石英晶體微天平和原子力顯微鏡識別糖類化合物的苯硼酸接枝聚合物多層薄膜

袁文靜+鐘+彤+閆晶+薛中原+齊偉+王樺

摘 要 硼酸受體識別體系近年來被廣泛用于糖的分子識別研究，硼酸在一定酸度條件下，可特異性結(jié)合含順式鄰位多羥基的物質(zhì)（如二醇、糖等）。本實(shí)驗(yàn)利用EDC/NHS化學(xué)交聯(lián)，3-氨基苯硼酸 （APBA） 與聚丙烯酸 （PAA） 反應(yīng)，制得苯硼酸接枝的聚合物PAA-PBA，進(jìn)而將此聚合物進(jìn)行層層組裝，獲得苯硼酸功能化薄膜。利用石英晶體微天平（QCM）和原子力顯微鏡（AFM）分別從宏觀和微觀的角度監(jiān)測分析了此薄膜表面對糖類化合物的識別性質(zhì)。結(jié)果表明此類薄膜對一定濃度（>50 μg/mL）的糖類化合物均能表現(xiàn)出明顯識別，其中，對果糖識別最為明顯。此體系抗干擾性好，可重復(fù)使用，長期保存后仍能較好保持性能。微觀表面形貌觀察發(fā)現(xiàn)糖類化合物在薄膜表面識別均勻，識別后薄膜表面粗糙度發(fā)生明顯變化。本研究成果可望用于開發(fā)高選擇性、高靈敏度的糖識別體系。

關(guān)鍵詞 苯硼酸； 層層組裝技術(shù)； 糖識別； 石英晶體微天平； 原子力顯微鏡

1 引 言

糖作為生物體能源物質(zhì)，在生命活動(dòng)中起著不可替代的作用。識別生物體中各種糖已成為生命科學(xué)各領(lǐng)域的主要研究內(nèi)容，建立高靈敏和高選擇性的糖分子識別方法在生命科學(xué)領(lǐng)域中有著重要意義。近年來，硼酸受體識別體系被廣泛用于糖的分子識別研究，硼酸在一定酸度條件下，可特異性結(jié)合含順式鄰位多羥基的物質(zhì)（如二醇、糖等）。與酶法相比，硼酸受體識別體系無需酶介體且識別作用是可逆的，但多數(shù)在溶液中進(jìn)行，其用作功能膜識別糖的研究尚較少開展[1～3]。

近年來，層層組裝多層膜在生物傳感器、藥物傳輸載體、光學(xué)器件、電催化等方面開展了許多工作，并引起廣泛關(guān)注。層層組裝技術(shù)是由帶相反電荷的聚電解質(zhì)通過靜電作用層層組裝形成多層膜的技術(shù)[4～7]。由于具有組裝過程操作簡便，適用范圍廣泛，薄膜厚度易于控制，成分易于調(diào)節(jié)等優(yōu)點(diǎn)，而引起了人們極大的興趣。

石英晶體微天平（QCM）具有高度的靈敏性，可監(jiān)測到納米范圍內(nèi)薄膜的厚度變化和納克范圍內(nèi)痕量物質(zhì)質(zhì)量的變化，特別適合薄膜的質(zhì)量、厚度的測量，生物/化學(xué)傳感器及痕量物質(zhì)在表面的吸附過程研究，在分析科學(xué)研究中應(yīng)用廣泛，特別在聚合物多層薄膜的結(jié)構(gòu)與性能研究中的應(yīng)用備受關(guān)注[8，9]。原子力顯微鏡（AFM）是重要的表面分析工具，適用于各種體系的表面分析及各環(huán)境的現(xiàn)場測定，其分辨率可達(dá)原子級水平[8，10]。QCM獲得的宏觀動(dòng)態(tài)數(shù)據(jù)和AFM獲得的微觀靜態(tài)信息相結(jié)合，有利于在分子水平上理解硼酸受體與糖分子間的識別作用及機(jī)理。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

Nicolet iS5傅里葉變換紅外光譜（美國尼高力公司）；UV-3600紫外光譜（日本島津公司）；ESCALab 250XiX光電子能譜（XPS，美國賽默飛公司）測試；Q-Sense E4 QCM（瑞典）；Nanoscope IIIa掃描探針顯微鏡（美國Digital Instruments公司）。

