王海玲 萬(wàn)道正 張曉龍 孫肖紅 梁中平 于建國(guó) 楊會(huì)敏 徐寶梁**

(1.中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，國(guó)家質(zhì)檢總局外來(lái)醫(yī)學(xué)媒介生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100121；2.憑祥出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣西憑祥 532600)

目前物種經(jīng)典的分類(lèi)系統(tǒng)是以形態(tài)特征為主要依據(jù)。形態(tài)特征是生物遺傳進(jìn)化過(guò)程中的間斷表現(xiàn)形式，在很多情況下，可以作為區(qū)分物種和推斷系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的依據(jù)，但是，對(duì)于有些還未達(dá)到形態(tài)改變的種，僅用形態(tài)特征來(lái)判斷是不能解決問(wèn)題的。對(duì)于種征而言，不同的物種會(huì)呈現(xiàn)類(lèi)似的變異，所以一個(gè)變種可能會(huì)具有其近緣種的特征或重現(xiàn)祖征(Darwin, 1999)，因此，如果簡(jiǎn)單的從形態(tài)特征方面判斷容易導(dǎo)致構(gòu)建錯(cuò)誤的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。另一方面，形態(tài)鑒定同時(shí)容易受到個(gè)體的表型可塑性和遺傳可變性的影響，從而導(dǎo)致不正確的鑒定結(jié)果。并且形態(tài)學(xué)鑒定受生物性別和發(fā)育階段的限制，就會(huì)有某些生物無(wú)法被鑒定(王剛，2011)。這就不得不促使人類(lèi)尋求依賴于形態(tài)學(xué)特征以外的方法進(jìn)行物種分類(lèi)。Hebert等(2003)對(duì)動(dòng)物界，包括脊椎動(dòng)物和無(wú)脊椎動(dòng)物共11門(mén)13 320個(gè)物種的COⅠ基因序列比較分析，結(jié)果除腔腸動(dòng)物(Cnidaria)外，98%的物種遺傳距離差異在種內(nèi)為0～2%，種間平均可達(dá)到11.3%，據(jù)此他提出可以用單一的小片段基因來(lái)代表物種，作為物種的條形編碼，為全球生物編碼。Ward等(2005)應(yīng)用COⅠ基因序列進(jìn)行研究，成功對(duì)澳大利亞270種海洋魚(yú)類(lèi)進(jìn)行了鑒定。Ward等(2005)并對(duì)COⅠ基因序列進(jìn)行分析，認(rèn)為DNA條形編碼不僅可以形成物種鑒定系統(tǒng)，還包含一定的系統(tǒng)發(fā)育信息，并對(duì)相關(guān)種類(lèi)進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育研究。

蚊蟲(chóng)與人類(lèi)關(guān)系密切，可傳播瘧疾、絲蟲(chóng)病、流行性乙型腦炎、登革熱/登革出血熱、黃熱病、西尼羅熱、基孔肯亞熱等80多種疾病(方義亮等，2013)。簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確地鑒別蚊蟲(chóng)，是做好媒介控制的關(guān)鍵。本研究通過(guò)DNA條形碼技術(shù)，對(duì)廣西憑祥地區(qū)采集的蚊蟲(chóng)進(jìn)行序列比對(duì)鑒定，通過(guò)序列進(jìn)行種內(nèi)種間遺傳距離的計(jì)算和聚類(lèi)分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。同時(shí)提供蚊蟲(chóng)條形碼數(shù)據(jù)，充實(shí)COⅠ基因條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本采集

所用實(shí)驗(yàn)樣本為2013年在廣西憑祥地區(qū)采集的蚊蟲(chóng)，形態(tài)學(xué)鑒定為：騷擾阿蚊Armigeressubalbatus，中華按蚊Anophelessinensis，三帶喙庫(kù)蚊Culextritaeniorhynchus，白紋伊蚊Aedesalbopictus，致倦庫(kù)蚊Cx.quinquefasciatus。經(jīng)現(xiàn)場(chǎng)鑒定后，對(duì)蚊蟲(chóng)進(jìn)行分裝后冷凍保存。本研究所用樣本中，騷擾阿蚊4只；中華按蚊2只，三帶喙庫(kù)蚊5只，白紋伊蚊10只以及致倦庫(kù)蚊2只。

1.2 基因組DNA提取

取出冷凍保存的蚊蟲(chóng)，分別進(jìn)行研磨，然后用DNA提取試劑盒(TIANGEN,DP304-03)提取DNA，并保存于-20℃冰箱。

1.3 PCR反應(yīng)和序列測(cè)定

COⅠ基因擴(kuò)增所使用的引物參考文獻(xiàn)合成(Folmeretal. , 1994)：P1：CO1-L(5′-G G T C A A C A A A T C A T A A A G A T A T T GG-3′)，P2：CO1-H(5′-T A A A C T T C A G G G T G A C C A A A A A A T CA-3′)。在25 μL反應(yīng)體系中，加入Premix Taq(Takara)12.5 μL，上下游引物各0.5 μL(10 μmol/L)，模板2 μL，去離子水9.5 μL。PCR反應(yīng)參數(shù)為：95℃預(yù)變性1 min；94℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1.5 min，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 min(Cywinska, 2006)。隨后用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，并送北京華大基因測(cè)序。

