS序列）和細(xì)菌16S rDNA基因序列，結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育研究對(duì)所分離菌株進(jìn)行鑒定分析。共分離到32株內(nèi)生菌，分為19種。其中2種霉菌，共2株，分別屬于炭層菌屬（Nemania sp.）和毛殼菌屬（Chaetomium sp.）；細(xì)菌17種，共30株，分別屬于芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）、賴氨酸芽孢桿菌屬（Lysinibacillus sp.）、微球菌屬（Micrococcus sp.）、土地芽孢桿菌屬（Terribacillus sp.）、腸桿菌屬（Enterobacter sp.）、黃單胞菌屬（Xanthomonas sp.）、黃桿菌屬（Flavobacterium sp.）等7個(gè)已知屬，其中芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)屬，共20株，11種。

西沙野生諾尼葉片；內(nèi)生細(xì)菌；群落多樣性

諾尼（Morinda citrifolia Linn.）又稱為海巴戟天、海濱木巴戟、諾尼、水冬瓜，被子植物門(mén)（Angiospermae）木蘭綱（Magnoliopsida）茜草目（Rubiales）茜草科（Rubiaceae）巴戟天屬（Morinda）植物，是一種熱帶常綠多年生闊葉灌木或小喬木［1］，主要分布在南太平洋熱帶諸島，菲律賓，澳大利亞，柬埔寨以及我國(guó)海南島，我國(guó)西沙群島和我國(guó)臺(tái)灣島［2］。早在2000多年前，波利尼亞人就利用諾尼葉片來(lái)治療各種疾病，以及為服裝染色［3］。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外科學(xué)研究主要針對(duì)諾尼的生理生化方面，已證明諾尼中含有莨菪亭、鉀、維生素C、萜類(lèi)化合物、生物堿、蒽醌、甲基醚、谷甾醇、胡蘿卜素、維生素A、黃酮、亞油酸、茜素、氨基酸等多種化學(xué)成分［4-5］。通過(guò)免疫機(jī)理的研究，證實(shí)了諾尼具有各種醫(yī)療保健作用，包括抗腫瘤、抗氧化、抗菌消炎、抗焦慮、抗皺、護(hù)肝、改善糖尿病、改善痛風(fēng)等功效［6-11］。2002年歐洲食品科學(xué)委員會(huì)（Scientific Committee on Food，SCF）對(duì)諾尼進(jìn)行了食品安全性鑒定，認(rèn)為其是安全的。諾尼作為一種國(guó)際上比較流行的多功能保健產(chǎn)品，其產(chǎn)品具有廣闊的市場(chǎng)前景，值得深入研究。

諾尼葉片呈深綠色，有光澤，膜質(zhì)，對(duì)生，橢圓形或廣橢圓形，長(zhǎng)10～25 cm，寬5～10 cm，頂端急尖或短漸尖，基部闊楔形；側(cè)脈每邊6～7條，在葉片腹面微凸起，背面凸起明顯，脈腋內(nèi)常有短束毛；葉柄長(zhǎng)5～12 mm；托葉大，膜質(zhì)，長(zhǎng)5～12 mm，頂端鈍［12］。諾尼新鮮葉子可直接咀嚼或包裹，或者加水熬汁飲用或浸泡，也可曬干磨成粉末。在巴西稱諾尼葉為“止痛草”，其對(duì)牙齦炎、牙周病、喉痛、喉炎、感冒、頭痛、發(fā)燒、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)、骨折、扭傷、皮膚病等均有一定的功效［13］。

內(nèi)生菌（endophytes）是一類(lèi)可以和植物互利共生的微生物，經(jīng)研究證明它們可以增加植物的生長(zhǎng)發(fā)育和抗逆能力，也可通過(guò)產(chǎn)生一些代謝產(chǎn)物，而提高植物的藥用性能［14］。本文主要研究諾尼葉片中可培養(yǎng)內(nèi)生菌的多樣性，將為諾尼葉片中功能性微生物的開(kāi)發(fā)利用奠定良好的基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)樣品為野生諾尼的新鮮葉片（見(jiàn)圖1），采集自中國(guó)海南省三沙市永興島（北緯16.83°，東經(jīng)112.34°），共計(jì)645 g。樣品存放無(wú)菌自封袋中，4℃保存。

