王文健 趙瑞君 李 珀 杜 斌 原發(fā)家 聶守民 程璟俠 李彥紅

(1. 山西醫(yī)科大學基礎醫(yī)學部，寄生蟲學教研室，太原 030001； 2. 山西省疾病預防控制中心病媒生物防控科，太原 030001; 3.山西醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院心內科, 太原 030001)

如今臨床抗感染治療中抗生素在面對諸多耐藥菌株時已失去昔日的輝煌，青霉素的時代即將逝去，一個嶄新的時代就要來臨——抗菌肽時代。自Boman等(1980)從天蠶蛹的血淋巴中分離得到天蠶素(Cecropin)抗菌肽A和B,使人們對抗菌肽的作用機理和應用有了一個嶄新的認識(Hou，2007)。Sup-b15細胞株屬于人Ph+急淋白血病(ALL)細胞系。在我國ALL發(fā)病率約為0.67/10萬。ALL兒童期(0～9歲)為發(fā)病高峰，可占兒童白血病的70%以上，ALL在成人中占成人白血病的20%左右。在治療方面，傳統的放化療副作用太大，這就需要尋找一種更為有效且副作用低的治療方式。對于家蠅Muscadomestica抗菌肽的研究，趙瑞君等(2007)和丘曉燕等(2003)發(fā)現其粗提物對腫瘤細胞109、K562、Daudi、T24、MCF-7、BGC-823、MCC-803、SPA-A-1均有抑制作用，而對正常細胞沒有抑制。通過查閱相關的文獻資料未發(fā)現有關家蠅幼蟲抗菌肽對sup-b15細胞及粗提物與純化物的對比研究。本實驗旨在為將來有關這方面的研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗材料：家蠅Muscadomestica三齡幼蟲由山西省疾病預防控制中心提供；大腸桿菌由本實驗室保存，sup-b15細胞株由山西醫(yī)學科學研究院血液科惠贈。

1.1.2主要試劑和設備：苯甲基磺酰氟(PMSF)，美國Sigma公司；IMDM培養(yǎng)基，博士德生物；胎牛血清，杭州四季青公司；CCK-8試劑盒，碧云天生物技術研究所；Annexin V-FITC-PI細胞凋亡檢測試劑盒，上海前塵生物科技有限公司；反相高效液相色譜儀TG328B，美國Agilent公司；真空冷凍干燥機 FD-1-50，北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；核酸蛋白測定儀，德國艾本德公司；流式細胞儀 FACS Calibur，B.D Corp，USA。

1.2 方法

1.2.1抗菌肽提取分離純化：將家蠅三齡幼蟲以同等質量隨機分成兩組，其中一組(誘導組)用昆蟲針蘸取大腸桿菌菌液針刺幼蟲后腹壁脂肪層，另一組(對照組)不做處理，繼續(xù)飼養(yǎng)24 h。將兩組幼蟲分別置于預冷的研缽中冰浴研磨，同時加入m(g)/V(mL)=1/3提取液(內含1 mmol/L PMSF的生理鹽水)。研磨后以12 000 r/min，4℃離心30 min，取上清，重復離心3次，4℃保存。經Sep-Pak C18柱固相萃取(樊宏英，2011)得到家蠅幼蟲抗菌肽粗提物，保存于-80℃冰箱。利用反相高效液相色譜儀(RP-HPLC)進行分離純化，并記錄出峰情況，根據出峰時間收集蛋白質并分裝標記。再將其與粗提物放入-80℃冰箱預凍24h后置于真空冷凍干燥機濃縮，36 h后用PBS重溶檢測濃度，-20℃冷凍保存。

1.2.2CCK-8試劑盒檢測細胞增值抑制率：培養(yǎng)sup-b15(懸浮細胞)選用含20%胎牛血清1%雙抗的IMDM培養(yǎng)基，置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱，每2～3 d換液，5～6 d傳代。取對數生長期細胞，調整濃度至2×104cells/mL，加入96孔板，每孔100 μL，每組平行設置3個復孔。將各組抗菌肽50 μL(100 μg/mL)加入對應孔中，對照組加入50 μL PBS，37℃、5%CO2培養(yǎng)。36 h后(對照組處于細胞對數生長期)向每孔加入15 μL CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，450 nm檢測吸光度(OD值)，并記錄各組數值。根據公式計算出各組抗菌肽的細胞生存率：細胞生存率=(實驗組OD值/對照組OD值)×100%

