沈潔，劉昱均，張玨

（1.江南大學(xué)化學(xué)與材料工程學(xué)院，江蘇無錫 214122；2.衛(wèi)生部核醫(yī)學(xué)重點實驗室，江蘇省原子醫(yī)學(xué)研究所，江蘇無錫 214063）

發(fā)酵靈芝胞外多糖硫酸化修飾

沈潔1，劉昱均1，張玨*2

（1.江南大學(xué)化學(xué)與材料工程學(xué)院，江蘇無錫 214122；2.衛(wèi)生部核醫(yī)學(xué)重點實驗室，江蘇省原子醫(yī)學(xué)研究所，江蘇無錫 214063）

發(fā)酵靈芝胞外多糖表現(xiàn)出微弱的抗腫瘤活性，硫酸化是改善多糖抑癌活性的重要途徑，而多糖的硫酸化取代度與其生物活性密切相關(guān)。為了了解硫酸化取代度與硫酸化條件之間的關(guān)系，以獲取不同取代度的產(chǎn)品，對發(fā)酵靈芝胞外多糖的硫酸化試劑以及硫酸化反應(yīng)條件與取代度之間的關(guān)系進行了較深入研究。實驗結(jié)果表明，氨基磺酸比氯磺酸的硫酸化過程更加緩和，尿素的加入也有利于緩和反應(yīng)條件，提高取代度。

靈芝；多糖；硫酸化

靈芝具有扶正固本、滋補強壯、延年益壽等功效［1］。隨著發(fā)酵技術(shù)的成熟，靈芝的深層發(fā)酵技術(shù)豐富了靈芝資源，可以定向獲取有效成分［2］。靈芝多糖為靈芝的重要成分之一，具有抗腫瘤［3-5］、抗病毒［6］、抗氧化［7-9］和提高免疫調(diào)節(jié)［10-12］等多種生物活性。但是和靈芝子實體多糖類似，靈芝胞外多糖的抗癌活性很低甚至沒有抗癌活性；而多糖的化學(xué)修飾尤其是硫酸化修飾已成為多糖活性提高的重要途徑［9，13-21］。多糖的糖羥基被硫酸基團取代后不僅提高了多糖的水溶性，而且由于硫酸基團空間位阻和電荷排斥效應(yīng)導(dǎo)致糖鏈的屈伸度增強，甚至使糖鏈在局部區(qū)域形成螺旋結(jié)構(gòu)［16］，從而提高了多糖的生物活性。硫酸化靈芝胞外多糖具有很好的抑制肝癌細胞的能力［24］，因此有必要了解取代度和硫酸化反應(yīng)條件之間的對應(yīng)關(guān)系。目前大多數(shù)研究對來源于子實體的靈芝多糖進行硫酸化改性［10，25-26］，對發(fā)酵法獲取靈芝多糖的硫酸化修飾的研究相對較少［24］。本文作者研究了發(fā)酵靈芝胞外多糖硫酸化修飾，并在文中探討了各種因素對取代度的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

發(fā)酵靈芝胞外多糖，由江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室提供。無水硫酸鈉、N，N-二甲基甲酰胺、苯酚、吡啶、濃硫酸、乙醇、氯化鋇、氫氧化鈉、甲酰胺、氨基磺酸（AR），均由國藥集團化學(xué)試劑有限公司提供；明膠（BS），Amresco生物科技有限公司產(chǎn)品；氯磺酸（CP），上海金山亭化工試劑廠產(chǎn)品。

T-6型紫外分光光度計，普析通用儀器有限責(zé)任公司制造；透析袋（截留分子量3 500 Da），美國Viskase公司制品；EZ585Q冷凍干燥機，美國FTS System公司制造；MB104型紅外光譜儀，ABB Bomem制造；Waters 600型高效液相色譜儀，美國Waters公司制造；2410型示差折光檢測器，美國Waters公司制造；Empower工作站，美國Empower公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 發(fā)酵靈芝胞外多糖硫酸化修飾將一定量的靈芝胞外多糖加入裝有DMF的三口燒瓶中，室溫下攪拌30 min。待溫度升至反應(yīng)所需溫度后緩慢加入硫酸化試劑。反應(yīng)結(jié)束后迅速將燒瓶置于冰水浴中，反應(yīng)液用4 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至7后用體積分數(shù)90%乙醇沉淀，離心取沉淀。沉淀先用體積分數(shù)90%乙醇洗滌，再用去離子水復(fù)溶，用流水透析24 h。透析袋內(nèi)液體冷凍干燥后即得靈芝胞外硫酸化多糖。產(chǎn)物紅外吸收光譜見圖1。硫酸酯化胞外多糖（GIP-SA）除保留母體多糖的特征吸收峰外，增加了兩個新吸收分峰，1 263.44 cm-1和815.64 cm-1，分別為S—O的伸縮振動峰和C—O—S的拉伸振動，說明靈芝胞外多糖的糖鏈上已引入了硫酸酯基。

