花色素對白血病K562細胞增殖和凋亡影響的研究

朱文慧馮欣桐孫唯秀李述楊磊張冰兵侯毅鞠

（1.吉林醫(yī)藥學院檢驗學院，吉林吉林 132013；2. 吉林醫(yī)藥學院檢驗學院血液檢驗教研室，吉林吉林 132013）

花色素對白血病K562細胞增殖和凋亡影響的研究

朱文慧1馮欣桐1孫唯秀1李述1楊磊1張冰兵1侯毅鞠2*

（1.吉林醫(yī)藥學院檢驗學院，吉林吉林 132013；2. 吉林醫(yī)藥學院檢驗學院血液檢驗教研室，吉林吉林 132013）

目的：研究花色素對K562細胞增殖及凋亡的影響。方法：采用細胞體外培養(yǎng)技術，臺盼藍拒染、MTT法檢測細胞增殖抑制率；顯微鏡觀察細胞形態(tài)學變化；AnnexinV/PI雙標記流式檢測細胞凋亡的特征。結果：臺盼藍拒染、MTT檢測顯示花色素對K562細胞具有增殖抑制作用，并且與時間、濃度呈正相關；顯微鏡下直接觀察到花色素高濃度組細胞分散，胞體減小，凋亡細胞明顯增多；流式細胞儀檢測到高濃度花色素組K562細胞凋亡率高于對照組。結論：花色素對K562細胞具有增殖抑制作用，并且能夠促進K562細胞凋亡。

花色素 K562細胞 增殖 凋亡

白血病是一種造血系統(tǒng)的惡性腫瘤，我國白血病發(fā)病率約為2.76/ 10萬。白血病的發(fā)生是由于血細胞增殖失控，分化成熟受阻，正常凋亡程序失調，導致異常分化細胞大量增殖所引起［1］?；ㄉ厥侵参镏袕V泛存在的多酚類化合物的總稱，是一種天然食用色素，安全無毒，而且具有一定營養(yǎng)和藥理作用，有研究表明花色素對人乳腺癌、前列腺癌、結腸癌等腫瘤細胞具有生長抑制作用［2-4］，且對機體無明顯不良反應。近年來有研究發(fā)現(xiàn)花色素能抑制白血病細胞增殖、促進白血病細胞凋亡，能增加化療藥物的敏感性和逆轉耐藥等［5］。K562細胞是一種分化極差、惡性程度較高的人紅白血病細胞株，在體外可被多種誘導劑誘導發(fā)生凋亡、分化和增殖抑制［6-8］，是臨床和基礎領域中篩選新的抗腫瘤藥物的常用模型。在此研究背景下，本課題采用不同濃度的花色素對K562細胞作用，分別檢測其對K562細胞增殖、凋亡的作用，為臨床應用花色素抗白血病治療提供可靠的理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料限公司；臺盼藍染液購于上海碧云天生物技術有限公司；MTT試劑盒購于武漢博士生物工程有限公司；annexin V/PI試劑盒購于上海碧云天生物技術有限公司；SM-3型酶標分析儀（北京天石天力醫(yī)療器械技術開發(fā)中心）；倒置相差顯微鏡（Olympus公司）；流式細胞儀EPICS XL（美國Beckman Coulter公司）；CO2細胞培養(yǎng)恒溫箱

表1 花色素作用48h后臺盼藍染色法計數(shù)活細胞數(shù)（n=4）

圖1 不同濃度的花色素對K562細胞的抑制率

圖2 K562細胞生長狀態(tài)

圖3 對照組與高濃度藥物組K562細胞各期細胞數(shù)

花色素購于長春德爾塔生物技術有限公司；RPMI-1640培養(yǎng)基購于美國GIBCO公司；新生牛血清購于杭州四季青生物工程材料有（美國 Forma Scientific公司）； K562細胞為吉林醫(yī)藥學院檢驗學院凍存細胞。

1.2 方法

1.2.1 臺盼藍染色實驗

取對數(shù)生長期的K562細胞，以每孔9×108/L密度接種于24孔板中，將其分成5組，每組平行設置4個復孔，分別加入不同濃度的花色素，終濃度分別為0μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL（后續(xù)試驗藥物處理均依照此濃度分組），培養(yǎng)48h后采用臺盼藍拒染法計數(shù)活細胞數(shù)。

1.2.2 MTT法檢測

取對數(shù)生長期的K562細胞，以每孔9×108/L密度接種于24孔板中，分別在加藥24h、48h、72h后加入MTT溶液10μL，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)4h，終止培養(yǎng)，離心1000 r/min，5 min，棄去孔內培養(yǎng)液，每孔加入100μL Formazan 溶解液，振蕩10 min，用酶標分析儀在570nm波長下測各孔吸光度，按下列公式計算抑制率，IR% = （1－試驗組平均A值/對照組平均A值）×100%。

1.2.3 顯微鏡觀察細胞形態(tài)變化

取對數(shù)生長期的K562細胞，以每孔9×108/L密度接種于24孔板中，將其分成5組，每組平行設置4個復孔，藥物處理48h后，于倒置顯微鏡下觀察細胞狀態(tài)并拍照。

1.2.4 用流式細胞儀檢測細胞凋亡

取對數(shù)生長期的K562細胞，以每孔9×108/L密度接種于24孔板中，藥物處理48h后，經PBS洗滌，收集細胞。加人FITC標記的AnnexinV室溫避光30 min，再加入PI，避光反應5 min，加入適量Bufer處理細胞后，流式細胞儀進行檢測（具體步驟參照試劑盒說明書）。