圖1 野生諾尼葉片樣品Fig.1 Wild Noni leaves samples

1.2 培養(yǎng)基

玫瑰紅鈉和PDA培養(yǎng)基用于真菌的分離純化，R2A和LB培養(yǎng)基用于細(xì)菌的分離純化，均購(gòu)于北京陸橋公司。

1.3 內(nèi)生菌的分離培養(yǎng)和保存

采用稀釋平板涂布法分離培養(yǎng)諾尼葉片中的內(nèi)生菌。取不同枝條上的健康葉片，稱取10 g進(jìn)行表面滅菌，先用無(wú)菌水沖洗2次，濾紙吸干水分后，用體積分?jǐn)?shù)為75%的酒精浸泡30 s，再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的氯化汞溶液浸泡3 min，最后用無(wú)菌水沖洗3次。用無(wú)菌剪刀剪碎葉片，于無(wú)菌研缽中加入少量滅菌的石英砂和碳酸鈣及少量無(wú)菌水充分研磨，然后依次用無(wú)菌水稀釋成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1×10-1、1× 10-2、1×10-3的組織懸液。

分別取100 μL懸液涂布于玫瑰紅鈉平板（平板含有25 mg/mL氯霉素和25 mg/mL四環(huán)素）和R2A平板上，每個(gè)處理3個(gè)平行。玫瑰紅鈉平板置于25℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，從第2 d開(kāi)始對(duì)平板上的單菌落進(jìn)行分離計(jì)數(shù)，共7 d，根據(jù)菌落形態(tài)（包括大小、形狀、顏色、質(zhì)地、有無(wú)滲透液，有無(wú)可溶性色素等），對(duì)可培養(yǎng)真菌進(jìn)行初步篩選，并利用PDA培養(yǎng)基平板純化菌株；R2A平板置于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，從第一天開(kāi)始對(duì)平板上的細(xì)菌單菌落進(jìn)行分離計(jì)數(shù)，共4 d，根據(jù)菌落形態(tài)（包括大小、形狀、顏色、表面光澤度、邊緣整齊度、透明度和質(zhì)地等）進(jìn)行初步篩選，利用LB培養(yǎng)基平板劃線純化菌株。純化好的菌株，利用試管保藏備份，并提交給中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心（CICC）保藏。

1.4 內(nèi)生菌的DNA提取與鑒定

1.4.1 內(nèi)生真菌的DNA提取與擴(kuò)增

采用傳統(tǒng)CTAB抽提方法，提取內(nèi)生真菌基因組DNA，采用通用引物：ITS1（5′-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3′）和ITS4（5′-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3′）擴(kuò)增ITS基因序列［15］。PCR反應(yīng)體系為：模板10×PCR buffer 5 μL、dNTP（2.5 mmol/L）4 μL、模板2 μL、Taq DNA聚合酶1 μL、引物各1 μL，補(bǔ)充去離子水至50 μL。反應(yīng)條件：94℃5 min；94℃50 s，55℃50 s，72℃50 s，33個(gè)循環(huán)；72℃7 min。PCR產(chǎn)物用1%凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，約為600 bp。

1.4.2 內(nèi)生細(xì)菌的DNA提取與擴(kuò)增

利用天根公司細(xì)菌基因組提取試劑盒，提取內(nèi)生細(xì)菌基因組DNA，采用通用引物：27f（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492r（5′-GGTTACCT TGTTACGACTT-3′）擴(kuò)增16S rDNA基因序列。PCR反應(yīng)體系同真菌體系。反應(yīng)條件：94℃5 min；94℃1 min，55℃1 min，72℃1.3 min，35個(gè)循環(huán)；72℃10 min。PCR產(chǎn)物用1%凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，約為1 500 bp。

所有PCR產(chǎn)物都送交上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序，真菌序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已知序列進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，細(xì)菌序列與EzBio-Cloud數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，尋找具有較高同源性的目標(biāo)序列。確定各菌株的有效序列后用ClustalX 1.83進(jìn)行多序列比對(duì)，再用MEGA 5.0進(jìn)行鄰接法（Neighbor-Joining）聚類(lèi)系統(tǒng)發(fā)育分析［16］。1 000次（Bootstrap value）重復(fù)自檢分析。各個(gè)種的代表序列均已提交到GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)，并得到登錄號(hào)KC708557～KC708575。