聚丙烯酸（PAA，Mn 130000）、3-氨基苯硼酸半硫酸鹽（APBA）、N-羥基琥珀酰亞胺丙烯酸酯（NHS）、1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）、50% （w/V）聚乙烯亞胺（PEI）、Tetramethylrhodamine-5-isothiocyanate （TRITC）、4-（2-羥乙基）哌嗪-1-乙磺酸 N-（2-羥乙基）哌嗪-N′-（2-乙磺酸）（HEPES）、抗壞血酸（AA）、尿素（UA）和多巴胺（DA）均購自美國Sigma-Aldrich公司；十二烷基硫酸鈉（SDS）、葡萄糖等購自天津市廣成化學(xué)試劑有限公司。實(shí)驗(yàn)所用緩沖溶液為50 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液和50 mmol/L HEPES緩沖溶液，所有實(shí)驗(yàn)用水均為Millipore超純水。

2.2 苯硼酸接枝聚合物PAA-PBA的合成

PAA-PBA利用EDC/NHS交聯(lián)法使PAA的羧基與APBA的氨基反應(yīng)，形成酰胺鍵[11，12]：3 mmol PAA溶于HEPES緩沖溶液中，調(diào)節(jié)至pH 8.5，加入25 mL 0.06 mol/L APBA溶液， 4 mL 0.03 mol/L NHS和等量EDC，攪拌12 h。用清水透析1周后，凍干，即得PAA-PBA。

2.3 PEI/PAA-PBA多層膜的組裝

在石英晶體電極（13.7 mm石英晶體和5.1 mm金電極）表面組裝時(shí)，先將金電極表面徹底清潔。首先，加入500 μL 10% SDS溶液，用棉棒擦拭，用超純水洗去剩余溶液，并用氮?dú)獯蹈杀砻妗Ｈ缓笥? μL Piranha溶液（濃H2SO4-30% H₂O₂，7∶3，V/V）覆蓋整個(gè)金電極表面，10 min后，用超純水清洗。在清潔的金表面開始組裝第一層，取500 μL PEI溶液（含0.2 mol/L NaCl）加入檢測池，直到儀器信號穩(wěn)定，20 min后，用超純水清洗3次，加入第二層組裝，500 μL PAA-PBA溶液（含0.2 mol/L NaCl）加入檢測池，直到信號穩(wěn)定，依此循環(huán)，直到所需層數(shù)。QCM實(shí)時(shí)記錄組裝過程頻率變化。

在石英片、硅片表面組裝PEI/PAA-PBA多層膜進(jìn)行同樣的操作，分別用紫外可見光譜和原子力顯微鏡表征。

3 結(jié)果與討論

3.1 苯硼酸接枝聚丙烯酸PAA-PBA的合成與表征

苯硼酸接枝的聚丙烯酸是借助EDC和NHS的化學(xué)交聯(lián)合成獲得的，合成原理如圖1所示。首先，產(chǎn)物PAA-PBA利用傅里葉變換紅外光譜儀進(jìn)行了光譜測試，紅外譜圖（圖2）中2950 cm

對應(yīng)PAA中亞甲基的伸縮振動(dòng)，1565和1678 cm1為酰胺鍵的伸縮振動(dòng)峰，由于苯環(huán)的特征峰也在附近，因而交聯(lián)體的峰更強(qiáng)一些，這在PAA-PBA中均檢測到。1361 cmendprint

為硼酸基團(tuán)中BO鍵的伸縮振動(dòng)吸收峰；1438 cm為苯環(huán)變形振動(dòng)特征位置，這表明PAA和APBA已發(fā)生了交聯(lián)反應(yīng)，形成了PAA-PBA。

另外，通過XPS測試獲得產(chǎn)物PAA-PBA的元素分析結(jié)果（圖3）表明，產(chǎn)物中存在B，N等元素，含量較低，信號較弱，但仍可計(jì)算出，APBA在PAA上的接枝率約為38%。因此，PAA-PBA中仍然有大量的自由羧基存在，這為后期的靜電組裝提供了便利。