2 結果

2.1 臺盼藍染色實驗

隨著花色素濃度的增高，細胞生長抑制率也逐漸增加，提示花色素在體外對K562細胞有明確的增殖抑制作用（見表1）。

2.2 MTT法檢測

MTT結果進一步證實，花色素能夠抑制K562細胞生長，隨著濃度從25μg/mL增加到200μg/mL，細胞生長抑制率也逐漸增加（見圖1）。

2.3 顯微鏡觀察凋亡細胞形態(tài)

對照組：細胞胞體大，呈圓形，聚集成團如葡萄串樣，胞漿內未見顆粒。藥物組：細胞分散，胞體皺縮，體積減小，凋亡細胞增多且明顯，提示花色素對K562細胞有增殖抑制和促進凋亡的作用（見圖2）。

2.4 流式細胞儀檢測細胞凋亡

流式結果顯示，藥物處理后的細胞表現(xiàn)為隨著藥物濃度的增加，凋亡細胞也有相應增多，其中與對照組比較，差異最為顯著的是200μg/mL花色素組。該結果進一步驗證了花色素對K562細胞促進凋亡的作用（見圖3）。

3 討論

白血病是源自多能造血干細胞水平的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，嚴重危害人類生命健康。根據各種類型白血病的分子學特點，白血病治療的有效方法在于抑制細胞增殖，促進異常細胞凋亡［9］。因此，尋找既能抑制白血病細胞增殖又能促進白血病細胞凋亡的藥物已成為白血病研究的熱點之一。

研究表明花色素具有抗腫瘤作用，在抗血液腫瘤治療中的作用也逐漸引起人們重視［10-11］。本實驗作者用不同濃度的花色素誘導

K562細胞，對其增殖抑制情況、形態(tài)學、誘導凋亡等方面進行了初步研究。所得到的實驗結果如下：臺盼藍拒染和MTT比色實驗表明，花色素對 K562細胞有明顯的增殖抑制作用，且隨著加入花色素濃度的增高和培養(yǎng)時間的延長，細胞增殖抑制越明顯；顯微鏡下觀察，細胞形態(tài)學顯示，花色素高濃度組細胞分散，胞體減小，凋亡細胞明顯增多；在流式細胞儀上采用AnnexinV/PI雙標記法檢測到花色素高濃度組K562細胞凋亡率高于對照組，結果提示花色素可以在體外促進K562細胞凋亡。在以上實驗結果的基礎上，我們認為花色素可以成為抑制白血病細胞異常增殖和促進白血病細胞凋亡的新藥物。綜上，花色素通過抑制K562細胞生長，促進K562細胞凋亡而改變白血病細胞異常增殖的腫瘤細胞的生物學特性，具備多項調控功能。隨著花色素在抗血液腫瘤治療中的深入研究，花色素將成為既能抑制白血病細胞增殖，并能促進白血病細胞凋亡的新藥物，成為臨床理想的非殺傷性治療血液腫瘤的藥物，為白血病治療方案提供更多、更新的選擇。

［1］雷翠蓉，姜蓉，王紅寧，等.人參總皂苷對K562細胞的增殖抑制及誘導分化作用［J］.激光雜志，2011，32（2）：69-73.

［2］Luo LP，Han B，Yu XP，et al.Anti-metastasis activity of black rice anthocyanins against breast cancer：analyses using an ErbB2 positive breast cancer cell line and tumoral xenograft model［J］. Asian Pac J Cancer Prev，2014，15（15）：6219-25.

［3］Fan MJ，Wang IC，Hsiao YT，et al.Anthocyanins from black rice（Oryza sativa L.） demonstrate antimetastatic properties by reducing MMPs and NF-κB expressions in human oral cancer CAL 27 cells［J］.Nutr Cancer，2015，67（2）：327-38.

［4］KAUSAR H，JEYABALAN J，AQIL F，et al.Berry anthocyanidins synergistically suppress growth and invasive potential of human non-small-cell lung cancer cells［J］.Cancer Letter，2012，325（1）：54-62.

［5］崔建，李曉巖.花青素抗腫瘤作用機制研究進展［J］.食品科學，2014，35（13）：310-315.

［6］李慧，石華月，儲婷，等.丹參酮ⅡA與丹參酮ⅡA磺酸鈉對K562細胞的增殖抑制與誘導分化作用［J］.華西藥學雜志，2011，26（3）：226-229.

［7］陳夏靜，田吉，何兵，等.復方維甲酸注射液誘導K562分化及凋亡作用［J］.中國藥理與臨床，2011，27（2）：64-67.

［8］王一，張玎，連小云，等.曼宋酮E對白血病K562細胞增殖和凋亡的影響［J］.中草藥Chinese Traditional and Herbal Drugs，2009，40（9）：1440-1443.

［9］柯大智，王紅寧，陳地龍，等.人參皂苷 Rg1抑制白血病細胞K562增殖并誘導分化的分子機制［J］.第三軍醫(yī)大學學報，2014，36（2）：125-129.

［10］Li-Shu Wang，Gary D.Stoner. Anthocyanins and their role in cancer prevention［J］.Cancer Lett，2008，269（2）：281-290.

［11］Lee SH，Park SM，Park SM，et al. Induction of apoptosis in human leukemia U937 cells by anthocyanins through down-regulation of Bcl-2 and activation of caspases［J］.Int J Oncol，2009，34（4）：1077-83.

吉林省教育廳科學技術研究項目（No. 2012489）；2013年吉林省大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練項目

朱文慧（1991—），女（漢族），江蘇徐州人，在讀本科。

?通訊作者：侯毅鞠（1974—），女（漢族），吉林吉林人，副教授，碩士學位，主要從事血液腫瘤相關的研究工作。