刺五加葉藥物成分腦內(nèi)代謝動(dòng)力學(xué)及治療腦缺血作用的在線微透析—質(zhì)譜分析

王倩倩+張艷　孟璐璐+皮子鳳+劉舒+宋鳳瑞+劉志強(qiáng)

摘 要 考察了刺五加葉中金絲桃苷和1，5-二咖啡酰奎寧酸入腦及腦內(nèi)代謝動(dòng)力學(xué)過程，同時(shí)評價(jià)刺五加葉對腦缺血大鼠腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)的影響。結(jié)扎大鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈構(gòu)建急性不完全性腦缺血模型，利用在線微透析-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，ACE 5 C18-AR液相色譜柱等度洗脫，MRM負(fù)離子模式下監(jiān)測金絲桃苷和1，5-二咖啡?？鼘幩嵩诮】导叭毖笫竽X內(nèi)代謝動(dòng)力學(xué)差異，正離子模式檢測不同組別大鼠腦內(nèi)谷氨酸（Glu）、天冬氨酸（Asp）、γ-氨基丁酸（GABA）、乙酰膽堿（Ach）、5-羥色胺（5- ）、多巴胺（DA）6種神經(jīng)遞質(zhì)含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在線方法線性良好（R2>0.99），準(zhǔn)確度、精密度滿足分析要求；金絲桃苷和1，5-二咖啡?？鼘幩峋芡高^血腦屏障到達(dá)腦部，代謝迅速，在缺血大鼠腦內(nèi)吸收降低，消除加快；相比模型大鼠，預(yù)防性刺五加葉給藥7天后，缺血大鼠腦內(nèi)氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)Glu、Asp、GABA和單胺類神經(jīng)遞質(zhì)DA的水平顯著降低（p<0.01），Ach水平顯著升高（p<0.05）。

關(guān)鍵詞 刺五加葉； 腦缺血； 神經(jīng)遞質(zhì)； 在線微透析-質(zhì)譜

1 引 言

腦血管病是威脅人類健康與生命的主要疾病之一，其中缺血性腦血管病占到了80%以上[1]。缺血發(fā)生時(shí)，腦組織能量衰竭，出現(xiàn)線粒體功能紊亂、酸中毒、水腫、鈣泵失調(diào)等現(xiàn)象，繼而引發(fā)Ca2+超載、毒性自由基生成增多、神經(jīng)遞質(zhì)釋放失衡和細(xì)胞凋亡[2]。各因素間相互聯(lián)系，互為因果，形成瀑布樣級聯(lián)反應(yīng)，嚴(yán)重?fù)p傷患者神經(jīng)系統(tǒng)。膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿（Ach）、單胺類神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺（DA）和5-羥色胺（5- ）、興奮性氨基酸谷氨酸（Glu）、天門冬氨酸（Asp）和抑制性氨基酸γ-氨基丁酸（GABA）在多項(xiàng)神經(jīng)生理活動(dòng)中發(fā)揮作用廣泛，表現(xiàn)活躍。這些神經(jīng)遞質(zhì)的體內(nèi)水平變化與多種神經(jīng)元功能紊亂與神經(jīng)系統(tǒng)疾病[3 ～ 5]相關(guān)。