圖1 3-氨基苯硼酸接枝聚丙烯酸反應(yīng)示意圖

Fig.1 Synthetic scheme of poly（acrylic acid）-phenylboronic acid （PAA-PBA）

3.2 PEI/PAA-PBA多層薄膜的表征

帶正電的聚乙烯亞胺作為第一層組裝在處理過的石英晶體電極上，含較多羧基的PAA-PBA在

圖2 3-氨基苯硼酸和接枝產(chǎn)物PAA-PBA的紅外光譜圖

Fig.2 FTIR spectra of 3-aminophenylboronic acid hemisulfate （APBA） and PAA-PBA

pH 9.0時(shí)帶明顯負(fù)電荷，作為第二層進(jìn)行組裝，依此循環(huán)，直至所需層數(shù)。組裝的多層膜分別用紫外-可見光譜、QCM和AFM進(jìn)行了觀測。

圖3 接枝產(chǎn)物PAA-PBA的XPS圖

Fig.3 XPS spectra of PAA-PBA

為了更清楚監(jiān)測其組裝過程，用TRITC對PEI進(jìn)行了熒光標(biāo)記，由圖4可見，550 nm峰強(qiáng)隨著組裝層數(shù)的增加而明顯增強(qiáng)，表明組裝的成功進(jìn)行。QCM也可監(jiān)測到層層組裝的發(fā)生，由共振頻率的減少反映出電極表面質(zhì)量的增加，隨著組裝層數(shù)增加，共振頻率降低越來越顯著，證明了薄膜的成功組裝（圖5）。AFM也可以觀察到組裝不同層數(shù)的表面形貌變化，如圖6所示，分別表示組裝2個(gè)雙層、4個(gè)雙層、6個(gè)雙層的PEI/PAA-PBA薄膜。原子力顯微鏡下呈現(xiàn)典型的層層組裝多層膜的表面形貌，表面由連續(xù)的結(jié)節(jié)組成，隨著組裝層數(shù)增加，結(jié)節(jié)逐漸變大。

圖4 （PEI/PAA-PBA）n 多層膜組裝紫外光譜圖（A）及其石英晶體微天平監(jiān)測共振頻率變化圖（B）

Fig.4 UV-vis spectra （A） and frequency shift （B） observed during assembly of （PEI/PAA-PBA）n multilayer

PEI： Poly（ethyleneimine）.

圖5 原子力顯微鏡觀測不同層數(shù)（PEI/PAA-PBA）n 多層膜的表面形貌圖（5 μm×5 μm）： （A） （PEI/PAA-PBA）2； （B） （PEI/PAA-PBA）4； （C） （PEI/PAA-PBA）6

Fig.5 AFM height images of （A） （PEI/PAA-PBA）2 multilayer， （B） （PEI/PAA-PBA）4 multilayer and （C） （PEI/PAA-PBA）6 multilayer

3.3 PEI/PAA-PBA多層薄膜對葡萄糖的識別

薄膜對葡萄糖的識別通過QCM技術(shù)實(shí)時(shí)監(jiān)測，記錄不同層數(shù)的薄膜對相同濃度的葡萄糖溶液（100 μg/mL）的識別時(shí)間曲線（圖6）。圖7顯示了典型的共振頻率變化，在空白電極表面，在監(jiān)測時(shí)間范圍內(nèi)沒有看到頻率變化。在1個(gè)雙層薄膜表面，觀察到頻率的變化，但是頻率減少較弱，說明識別在薄膜上的糖分子少，表明兩者間的識別作用弱。隨著組裝層數(shù)增加，薄膜表面PBA基團(tuán)越來越多，對糖的識別作用逐漸增強(qiáng)，頻率減少程度增大，直到達(dá)到5個(gè)雙層后，識別不再有明顯增加，說明在薄膜表面的識別已達(dá)到飽和。

為準(zhǔn)確探討薄膜與糖的識別作用，選4個(gè)雙層的薄膜為模型體系，監(jiān)測了不同濃度葡萄糖溶液在此膜表面的識別性質(zhì)。圖7表明，當(dāng)葡萄糖濃度較低時(shí)，如50 μg/mL，共振頻率變化很小，表明二者識別作用弱，而當(dāng)葡萄糖濃度達(dá)到100 μg/mL時(shí)，共振頻率有了顯著的變化，這時(shí)識別作用增強(qiáng)，進(jìn)一步地增加葡萄糖濃度到300 μg/mL后，識別作用又有了明顯增強(qiáng)，但當(dāng)葡萄糖溶液濃度增加至500 μg/mL時(shí)，識別作用不再有明顯的增強(qiáng)，表明此時(shí)識別作用已達(dá)平衡。