1.2.3用Annexin V-FITC-PI細胞凋亡檢測試劑盒檢測sup-b15的凋亡率：將對數生長期sup-b15細胞濃度調整為2×106cells/mL，加入24孔板(每孔1 mL),每組設置3個復孔。將0.5 mL終濃度為100 μg/mL的各組抗菌肽加入實驗組各孔，對照組每孔加入0.5 mL PBS，37℃、5%CO2培養(yǎng)36 h。待培養(yǎng)完后2 000 r/min、4℃離心5 min，棄上清液收集懸浮細胞，用預冷的PBS洗滌細胞(2 000 r/min、4℃離心5 min)兩次，再加入400 μL 1×Binding Buffer輕輕重懸細胞，收集濃度大約5×105cells/mL。在細胞懸液中加入5 μL Annexin V-FITC，輕輕混勻后于4℃避光條件下孵育15 min。最后加入10 μL PI染色液輕輕混勻于4℃避光條件下孵育5 min，30 min內用流式細胞儀進行檢測。

2 結果

2.1 抗菌肽分離純化蛋白RP-HPLC色譜圖分析

通過對比兩張峰值圖發(fā)現，圖1-B中保留時間為3.741、7.499、32.746、33.318的峰值較圖1-A明顯增高，說明這些蛋白質在誘導刺激后表達量顯著增加；圖1-B較圖1-A新出現了保留時間為4.973、12.209、14.982、15.240的峰，說明經誘導刺激后有新生成的蛋白質產生。這些蛋白即為實驗進一步研究的家蠅幼蟲純化抗菌肽。為此我們將含量增加(Increased)保留時間為3.741、7.499、32.746、33.318的蛋白按順序分別標記為I1、I2、I3、I4組；新生成(Generate)保留時間為4.973、12.209、14.982、15.240的蛋白按順序分別標記為G1、G2、G3、G4組；誘導組抗菌肽粗提物(Extracts)標記為E0組。

2.2 CCK-8試劑盒檢測家蠅幼蟲抗菌肽對sup-b15細胞生長抑制

CCK8結果顯示，與對照組相比，I1、I2、I4、G2、E0組細胞生長得到明顯抑制，五組細胞的生存率(圖2)分別為0.714±0.032、0.785±0.023、0.641±0.065、0.686±0.034、0.561±0.025,差異具有統計學意義(P<0.05)，其余組與對照組相比，差異不具有統計學意義(P>0.05)。

圖1 RP-HPLC色譜圖(A：對照組B：誘導組)Fig.1 RP-HPLC chromatogram (A: Control group B: Induction group)

2.3 流式細胞儀檢測家蠅幼蟲抗菌肽對sup-b15細胞引起的細胞凋亡作用結果

我們根據CCK-8檢測結果，選取對細胞生長抑制明顯的I1、I2、I4、G2、E0五組進行流式實驗，結果(圖3，表1)經卡方檢驗組間比較可得，I1、I2、I4、G2、E0組對sup-b15細胞均具有一定的促凋亡作用，與對照組相比具有統計學意義(P<0.05)。其中，E0組細胞凋亡明顯，而I1、I2、I4、G2組促凋亡作用均弱于E0組，差異具有統計學意義(P<0.05)。

表 1 各組抗菌肽作用sup-b15細胞凋亡結果Tab.1 Apoptotic role of antimicrobial peptides sup-b15

圖2 各組抗菌肽作用sup-b15細胞的生存率Fig.2 Cell survival of antimicrobial peptides in each group sup-b15其中橫坐標1～9分別代表I1、I2、I3、I4、G1、G2、G3、G4、E0組。1-9 in the abscissa represent I1, I2, I3, I4, G1, G2, G3, G4, E0 group.

圖3 各組抗菌肽對sup-b15細胞的凋亡作用Fig.3 Apoptosis in each group of antimicrobial peptides sup-b15 cells其中圖ABCDEF分別代表對照組、I1、I2、I4、G2、E0組ABCDEF represent the control group, I1, I2, I4, G2, E0 group， respectively.