1.4 序列分析和系統(tǒng)樹(shù)構(gòu)建

用Chromos軟件查看COⅠ基因序列峰圖，判斷峰圖質(zhì)量。用Clustal軟件進(jìn)行多重序列比對(duì)。校正后的COⅠ序列在NCBI上用BLAST程序進(jìn)行同源性比對(duì)。Kimura雙參數(shù)模型計(jì)算種內(nèi)種間遺傳距離，以鄰接法(Neighbour-joining，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，可靠性由1 000次自展分支檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 蚊蟲(chóng)標(biāo)本COⅠ基因擴(kuò)增結(jié)果

使用通用引物成功擴(kuò)增出23個(gè)蚊類(lèi)標(biāo)本的COⅠ基因片段，大小約為680 bp。電泳結(jié)果未發(fā)現(xiàn)非特異性雜帶，通過(guò)測(cè)序，進(jìn)一步驗(yàn)證了擴(kuò)增結(jié)果。擴(kuò)增結(jié)果已上傳至GenBank，序列號(hào)如表1所示。

2.2 COⅠ基因的BLAST比對(duì)結(jié)果

將23個(gè)蚊蟲(chóng)樣本COⅠ基因序列同NCBI上蚊類(lèi)條形碼序列進(jìn)行同源性比對(duì)，結(jié)果與形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果一致，分別為：4只騷擾阿蚊，2只中華按蚊，5只三帶喙庫(kù)蚊，10只白紋伊蚊以及2只致倦庫(kù)蚊。

表1 樣本序列對(duì)應(yīng)的GenBank序列號(hào) 拉丁名斜體Tab.1 GenBank accession numbers for nucleotide sequences

2.3 種內(nèi)與種間遺傳距離

用MEGA 6.0軟件，基于Kimura雙參數(shù)模型計(jì)算23只蚊子的種內(nèi)種間遺傳距離，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.4 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建

鄰接法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)可以反映序列之間的真實(shí)距離。本研究利用廣西憑祥5種共23個(gè)COⅠ基因序列，用NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果見(jiàn)圖1。

3 討論

對(duì)廣西憑祥地區(qū)23只蚊蟲(chóng)樣本的COⅠ基因序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源性比對(duì)，結(jié)果與形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果一致。在應(yīng)用DNA條形碼技術(shù)鑒定物種時(shí)，種間遺傳距離與種內(nèi)遺傳距離之間的分離程度十分重要，種間遺傳距離和種內(nèi)遺傳距離沒(méi)有重疊時(shí)才是有效的鑒定(Aliabadianetal., 2009)。本研究基于Kimura雙參數(shù)模型計(jì)算23只蚊子COⅠ序列的種內(nèi)種間遺傳距離結(jié)果表明，5種蚊蟲(chóng)的種間差距在0.161與0.076之間，而種內(nèi)遺傳距離在0.022與0.003之間，種間遺傳距離與種內(nèi)遺傳距離沒(méi)有重疊，即為有效鑒定。在這5種蚊蟲(chóng)中，種間距離的最小值在三帶喙庫(kù)蚊與致倦庫(kù)蚊之間，為0.076；最大值出現(xiàn)在中華按蚊與白紋伊蚊之間，為0.161。說(shuō)明庫(kù)蚊屬之間差異會(huì)明顯小于不同屬的蚊種之間的差異。5種蚊蟲(chóng)的種內(nèi)遺傳距離在0.022與0.003之間，可以看出種間差異明顯大于種內(nèi)差異。這也與形態(tài)學(xué)鑒定一致，也印證了此種方法鑒定蚊蟲(chóng)的準(zhǔn)確性。

表2 廣西憑祥地區(qū)蚊類(lèi)兩兩對(duì)比的中間平均遺傳距離和種內(nèi)遺傳距離Tab.2 Average interspecies genetic distances and Average intraspecific genetic distance of mosquitoes in guangxi pingxiang

圖1 NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.1 NJ tree based on analysis of COⅠ gene data

NJ法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)聚類(lèi)分析結(jié)果表明，不同種類(lèi)的蚊蟲(chóng)位于不同的分支，同屬的蚊種分支較不同屬的蚊種分支較短，種內(nèi)分支則更短。每種蚊子都形成了獨(dú)立的分支，這進(jìn)一步證明了本次研究的有效性。

采集到的蚊蟲(chóng)在做成標(biāo)本的情況下運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室時(shí)往往會(huì)出現(xiàn)損壞；或者在野外采集的蚊蟲(chóng)放至75%酒精中帶回實(shí)驗(yàn)室，在這種情況下單根據(jù)表型判斷種類(lèi)時(shí)難度比較大。若采取分子鑒定的方法，受形態(tài)完整性影響小，優(yōu)勢(shì)明顯。

本研究以廣西憑祥地區(qū)23個(gè)蚊蟲(chóng)個(gè)體為樣本，擴(kuò)增COⅠ基因序列，進(jìn)行BLAST比對(duì)，計(jì)算種內(nèi)及種間遺傳距離，并進(jìn)行序列聚類(lèi)和系統(tǒng)發(fā)育分析，驗(yàn)證了基于COⅠ基因的DNA條形碼技術(shù)能夠簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的鑒定蚊類(lèi)。