圖6 不同層數(shù)PEI/PAA-PBA多層膜對100 μg/mL的葡萄糖溶液的QCM頻率變化曲線

Fig.6 Time courses of frequency shift observed during recognition of （PEI/PAA-PBA）n multilayer to glucose at concentration of 100 μg/mL

圖7 （PEI/PAA-PBA）4膜對不同濃度葡萄糖溶液的QCM頻率變化曲線

Fig.7 Time courses of frequency shift observed during recognition of （PEI/PAA-PBA）4 multilayer to glucose with different concentrations

圖8 （PEI/PAA-PBA）4膜對葡萄糖識別前后的原子力顯微鏡觀察圖（10 μm×10 μm）： （A）識別前形貌圖； （B）識別前相圖；（C）識別平衡后形貌圖； （D）識別平衡后相圖

Fig.8 （A） AFM height images of （PEI/PAA-PBA）4 multilayer before recognition to glucose， （B） AFM phase images of （PEI/PAA-PBA）4 multilayer before the recognition to glucose， （C） AFM height images of （PEI/PAA-PBA）4 multilayer in recognition equilibrium to glucose and （D） AFM phase images of （PEI/PAA-PBA）4 multilayer in recognition equilibrium to glucoseendprint

利用AFM技術(shù)對葡萄糖在薄膜表面的被識別行為進(jìn)行了表面分析。圖8顯示了識別前和識別平衡后的薄膜表面，表面粗糙度Ra在2.494～3.502 nm之間明顯變化，同時(shí)，PEI/PAA-PBA膜表面識別結(jié)合葡萄糖比較均勻。

3.4 PEI/PAA-PBA多層薄膜對其他糖類化合物的識別

圖9顯示了此薄膜對其它糖類化合物的識別性質(zhì)，相比相同濃度的葡萄糖、甘露糖及半乳糖，薄膜對果糖識別更明顯，而對其它3種糖識別性能相似，這是因?yàn)楣鞘俏ㄒ缓?個(gè)順式二元醇的分子，會(huì)與硼酸基產(chǎn)生更強(qiáng)的識別作用[12]。

圖9 （PEI/PAA-PBA）4膜對相同濃度100 μg/mL的葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖的QCM頻率變化曲線

Fig.9 Time courses of frequency shift observed during recognition of （PEI/PAA-PBA）4 multilayer to glucose， fructose， mannose and galactose with same concentration of 100 μg/mL

3.5 PEI/PAA-PBA多層薄膜的干擾實(shí)驗(yàn)、重復(fù)利用和穩(wěn)定性

為了進(jìn)一步考察此類薄膜材料用于實(shí)際樣品檢測的可能性，分別考察了生命體內(nèi)常見干擾物質(zhì)AA、UA、DA等，研究其抗干擾能力。由圖10可見，加入干擾物質(zhì)未影響此薄膜對糖類化合物的識別，并且此薄膜對AA、UA、DA等干擾物質(zhì)都完全沒有識別作用。這表明此類薄膜的抗干擾性好，能用于實(shí)際樣品的檢測。

圖10 （PEI/PAA-PBA）4膜對300 μg/mL葡萄糖（A）在100 μg/mL AA和100 μg/mL UA的干擾下；（B）在100 μg/mL DA的干擾下的QCM頻率變化曲線

Fig.10 Time courses of frequency shift observed during the recognition of （PEI/PAA-PBA）4 multilayer to glucose concentration of 300 μg/mL （A） in the absence and the presence of ascorbic acid （AA）， uric acid （UA）； （B） in the absence and presence of dopamine （DA）

如前所述，硼酸基與順式二元醇的識別是可逆的，這種識別高度依賴體系酸度，圖11A表明，此薄膜在pH 8.0體系中，原已識別的葡萄糖會(huì)脫落，兩者不再存在相互作用；而在pH 10.0時(shí)，體系沒有明顯變化，說明此條件下識別作用能夠穩(wěn)定存在；pH≤8.0時(shí)，已經(jīng)識別的葡萄糖會(huì)從薄膜表面脫落，此薄膜可重復(fù)使用。將重復(fù)使用1次、2次的薄膜分別與新鮮制備的薄膜對比，發(fā)現(xiàn)三者對相同濃度葡萄糖的識別基本沒有差別，這些結(jié)果進(jìn)一步證明了PEI/PAA-PBA薄膜對糖的識別是可逆的，并可重復(fù)使用，這也正是此類薄膜擬作為傳感識別體系的優(yōu)勢所在。