2 結(jié)果和分析

2.1 諾尼葉片中可培養(yǎng)內(nèi)生菌的分離結(jié)果

通過(guò)分離純化共得到諾尼葉片內(nèi)生菌32株，利用測(cè)序分析和形態(tài)學(xué)觀察方法，將其分為19種。其中霉菌2株，分為2種；細(xì)菌30株，分為17種。菌株形態(tài)描述見(jiàn)表1。

表1 諾尼葉片內(nèi)生菌株的形態(tài)描述Tab.1 Morphological description of endophytes from Noni leaves samples

2.2 諾尼葉片中可培養(yǎng)內(nèi)生菌的多樣性分析

真菌分離結(jié)果中未得到酵母菌株，只分離到2種霉菌，各一株（NY1，NY2），分屬于炭層菌屬（Nemania sp.）和毛殼菌屬（Chaetomium sp.），見(jiàn)表2。

共分離到30株細(xì)菌，通過(guò)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分為4支（見(jiàn)圖2），隸屬于4個(gè)門(mén)，7個(gè)屬。其中厚壁菌門(mén)（Firmicutes）包括3個(gè)屬，分別為芽孢桿菌屬（Bacillus sp.），賴氨酸芽孢桿菌屬（Lysinibacillus sp.），土地芽孢桿菌屬（Terribacillus sp.）。變形菌門(mén)（Proteobacteria）包括2個(gè)屬，為黃單胞菌屬（Xanthomonas sp.）和腸桿菌屬（Enterobacter sp.）。放線菌門(mén)（Actinobacteria）包括1個(gè)屬，為微球菌屬（Micrococcus sp.）。擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）包括1個(gè)屬，為黃桿菌屬（Flavobacterium sp.）。

表2 諾尼葉片中內(nèi)生菌分離結(jié)果Tab.2 Isolation results of endophytes from Noni leaves samples

續(xù)表2

圖2 基于16S rDNA序列構(gòu)建的野生諾尼葉片內(nèi)生細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 16S rDNA phylogenetic tree of endophytes from Noni leaves samples

由表2可知，芽孢桿菌屬為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)屬，分離率達(dá)66.7%，豐富度為55%；賴氨酸芽孢桿菌屬次之，分離率為13.3%。優(yōu)勢(shì)種［17］有彎曲芽孢桿菌（Bacillus flexus），共6株，分離率為20%；蠟樣芽孢桿菌Bacillus cereus 3株，分離率為10%；解木糖賴氨酸芽孢桿菌（Lysinibacillus xylanilyticus）3株，分離率為10%。Bacillus methylotrophicus和Lysinibacillus macroides均為近年來(lái)發(fā)表的新種，Lysinibacillus macroides為中國(guó)新記錄種［18-19］。

3 討 論

植物內(nèi)生菌是指生活史中某一階段生活在植物組織內(nèi)，對(duì)植物沒(méi)有引起明顯病害癥狀的一類(lèi)微生物，可從經(jīng)過(guò)嚴(yán)格表面消毒的植物組織分離得到。其具有固氮、促植物生長(zhǎng)、增強(qiáng)宿主植物抗逆境、抗病蟲(chóng)害等作用，它們的代謝產(chǎn)物可能具有良好的藥用價(jià)值，并可能與植物的藥用價(jià)值密切相關(guān)［20］。

本文從野生諾尼葉片中共分離到可培養(yǎng)菌株32株，分離數(shù)量較少，原因可能如下1）本研究采用升汞表面滅菌的方法，升汞較強(qiáng)的腐蝕性可能會(huì)殺死部分內(nèi)生菌株；2）諾尼本身具有抑菌活性，導(dǎo)致內(nèi)生菌數(shù)量較少；3）在葉片和根等器官中內(nèi)生菌含量原本就極少［20］。本研究分離鑒定結(jié)果顯示諾尼葉片中的優(yōu)勢(shì)微生物為桿狀細(xì)菌，其中芽孢桿菌屬（Bacillus spp.）、賴氨酸芽孢桿菌屬（Lysinibacillus spp.）為優(yōu)勢(shì)屬，這與劉洋等諾尼種子內(nèi)生細(xì)菌多樣性研究結(jié)果相符［21］，且許多其他植物內(nèi)生細(xì)菌的研究結(jié)果也都表明芽孢桿菌或產(chǎn)芽孢細(xì)菌常為優(yōu)勢(shì)菌屬［22-24］，說(shuō)明產(chǎn)芽孢細(xì)菌為一類(lèi)非常重要的植物內(nèi)生菌，值得進(jìn)一步開(kāi)發(fā)研究。本文中的優(yōu)勢(shì)種彎曲芽孢桿菌（Bacillus flexus）為重要的工業(yè)產(chǎn)堿性淀粉酶菌株；蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）可產(chǎn)生抗菌物質(zhì)和細(xì)菌蛋白酶，可能與植物抵御病害能力有關(guān)；解木糖賴氨酸芽孢桿菌（Lysinibacillus xylanilyticus）為一種可降解木聚糖的菌株，且在豬籠草、香樟、夏枯草等藥用植物內(nèi)生細(xì)菌研究中均有分離。