刺五加系五加科植物刺五加[Acanthopanax senticosus （Rupr.et Maxim.）Harms]的干燥根和根莖或莖[6]，其葉也可作藥用。研究表明，刺五加葉中含豐富的黃酮、皂苷及有機(jī)酸類活性成分，具有保護(hù)心腦血管、抗腫瘤、降血壓、抑制CYP450活性等藥理作用[7]。文獻(xiàn)報(bào)道，刺五加葉中以金絲桃苷為代表的黃酮提取物對DPPH和·OH具有良好的清除能力[8]。有機(jī)酚酸1，5-二咖啡?？鼘幩幔?，5-diCQA）可通過激活Erk激酶上調(diào)細(xì)胞內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)，減輕1-甲基-4-苯基吡啶離子（MPP+）誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷[9]。目前，關(guān)于刺五加葉治療實(shí)驗(yàn)性腦缺血的研究已有報(bào)道。研究發(fā)現(xiàn)，刺五加葉皂苷能夠顯著改善腦缺血大鼠血液流變學(xué)及血小板功能異常[10]，提高腦組織超氧化物歧化酶活性，降低丙二醛、Ca2+及乳酸水平[11]；刺五加葉總黃酮聯(lián)合電針治療能提高B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2蛋白表達(dá)，減少腦缺血區(qū)域細(xì)胞凋亡的發(fā)生[12]，但有關(guān)刺五加葉對缺血大鼠腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)影響的研究還未見明確報(bào)道。本研究采用結(jié)扎大鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈構(gòu)建急性不完全性腦缺血模型[13]，利用所搭建的微透析-質(zhì)譜在線分析平臺(tái)[14]實(shí)現(xiàn)正、負(fù)不同離子模式下對缺血大鼠腦內(nèi)內(nèi)源性神經(jīng)遞質(zhì)和外源性藥物成分的同時(shí)、實(shí)時(shí)、連續(xù)監(jiān)測，真實(shí)反映其在腦缺血病理狀態(tài)下的腦內(nèi)變化情況，簡化了樣品處理過程。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

ACQUITYTM UPLC系統(tǒng)，Xevo TQ 三級四極桿質(zhì)譜儀（美國Waters公司），ACE 5 C18-AR液相色譜柱（150 mm × 4.6mm）。微透析系統(tǒng)：CMA 402灌注器推進(jìn)泵、CMA120動(dòng)物清醒活動(dòng)裝置、MAB6腦微透析探針（透析膜長4 mm，截留分子量15000 Da）、ASI腦定位儀、自組裝在線進(jìn)樣器。

5-羥色胺（5- ）、多巴胺（DA）、谷氨酸（Glu）、天門冬氨酸（Asp）、γ-氨基丁酸（GABA）和乙酰膽堿（Ach）均購于Sigma-Aldrich公司；金絲桃苷（Hyperoside，中國藥品生物制品檢定所）；1，5-二咖啡?？鼘幩幔?，5-diCQA，成都普瑞法科技開發(fā)有限公司，批號：D090617）；刺五加葉提取物（實(shí)驗(yàn)室制注射用凍干粉）。乙腈（HPLC級，F(xiàn)isher公司）；乙酸（HPLC級，Tedia公司）；超純水（Milli-Q系統(tǒng)，Millipore公司）。人工腦脊液（aCSF，pH 7.4）由1.2 mmol/L CaCl2， 2.0 mmol/L Na2HPO4·12H2O， 1.0 mmol/L MgCl2， 2.7 mmol/L KCl和145 mmol/L NaCl 配制而成。

2.2 實(shí)驗(yàn)過程

2.2.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

雄性Wistar大鼠（240～280 g）40只，隨機(jī)分為4組，分別為對照組、腦缺血模型組、刺五加葉給藥組（140 mg/kg），對照藥曲克蘆丁組（50 mg/kg），尾靜脈給藥，每日一次，以上劑量均按照人體臨床用藥劑量折算。給藥7天后于海馬區(qū)埋入探針套管，次日進(jìn)行腦缺血手術(shù)。為同時(shí)進(jìn)行藥代動(dòng)力學(xué)研究，缺血手術(shù)后按劑量給藥，并立即在線微透析采樣、檢測。

微透析采樣：在大鼠海馬區(qū)（A： 5.6 mm，L： 4.6 mm，V： 4.6 mm）[15]埋入探針套管，次日插入腦探針，1.0 μL/min灌流aCSF平衡90 min，待腦缺血手術(shù)后立即采樣并在線檢測，采樣間隔20 min，連續(xù)采集180 min。