圖1 胞外多糖（GLP）及其硫酸酯化產(chǎn)物（S-GLP）的紅外吸收光譜Fig.1Infraraed Spectrum of GLP and S-GLP

1.2.2 取代度測定采用BaCl2-明膠濁度法［27］，取代度（DS）計算公式：

式中S為含硫率（質(zhì)量分數(shù)）。

1.2.3 紅外光譜分析取3 mg左右冷凍干燥后的靈芝多糖，與1 g溴化鉀碾細混勻后壓片，使用MB104型紅外分光光度儀，測定的紅外光譜波長范圍為500～4 000 cm-1。

1.2.4 相對分子質(zhì)量測定色譜柱：Ultrahydrogel?Linear 300 mm×7.8 mmid×2；流動相：0.1 mol/L NaNO3；體積流量0.9 mL/min，柱溫45℃。樣品制備：樣品溶解于流動相中，用微孔過濾膜過濾后進樣。

2 結(jié)果與討論

2.1 硫酸酯化試劑的篩選

硫酸基團的引入量對多糖的活性有重要影響，而硫酸化試劑對反應(yīng)有一定的影響。以實驗分別考察了氯磺酸和氨基磺酸對取代度（DS）的影響。

從圖2可看出，氯磺酸和氨基磺酸在各自最佳反應(yīng)溫度下的取代水平相似，但氨基磺酸對反應(yīng)溫度的響應(yīng)更為寬泛。相比用氯磺酸合成的硫酸酯化靈芝多糖，氨基磺酸法合成的硫酸酯化靈芝多糖色澤較淺，反應(yīng)過程溫和。

2.2 不同溶劑的篩選

多糖的硫酸酯化反應(yīng)可以看做雙分子親核取代反應(yīng)，其反應(yīng)速率與底物濃度和試劑的親核能力有關(guān)。不同極性的溶劑對硫酸酯化的影響不同。選取吡啶、二甲基甲酰胺、甲酰胺3種常用的強極性、強親核試劑為溶劑，考察了其在不同硫酸酯化試劑中的酯化效果（圖3）。

圖2 硫酸酯化試劑的篩選Fig.2Screen of sulfuric acid esterification reagent.

圖3 硫酸酯化溶劑的篩選Fig.3Selection of solvent.

從溶劑極性考慮，吡啶的極性最強，但其沸點也最低，溶解氨基磺酸的效果也較差，多糖在吡啶中的溶解度也不高，溶劑和多糖的體積質(zhì)量比50∶1（mL/g）的條件下不能完全溶解多糖。但吡啶與氯磺酸能發(fā)生絡(luò)合，使得氯磺酸在酯化過程中不至于放熱過快。與之相類似的是二甲基甲酰胺，因而以氯磺酸為硫酸酯化試劑的反應(yīng)過程中以吡啶為溶劑和以二甲基甲酰胺為溶劑的效果差別不大。甲酰胺極性最小，對靈芝多糖的溶解性也較差，導(dǎo)致取代度較低。以氨基磺酸為硫酸酯化試劑，需要90℃的反應(yīng)溫度，并且氨基磺酸的活性較低，使得固液反應(yīng)更加困難，因而選用對靈芝多糖和氨基磺酸溶解性都較好的二甲基甲酰胺為溶劑的效果更理想。

2.3 多糖硫酸酯的單因素考察

2.3.1 單糖殘基與硫酸化試劑的摩爾比對取代度的影響隨著硫酸酯化試劑用量與多糖的比例提高，將有利于取代度的增加；但過多的硫酸酯化試劑也會降低系統(tǒng)的pH，進而容易發(fā)生多糖的降解反應(yīng)。多糖的單糖殘基與硫酸酯化試劑的摩爾比對取代度的影響見圖4。

圖4 單糖殘基與硫酸化試劑的摩爾比對硫酸酯化靈芝胞外多糖取代度的影響。Fig.4Effect of molar ratio of sulfamic acid to sugar unit on DS.