內(nèi)生菌作為一類(lèi)重要的植物生存伴侶，在植物生長(zhǎng)發(fā)育中起著重要的作用，往往容易被人們所忽視，目前許多植物內(nèi)生菌研究在持續(xù)進(jìn)行，得到了許多重要的發(fā)現(xiàn)。諾尼作為一種國(guó)際熱銷(xiāo)保健產(chǎn)品，內(nèi)生菌與其藥理活性關(guān)系值得研究，本文將為諾尼內(nèi)生菌的研究開(kāi)辟道路，奠定基礎(chǔ)。

致 謝

本研究得到了海南省三沙市政府的大力支持與幫助，在此表示衷心地感謝！

［1］曹艷花，劉洋，姚粟，等.西沙野生諾尼內(nèi)生細(xì)菌群落多樣性初步研究［J］.食品科學(xué)技術(shù)學(xué)報(bào)，2014，32（2）：39-45.

［2］廣東省植物研究所.海南植物志：第3卷［M］.北京：科學(xué)出版社，1974：330-331.

［3］Palu A K，Kim A H，West B J，et al.The effects of Morinda citrifolia L.（Noni）on the immune system：its molecular mechanisms of action［J］.J Ethnopharmacol，2008，12：115（3）：502-506.

［4］Wang M Y，West B，Jensen C J，et al.Morinda citrifolia（Noni）：a literature review and recent advances in Noni research［J］.Acta Pharmacol Sin，2002，23（12）：1127-1141.

［5］Yanine C，F(xiàn)abrice V，Ana M P，et al.The Noni fruit：a review of agricultural research nutritional and therapeutic properties［J］.Journal of Food Composition and Analysis，2006，19：645-654.

［6］Akihisa T，Matsumoto K，Kimura Y，et al.Anti-inflammatory and potential cancer chemopreventive constituents of the fruits of Morinda citrifolia（Noni）［J］.J Nat Prod，2007，70（5）：754-758.

［7］Mohd Z，Abdul-Hamid A，Osman A，et al.Antioxidative activity of extracts from Mengkudu（Morinda citrifolia L.）root，fruit and leaf［J］.Food Chemistry，2001，78：227-231.

［8］Deng S，West B J，Palu A K，et al.Noni as an anxiolytic and sedative：a mechanism involving its gamma-aminobutyric acidergic effects［J］.Phytomedicine，2007，14（7-8）：517-522.

［9］Kim S W，Jo B K，Jeong J H，et al.Induction of extracellularma-trix synthesis in normal human fibroblasts by anthraquinone isolated from Morinda citrifolia（Noni）fruit［J］.J Med Food，2005，8（4）：552-555.

［10］Wang M Y，Anderson G，Nowicki D，et al.Hepatic protection by Noni fruit juice against CCl4-induced chronic liver damage in female SD rats［J］.Plant Foods Hum Nutr，2008，63（3）：141-145.

［11］Owen P L，Martineau L C，Caves D，et al.Consumption of guava（Psidium guajava L）and Noni（Morinda citrifolia L）may protect betel quid-chewing papua new guineans against diabetes［J］.Asia Pac J Clin Nutr，2008；17（4）：635-643.

［12］李法營(yíng)，藍(lán)增全，李青紅，等.諾麗研究進(jìn)展（一）［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37（32）：15819-15821.

［13］張偉敏，魏靜，劉四新，等.Noni果的活性成分和生理功能的研究進(jìn)展［J］.天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)，2007，19：1087-1091.

［14］Van Wees S C，Pieteerse C M J，Trijssenaar A，et al. Differential induction of systemic resistance in arabidopsis by biocontrol bacteria［J］.Molecular Plant-Microbe Interactions，1997，10（6）：716-724.

［15］Jin S L，Kwan S K，Hack S J.Phylogenetic analysis of Xylaria based on nuclear ribosomal ITS1-5.8S-ITS2 sequences［J］.FEMS Microbiology Letters，2000，187：89-93.