急性不完全性腦缺血模型：大鼠以戊巴比妥鈉（40 mg/kg， ip）麻醉，分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，雙線分別結(jié)扎，對照組只分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈不結(jié)扎。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

精密稱取8種待測物對照品，金絲桃苷和1，5-咖啡?？鼘幩嵋约状既芙?，神經(jīng)遞質(zhì)以超純水溶解，分別制成1.0 mg/mL的單標(biāo)儲(chǔ)備液。用aCSF-乙腈（4∶1， V/V）配制濃度為50.0 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，稀釋成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液。endprint

2.2.3 色譜及質(zhì)譜條件

色譜條件：柱溫為室溫；流動(dòng)相組成為20% A相（乙腈）和80% B相（0.5%乙酸溶液）等度洗脫，流速0.5 mL/min；進(jìn)樣量： 20 μL。

質(zhì)譜條件：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式，刺五加葉中2種成分在負(fù)離子（-）模式下檢測，6種神經(jīng)遞質(zhì)在正離子（+）模式下檢測，源溫150℃，毛細(xì)管電壓2.0 kV（-）/3.0 kV（+），脫溶劑氣溫度400 ℃（-）/350℃（+），脫溶劑氣流速800L/h（-）/700L/h （+）。各待測物質(zhì)譜參數(shù)見表1。表1 8種待測物的MRM質(zhì)譜參數(shù)

3 結(jié)果與討論

3. 1 方法學(xué)考察

3. 1. 1 線性范圍及檢出限、定量限

配制系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，外標(biāo)法定量，以待測物濃度為橫坐標(biāo)，定量離子對峰面積為縱坐標(biāo)得到各待測物線性回歸方程，所得相關(guān)系數(shù)（R2）均大于0.99，S/N≥3確定方法檢出限（LOD），S/N≥10確定定量限（LOQ），所得結(jié)果見表2。

3.1.2 準(zhǔn)確度、精密度和基質(zhì)效應(yīng) 選取各待測物線性范圍內(nèi)高、中、低濃度水平標(biāo)樣添加于人工腦脊液中，每個(gè)濃度重復(fù)5次，于3日內(nèi)測得日內(nèi)及日間準(zhǔn)確度（RE，%）和精密度（RSD，%）。結(jié)果表明，8種待測物的日內(nèi)準(zhǔn)確度和精密度范圍分別在1.11%～10.80%和0.01%～14.40%，日間準(zhǔn)確度和精密度范圍分別為0.08%～14.82%和

14.30%～0.26%，滿足生物樣品分析要求。

在流動(dòng)相溶液A/B（1∶4， V/V）中添加高、中、低濃度對照品，制得溶劑標(biāo)樣；向空白大鼠腦透析液中同樣添加以上濃度對照品制，得基質(zhì)標(biāo)樣。空白大鼠腦透析液中含有一定濃度神經(jīng)遞質(zhì)待測物，基質(zhì)效應(yīng)（ME）的計(jì)算公式：

ME（%）=（Amatrix-Asample）Astandard×100 （1）

式中，Amatrix為基質(zhì)標(biāo)樣峰面積， Asample為腦透析液中待測物峰面積， Astandard為溶劑中標(biāo)樣峰面積。據(jù)此得到8種待測物的ME范圍在88.4%～113.6%之間，表明透析液基質(zhì)對待測物無明顯干擾。

3.2 金絲桃苷和1，5-二咖啡?？鼘幩崮X內(nèi)代謝動(dòng)力學(xué)分析

利用微透析-質(zhì)譜在線分析平臺(tái)監(jiān)測了金絲桃苷和1，5-二咖啡?？鼘幩?，比較二者在對照組及缺血大鼠腦內(nèi)的代謝動(dòng)力學(xué)差異，并利用PKSolver軟件進(jìn)行了數(shù)據(jù)分析。圖1為金絲桃苷和1，5-二咖啡?？鼘幩岬哪X內(nèi)藥物濃度-時(shí)間曲線。