由圖4可知，當(dāng)多糖的單糖殘基與硫酸酯化試劑的摩爾比超過1∶3后，多糖的取代度有所降低，可能是過量的氨基磺酸酸性過強，使得部分氨基磺酸作用于多糖的糖鏈上使得多糖降解。由此考慮多糖的單糖殘基與氨基磺酸的摩爾比為1∶3為最適單糖殘基與硫酸化試劑的摩爾比。

2.3.2 溶劑和多糖的體積質(zhì)量比對取代度的影響溶劑的多少不僅影響反應(yīng)底物的濃度，也決定了體系中溶解底物的量。室溫下多糖在無水有機溶劑中的溶解度都不大，但在90℃下二甲基甲酰胺溶劑中，多糖具有較好的溶解性；而90℃下，氨基磺酸在二甲基甲酰胺中的溶解性較好。溶劑和多糖的體積質(zhì)量比對靈芝胞外多糖硫酸酯化取代度的影響見圖5。當(dāng)溶劑和多糖的體積質(zhì)量比小于50∶1（mL/g）時，多糖在二甲基甲酰胺溶劑中無法完全溶解，反應(yīng)體系為液—液反應(yīng)和固—液反應(yīng)，反應(yīng)物之間不能充分接觸；當(dāng)溶劑完全溶解多糖后，進一步增加溶劑的量反而使得靈芝胞外多糖硫酸酯化取代度降低，這是由于反應(yīng)物濃度變小使得底物間碰撞概率降低，也不利于獲得高取代度的硫酸酯化胞外多糖。

由圖5可見，二甲基甲酰胺與靈芝多糖的體積質(zhì)量比為50∶1（mL/g）較合理。

圖5 溶劑和多糖的體積質(zhì)量比對硫酸酯化靈芝胞外多糖取代度的影響.Fig.5Effect of ratio of DMF to sugar unit（V/m）on DS.

2.3.3 反應(yīng)時間對取代度的影響硫酸酯化反應(yīng)是一個可逆反應(yīng)，隨著時間的延長，體系會達到熱力學(xué)平衡。硫酸酯化多糖的時間進程見圖6。

圖6 反應(yīng)時間對靈芝胞外多糖硫酸酯化取代度的影響。Fig.6Effect of reaction time on DS.

由圖6可知，當(dāng)反應(yīng)時間為2.5 h時，取代度達到1.34。當(dāng)反應(yīng)時間繼續(xù)延長，取代度并沒有明顯增加，并可能伴隨降解反應(yīng)。故最佳的反應(yīng)時間定為2.5 h。

2.3.4 硫酸化調(diào)節(jié)劑對取代度的影響由于氨基磺酸的反應(yīng)活性低，早期就有學(xué)者將硫酸化調(diào)節(jié)劑引入氨基磺酸參加的合成反應(yīng)過程中。國內(nèi)外文獻報道的硫酸化調(diào)節(jié)劑類型往往是含有氮元素的氨、胺、酞胺類化合物，如尿素、硫脲、氧化胺等，可以起到平緩硫酸化、減少多糖降解的作用。根據(jù)文獻報道的硫酸化調(diào)節(jié)劑類型，選取了尿素、硫脲、氧化胺3種硫酸化調(diào)節(jié)劑，考察其在多糖硫酸酯化過程中的催化效果。選取的反應(yīng)條件為：氨基磺酸的反應(yīng)溫度為90℃，單糖殘基與硫酸化試劑的摩爾比r（多糖的單糖殘基）∶r（氨基磺酸）=1∶3，溶劑和多糖的體積質(zhì)量比為50∶1（mL/g），反應(yīng)時間為2 h。圖7表明，尿素的催化效果較好，考慮到成本上較其它兩種物質(zhì)低很多，故選用尿素為硫酸化調(diào)節(jié)劑。

圖7 硫酸化調(diào)節(jié)劑對靈芝胞外多糖硫酸酯化取代度的影響Fig.7Effect of regulator on DS

尿素加入量對靈芝胞外多糖硫酸酯化取代度的影響見圖8。

圖8 尿素加入量對靈芝胞外多糖硫酸酯化取代度的影響。Fig.8Effect of weight ratio of urea to sulfamic acid on DS.