［16］Saitou N，Nei M.The neighbor joining method，a new method for reconstructing phylogenetic trees［J］.Molecular Biology and Evolution，1987，4（4）：406-425.

［17］龐龍飛，尤民生.昆蟲(chóng)群落生態(tài)學(xué)［M］.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1996：77-103.

［18］Madhaiyan M，Poonguzhali S，Kwon S W，et al.Bacillus methylotrophicus sp.nov.，a methanolutilizing，plantgrowth-promoting bacterium isolated from rice rhizosphere soil［J］.International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，2010，60（10）：2490-2495.

［19］Coorevits A，Dinsdale A E，Heyrman J，et al.Lysinibacillus macroides sp.nov.，nom.rev.［J］.International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，2012，62（5）：1121-1127.

［20］文才藝，吳元華，田秀玲.植物內(nèi)生菌研究進(jìn)展及其存在的問(wèn)題［J］.生態(tài)學(xué)雜志，2004，23（2）：86-91.

［21］劉洋，李輝，程池，等.西沙野生諾尼種子內(nèi)生細(xì)菌群落多樣性的初步研究［J］.生物技術(shù)通報(bào)，2013（10）：142-147.

［22］宋培勇，蘭琴英，魯卓越.南方紅豆杉內(nèi)生細(xì)菌分離鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析［J］.生物技術(shù)，2012，22（5）：61-65.

［23］宋培勇，李鳳華，馬莉莉.南方紅豆杉內(nèi)生細(xì)菌分離鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析［J］.微生物學(xué)通報(bào)，2011，38（1）：8-13.

［24］游玲，魏琴，張?jiān)频?山蒼子（Litsea cubeba）可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌的多樣性［J］.西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，40（4）：1-7.

Isolation and Identification of Endophytes in Wild Noni Leaves from Paracel Islands

BAI Feirong1， LIU Yang1，*， CAO Yanhua1， YAO Su1， LI Jinxia1
TAN Wangqiao2， CHENG Chi1，*
（1.China National Research Institute of Food and Fermentation Industies，China Center of Industrial Culture Collection，Beijing 100015，China；2.Hainan Noni Biological Engineering Development Co.Ltd.，Haikou 570125，China）

The diversity of culturable endophytes in wild Noni leaves from Paracel Islands was discussed in this study.Strains were isolated by using conventional tablet separation methods.The isolates were identified by the fungal internal transcribed spacer 1 and 2（ITS gene）amplification and the bacterial 16S rDNA amplification，combined with phylogenetic analysis.Total 32 endophytes were isolated and identified as 19 types.Two types of mold were Chaetomium sp.and Nemania sp.Seventeen types of bacteria（30 strains）belonged to 7 genera Bacillus sp.，which were Lysinibacillus sp.，Micrococcus sp.，Terribacillus sp.，Enterobacter sp.，Xanthomonas sp.，F(xiàn)lavobacterium sp.，and Bacillus sp..Bacillus sp.was the dominant genus among the endophytic bacte，which had 20 strains divided into 11 types.

Noni leaves from Paracel islands；endophytic bacteria；community diversity

李 寧）

TS201.3

A

10.3969/j.issn.2095-6002.2015.01.006

2095-6002（2015）01-0032-06

白飛榮，劉洋，曹艷花，等.西沙野生諾尼葉片內(nèi)生菌的分離與初步鑒定［J］.食品科學(xué)技術(shù)學(xué)報(bào)，2015，33（1）：32-37.

BAI Feirong，LIU Yang，CAO Yanhua，et al.Isolation and identification of endophytes in wild Noni leaves from Paracel islands［J］.Journal of Food Science and Technology，2015，33（1）：32-37.

2014-02-28

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31300008）；國(guó)家微生物資源平臺(tái)專項(xiàng)（NIMR2014-4）；中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院科技發(fā)展基金

（博士基金）項(xiàng)目（2012KJFZ-BS-01）；北京市科技新星計(jì)劃項(xiàng)目（Z141105001814095）。

白飛榮，男，助理工程師，碩士，主要從事微生物分類(lèi)學(xué)研究；

*程 池，男，教授級(jí)高級(jí)工程師，主要從事微生物學(xué)方面的研究。

。

*劉 洋，男，工程師，博士，主要從事微生物生態(tài)學(xué)方面的研究。

。