由圖1可見，金絲桃苷和1，5-二咖啡?？鼘幩崮軌蝽樌高^血腦屏障到達(dá)腦部，且代謝過程迅速，入腦后約0.5 h即達(dá)峰值，3 h內(nèi)基本代謝完全。表3列出了二者在對照組及腦缺血大鼠腦內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)， t1/2代表半衰期，Cmax 和tmax分別代表最大血藥濃度及達(dá)到此濃度的時(shí)間，AUC0-t代表零時(shí)間到最終采血點(diǎn)的濃度-時(shí)間曲線下面積，AUC0-inf_obs代表零時(shí)間到無限大時(shí)間的濃度-時(shí)間曲線下面積[16]。

金絲桃苷和1，5-二咖啡?？鼘幩岬乃幋鷦?dòng)力學(xué)參數(shù)在對照組及缺血大鼠腦內(nèi)呈現(xiàn)出了顯著變化。t1/2在臨床上多用于反映藥物從體內(nèi)消除速度的快慢，相比對照組，金絲桃苷和1，5-二咖啡?？鼘幩嵩谌毖笫竽X內(nèi)的t1/2有所降低，表明二者在缺血大鼠腦內(nèi)消除速度加快；Cmax和tmax是反映藥物體內(nèi)吸收速率的兩個(gè)指標(biāo)，AUC是評價(jià)藥物吸收程度的重要指標(biāo)，給藥后約0.5 h藥物濃度即達(dá)峰值，說明二者能夠迅速透過血腦屏障到達(dá)腦部；二者在缺血大鼠腦內(nèi)的Cmax及AUC明顯降低，表明腦缺血的發(fā)生影響了刺五加葉中藥物成分的腦內(nèi)代謝，推測可能是大鼠腦缺血后血液流動(dòng)被阻斷或緩流，在缺血缺氧病理狀態(tài)下機(jī)體轉(zhuǎn)運(yùn)能力降低導(dǎo)致。

3.3 刺五加葉治療腦缺血的作用評價(jià)

刺五加葉中有效成分能夠順利到達(dá)腦部，為進(jìn)一步探究其治療腦缺血的作用機(jī)制，利用所搭建的微透析-質(zhì)譜在線分析平臺(tái)同時(shí)檢測了對照組、腦缺血模型組、刺五加葉給藥組和曲克蘆丁組大鼠末次給藥后3 h內(nèi)海馬區(qū)6種神經(jīng)遞質(zhì)水平，經(jīng)前期測定的探針回收率[17]校正后，所得結(jié)果見圖2。