由圖8可知，尿素加入量占氨基磺酸質(zhì)量分數(shù)為25%時，硫酸酯化多糖的取代度最高，再增加尿素的量不能明顯提高硫酸酯化多糖的取代度。考慮到后續(xù)產(chǎn)物處理，故選擇尿素的加入量與氨基磺酸摩爾比為1∶6.4。

2.4 靈芝胞外多糖及其硫酸酯化衍生物的相對分子質(zhì)量

硫酸酯化胞外多糖的相對分子質(zhì)量顯著增加，胞外多糖硫酸酯化前后Mw/Mn增大，說明硫酸酯化后多糖衍生物的相對分子質(zhì)量分布更分散。由于小分子量多糖在氨基磺酸作用下更容易水解為小分子物質(zhì)，使得Mw/Mn增大。如圖9和表1所示。

圖9 硫酸酯化前后多糖相對分子質(zhì)量的變化Fig.9Molecular weight changes after sulfated esterification

表1 靈芝胞外多糖硫酸酯化改性前后相對分子質(zhì)量變化Table.1Molecular weight changes after sulfatedesterification of Ganoderma lucidum polysaccharide

3 結(jié)語

對發(fā)酵靈芝多糖進行硫酸化修飾并探討了硫酸化反應(yīng)條件與取代度之間的關(guān)系。分別采用氨基磺酸和氯磺酸為硫酸化酯化試劑，結(jié)果表明這兩種酯化劑在各自最佳條件下有相似的取代度，氨基磺酸使反應(yīng)更加溫和。與吡啶、甲酰胺這兩種溶劑相比，二甲基甲酰胺對反應(yīng)物的溶解性較好而使反應(yīng)有最高的取代度。此外，考察了各種因素對取代度的影響。單糖殘基與氨基磺酸的最佳摩爾比為3∶1，過量的氨基磺酸導(dǎo)致多糖降解，不利于反應(yīng)進行；溶劑和多糖的體積質(zhì)量比為50∶1（mL/g）時利于反應(yīng)物溶解并使它們相互間充分接觸以提高取代度；反應(yīng)時間為2.5 h時反應(yīng)體系達到熱力學(xué)平衡，從而取代度最高。將尿素作為硫酸化調(diào)節(jié)劑，其加入量為氨基磺酸質(zhì)量的25%（質(zhì)量分數(shù)）時能明顯提高取代度。

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Sulfated Modification of Extracellular Polysaccharide from Submerged Fermentation of Ganoderma lucidum

SHEN Jie1，LIU Yujun1，Zhang Jue*2
（1.College of Chemical&Material Engineering，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.Key Laboratory of NuclearMedicine of Ministry of Health，Jiangsu Institute of Nuclear Medicine，Wuxi 214063，China）

The extracellular polysaccharides from submerged fermentation of Ganoderma lucidum exhibit low anticancer activity.Sulfation of polysaccharides is an important approach to improve anticancer activity of polysaccharides.In addition，the degree of sulfated substitution（DS）is closely related to its biological activities.In order to understand the relationship between DS and sulfated conditions and obtain the sulfated derivatives with different DS，the sulfuric acid esterification reagent and the relationship between the sulfated reaction conditions and DS were further investigated.The results showed that aminosulfonic acid offered milder reaction conditions than that of chlorosulfonic acid.On the other hand，the addition of urea also gave mild reaction conditions and improved DS.

Ganoderma lucidum，polysaccharide，sulfation

O657.3

A

1673—1689（2015）06—0666—06

2014-01-29

無錫市科技支撐計劃——社會發(fā)展項目（CSE01N1239）；中央高校自主科研項目（JUSRP11517）；食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室自由探索基金項目（SKLF-ZZB-201504）。

張玨（1969-），女，上海人，工學(xué)博士，副研究員，主要從事天然產(chǎn)物活性和免疫學(xué)研究。E-mail：zhangjue@jsinm.org