3 討論

近年來國內外有許多學者一直致力于抗菌肽的研究中，已從多種生物體內(如昆蟲、植物、動物及人體內)提取出抗菌肽。在ANTIMIC(目前最大的抗菌肽數據庫)已收錄抗菌肽種類達1 700余種(均為非人工合成、自然存在的抗菌肽)。在SAPD數據庫現已收錄246種不同的人工抗菌肽(Suttmannetal.，2008)，目前已分離、有些已測定了氨基酸序列的昆蟲抗菌肽達到100余種,其中蠅類就達17種(李改瑞等，2010)。家蠅有著能夠在雜菌橫生的環(huán)境里生長但自身卻很少因患病而死亡的特點，以及在我國分布廣、數量多、容易養(yǎng)殖、成本低等諸多優(yōu)點，這就使得家蠅抗菌肽對我們更有科研意義和醫(yī)用價值。然而隨著家蠅抗菌肽對于腫瘤的研究不斷深入預示其作為抗腫瘤藥物，有著廣闊的開發(fā)應用前景。

實驗結果證明了家蠅幼蟲抗菌肽對sup-b15細胞有增殖抑制及誘導凋亡的作用。而且在利用RP-HPLC對抗菌肽粗提物分離純化實驗的環(huán)節(jié)上加設了對照組，較樊宏英等(2011)、魏洪等(2011)的方法更具有科學性，實驗通過誘導組與未誘導組的對比證明了目的蛋白是通過誘導產生或誘導之后含量是明顯增加的，而并非家蠅幼蟲本身就存在或誘導無差異。實驗利用CCK-8、流式細胞術對分離純化目的蛋白進行檢測，結果顯示目的蛋白確實對sup-b15細胞有增殖抑制和誘導凋亡的作用，這與金小寶等(2012)、程璟俠等(2014)用純化抗菌肽作用諸多腫瘤細胞的結果相符。

研究過程中發(fā)現，并非所有目的蛋白對sup-b15細胞的抑制作用均具有統計學意義(P<0.05)，有些甚至促進其生長(生存率>1，如G3組蛋白)，根據檢測結果說明粗提物對腫瘤細胞的作用效果較純化蛋白明顯。本實驗以質量濃度為單位，在相同條件下粗提物各有效成分含量均低于純化蛋白，作用效果應低于純化蛋白，但實驗結果顯示卻與之相反。這與提純的中藥成分往往不如“本草”的療效具有相似性，還需要通過實驗進行深一步的研究。發(fā)現，抗菌肽的抗腫瘤機制比較復雜，迄今為止仍沒有一種公認的學說能夠闡明抗菌肽抗腫瘤的作用機制(王芳和張雙全，1999；張雙全等，2002；金小寶等，2011；夏麗潔等，2014)，歸納總結其機制主要是通過接觸性抑制和非接觸性抑制兩個方面殺傷腫瘤細胞(Orsolicetal.，2005)?？咕拇痔嵛锍煞种杏幸恍┑鞍啄軌蛑苯託[瘤細胞，而另一些對其不產生抑制作用的蛋白在整個反應過程中又扮演什么樣的角色？雖然抗菌肽相關文獻還沒有這方面的相關報道，但是在查看抗菌肽抑菌作用的論文時得到不少啟示：幾種蛋白之間類似于抗菌肽和抗生素聯合作用抑菌時存在協同作用(劉倚帆等，2010；宮霞等，2005)；某些蛋白對其他有直接抑殺作用的蛋白起到表達調控的作用(張龔煒等，2009)；作為佐劑(陳立春，2012)在免疫表達方面起到至關重要的作用；作為酶起到催化作用，促進有抑制作用的蛋白產生功效；其中兩種，甚至幾種無效的蛋白之間存在聚合反應從而抑制腫瘤；是凋亡細胞產生的物質激活了原先無效的蛋白。以上是一些具有可能性的預想，還需要進一步的研究來論證。雖然目前對蠅源抗菌肽各方面的研究還不夠透徹，更缺乏臨床實驗作為理論依據，相信在不久的將來抗菌肽將以其獨特的優(yōu)點為人類服務的。