由圖2可見，缺血引發(fā)了大鼠腦內(nèi)的神經(jīng)遞質(zhì)紊亂，Glu，Asp，GABA，DA和5- 在缺血3 h內(nèi)海馬區(qū)水平顯著高于對照組（p<0.01），Ach水平顯著降低（p<0.01）。Glu與Asp是興奮性氨基酸（EAAs），尤其Glu是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)。Glu儲(chǔ)存于神經(jīng)元末梢的突觸囊泡中，以Ca2+依賴的方式釋放到突觸間隙中，正常狀態(tài)下，大部分Glu會(huì)經(jīng)再攝取重新回到細(xì)胞內(nèi)，只有小部分發(fā)揮興奮性神經(jīng)遞質(zhì)作用，用于信號傳遞。但在腦缺血狀態(tài)下，大量Ca2+內(nèi)流，必然引發(fā)Glu的過度釋放使谷氨酸受體處于持續(xù)興奮狀態(tài)，導(dǎo)致神經(jīng)元死亡，引發(fā)神經(jīng)毒性[18]。給藥刺五加葉大鼠在缺血后Glu水平顯著低于模型大鼠（p<0.01），推測可能是一定程度上緩解了Ca2+大量內(nèi)流，發(fā)揮了鈣通道阻滯劑的作用。GABA為主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，可以對突觸后神經(jīng)元起抑制保護(hù)作用，同時(shí)也可抑制突觸前神經(jīng)元Glu的釋放。本研究發(fā)現(xiàn)，缺血大鼠腦內(nèi)GABA的水平顯著升高（p<0.01），推測可能是由于缺血早期Glu水平顯著升高，GABA發(fā)揮了代償性拮抗作用。但GABA的過度釋放也會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)GABA耗竭，使細(xì)胞內(nèi)源性抑制降低，神經(jīng)元興奮-抑制失衡，繼而引發(fā)遲發(fā)性神經(jīng)元死亡[19]。Ach是促進(jìn)學(xué)習(xí)記憶、維持覺醒的重要神經(jīng)遞質(zhì)。通常在腦梗塞恢復(fù)期或多發(fā)性腦梗塞癡呆的治療方案中會(huì)增加Ach量以改善認(rèn)知能力[20]。DA和5- 是主要的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)，二者在缺血大鼠腦內(nèi)含量顯著增高，一方面，由于缺血時(shí)大量Ca2+內(nèi)流，導(dǎo)致其釋放量增加；另一方面，缺血引發(fā)腦內(nèi)能量耗竭遞質(zhì)重?cái)z取受阻，且降解單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的單胺氧化酶（MAO）活性降低。文獻(xiàn)[21]報(bào)道，單胺類神經(jīng)遞質(zhì)能夠?qū)θ毖窠?jīng)元造成直接損傷，并能促進(jìn)興奮性神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，增加N-甲基-D-天門冬氨酸（NMDA）的敏感性，進(jìn)一步促進(jìn)Ca2+的大量內(nèi)流。預(yù)防性給藥刺五加葉提取物及陽性對照藥曲克蘆丁，缺血大鼠腦內(nèi)6種神經(jīng)遞質(zhì)的水平紊亂得到不同程度改善。刺五加葉中有效藥物成分迅速透過血腦屏障到達(dá)大鼠腦部發(fā)揮作用，顯著降低了缺血大鼠腦內(nèi)Glu、Asp、GABA和DA的水平（p<0.01），升高了Ach的水平（p<0.05）。相比對照藥曲克蘆丁，刺五加葉對氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)具有更好的調(diào)節(jié)作用。endprint

以所測得的神經(jīng)遞質(zhì)含量作為統(tǒng)計(jì)變量，采用偏最小二乘判別分析法（PLS-DA）通過得分圖對樣本進(jìn)行整體評價(jià)。在圖3中，橢圓區(qū)域代表95%置信區(qū)間內(nèi)，每點(diǎn)代表一個(gè)生物樣本，對照組和腦缺血模型組間能夠明顯區(qū)分，表明缺血后大鼠海馬區(qū)的神經(jīng)遞質(zhì)水平發(fā)生了顯著改變；刺五加葉及曲克蘆丁組能與缺血模型組良好區(qū)分，說明預(yù)防性給藥刺五加葉提取物及曲克蘆丁后能有效調(diào)節(jié)缺血引發(fā)的神經(jīng)遞質(zhì)紊亂，對缺血導(dǎo)致的神經(jīng)損傷起到了保護(hù)作用。

4 結(jié) 論

刺五加葉中藥物成分金絲桃苷和1，5-二咖啡?？鼘幩崮軌虺晒ν高^血腦屏障到達(dá)腦部發(fā)揮作用，并能夠有效緩解由缺血引發(fā)的神經(jīng)遞質(zhì)水平紊亂，尤其對氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)，其調(diào)節(jié)作用優(yōu)于陽性對照藥曲克蘆丁，表明刺五加葉具有較好的神經(jīng)保護(hù)作用。本研究實(shí)現(xiàn)了對內(nèi)源性及外源性物質(zhì)在不同離子監(jiān)測模式下的同時(shí)、實(shí)時(shí)、連續(xù)檢測，從調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)角度研究了刺五加葉對腦缺血的治療作用，對開展藥效學(xué)及藥物代謝過程的體內(nèi)研究具有借鑒意義。

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