圖11 （A）識別了葡萄糖的（PEI/PAA-PBA）4膜在pH 8.0和pH 10.0時(shí)的QCM頻率變化曲線 ；（B）重復(fù)利用的（PEI/PAA-PBA）4膜識別300 μg/mL葡萄糖的QCM頻率變化曲線

Fig.11 Time courses of frequency shift observed （A） （PEI/PAA-PBA）4 multilayer recognized with glucose at pH 8.0 and pH 10.0， respectively； （B） during the recognition of （PEI/PAA-PBA）4 multilayer newly fabricated， that recycled once and twice to glucose at the concentration of 300 μg/mL， respectively

考察了此薄膜的長期穩(wěn)定性，將薄膜修飾的晶體電極置于4℃條件下保存，每周測試其對相同濃度葡萄糖的識別響應(yīng)，在4周內(nèi)，QCM響應(yīng)曲線基本沒有發(fā)生變化，表明此薄膜長期保存后仍能較好地保持對糖的識別性能。這是與酶法體系相比的另一優(yōu)勢，蛋白類氧化酶雖然催化活性高，但易受環(huán)境干擾而失活。

4 結(jié) 論

合成了苯硼酸接枝的高分子化合物PAA-PBA，通過靜電層層組裝獲得了PBA功能化表面，并分別用QCM和AFM技術(shù)表征了此表面對葡萄糖等糖類化合物的識別性能。結(jié)果表明，此類薄膜能夠明顯識別葡萄糖、果糖、甘露糖及半乳糖等糖類化合物，其中對果糖識別最為明顯，并且，此體系抗干擾性和穩(wěn)定性好，可重復(fù)使用，同時(shí)，此方法體系可擴(kuò)展至其他苯硼酸接枝聚合物，適用性廣，可望應(yīng)用于食品、醫(yī)藥等相關(guān)領(lǐng)域傳感識別體系的開發(fā)。

References

1 Kim K T， Cornelissen J J L M， Nolte R J M， van Hest J C M. J. Am. Chem. Soc.， 2009， 131（39）： 13908-13909

2 LIU Bin， SUN Xiang-Ying， XU Jin-Rui. Chinese J. Anal. Chem.， 2004， 32（5）： 601-605

劉 斌， 孫向英， 徐金瑞. 分析化學(xué)， 2004， 32（5）： 601-605

3 Watahiki R， Sato K， Suwa K， Niina S， Egawa Y， Seki T， Anzai J I. J. Mater. Chem. B， 2014， 2（35）： 5809-5817

4 Decher G. Science， 1997， 277（5330）， 1232-1237

5 Qi W， Duan L， Wang K W， Yan X H， Cui Y. He Q， Li J B. Adv. Mater， 2008， 20（3）： 601-605

6 Qi W， Xue Z， Yuan W， Wang H. J. Mater. Chem. B， 2014（3）， 2， 325-331

7 Qi W， Yuan W， Yan J， Wang H. J. Mater. Chem. B， 2014， 2（33）， 5461-5467

8 Yamashita K， Kikkawa Y， Kurokawa K.， Doi Y. Biomacromolecules， 2005， 6（2）： 850-857

9 DU Bin-Yang， FAN Xiao， CAO Zheng， GUO Xiao-Lei. Chinese J. Anal. Chem.， 2010， 38（5）： 752-759

杜濱陽， 范 瀟， 曹 崢， 郭小磊. 分析化學(xué)， 2010， 38（5）： 752-759

10 LI Jing， WANG Er-Kang. Chinese J. Anal. Chem.， 1995， 23（11）： 1341-1348

李 晶， 汪爾康. 分析化學(xué)， 1995， 23（11）： 1341-1348

11 Yao H Q， Chang F W， Hu N F. Electroch. Acta， 2010， 55（28）： 9185-9192

12 Levy T， Déjugnat C， Sukhorukov G B. Adv. Funct Mater.， 2008， 18（10）： 1586-1594endprint