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      皮下注射布氏菌活疫苗免疫持久性觀察

      2015-11-23 06:23:23李恪梅付麗麗黃長江王國治
      浙江農(nóng)業(yè)科學(xué) 2015年3期
      關(guān)鍵詞:布氏布魯氏菌活疫苗

      陳 成,魏 東,李恪梅,付麗麗,黃長江,王國治*

      (1.溫州醫(yī)科大學(xué)環(huán)境與公共衛(wèi)生學(xué)院,浙江溫州 325035;2.中國食品藥品檢定研究院結(jié)核病疫苗室,北京 100050)

      皮下注射布氏菌活疫苗免疫持久性觀察

      陳 成1,2,魏 東2,李恪梅2,付麗麗1,2,黃長江1*,王國治1,2*

      (1.溫州醫(yī)科大學(xué)環(huán)境與公共衛(wèi)生學(xué)院,浙江溫州 325035;2.中國食品藥品檢定研究院結(jié)核病疫苗室,北京 100050)

      以小鼠為動物模型,通過檢測皮下注射布氏菌活疫苗后小鼠產(chǎn)生長期的體液免疫、細(xì)胞免疫應(yīng)答及保護(hù)力,對其進(jìn)行免疫學(xué)評價。將120只小鼠隨機(jī)分為3組,皮下注射免疫布氏菌活疫苗,分別在免疫后1,3,6,12個月,采血分離血清及脾臟淋巴細(xì)胞。ELISA法檢測免疫動物血清中抗Br-PPD IgG抗體;ELISPOT法檢測分泌IFN-γ、IL-4的脾臟淋巴細(xì)胞數(shù)目,以及用ELISA方法檢測體外再刺激后小鼠脾細(xì)胞分泌細(xì)胞因子水平;用羊布氏菌弱毒株M 5攻擊免疫動物,通過脾臟細(xì)菌計數(shù)評價布氏菌活疫苗的免疫保護(hù)力。皮下注射免疫布氏菌活疫苗,免疫1,3,6和12個月,均能產(chǎn)生較強(qiáng)的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答,體液免疫、細(xì)胞免疫及保護(hù)力呈先增強(qiáng)后減弱趨勢,免疫3個月效果最佳。通過皮下注射方式免疫小鼠布氏菌活疫苗顯示了很好的免疫原性,免疫后能誘導(dǎo)長期的體液免疫、細(xì)胞免疫及保護(hù)力。

      布氏疫苗;體液免疫;細(xì)胞免疫;保護(hù)力

      布魯氏菌簡稱布氏菌(Brucella),是革蘭氏陰性短小球桿菌。布魯氏菌屬分為6種:羊種布魯氏菌(Br.Melitensis)、牛種布魯氏菌(Br. Abortus)、豬種布魯氏菌(Br.Suis)、犬種布魯氏菌(Br.Cains)、綿羊附睪布魯氏菌(Br.Ovis)和沙林鼠種布魯氏菌(Br.Neotomae)。近幾年來,發(fā)現(xiàn)了4種新的布魯氏菌,分別是鰭腳目種(Br. Pinnidialis)、鯨魚種(Br.Ceti)、田鼠種(Br. M icroti)、小云雀種(Br.InoPinata)[1-3]。

      布魯氏菌病(簡稱布?。┦怯刹剪斒暇鷮僖鸬囊活惾诵蠊不技膊?,在世界范圍內(nèi)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。布魯氏菌具有高度的感染性,主要經(jīng)過消化道、皮膚黏膜和呼吸道等途徑侵入機(jī)體而發(fā)生感染和發(fā)病。布魯氏菌是一種細(xì)胞內(nèi)寄生的病原菌,主要寄生于網(wǎng)狀淋巴組織,造成免疫系統(tǒng)病理進(jìn)程,并常伴隨有菌血癥,對生殖、神經(jīng)和骨骼系統(tǒng)造成嚴(yán)重?fù)p害[4]。布病常呈地方性流行,人主要通過皮膚接觸、呼吸道和消化道感染,以感染羊種布魯氏菌、牛種布魯氏菌最為嚴(yán)重[5-6],豬種布魯氏菌和犬種布魯氏菌感染人較為罕見,綿羊附睪布魯氏菌和沙林鼠種布魯氏菌基本不感染人。人感染則主要引起波浪熱和轉(zhuǎn)化為慢性感染[7-8],家畜感染后可引發(fā)母畜流產(chǎn)和不育。對布病的防治,目前主要以接種疫苗為主,我國采用的人用布氏菌活疫苗[9]為牛種弱毒株104M菌株,該菌株免疫原性好,安全性高。目前,布氏菌活疫苗采用皮上劃痕接種,受種者接受性差,且進(jìn)入人體的有效劑量難以控制。

      本次研究主要采用皮下注射免疫途徑對小鼠進(jìn)行布氏菌活疫苗長期免疫學(xué)評價。免疫1,3,6和12個月后,通過體液免疫、細(xì)胞免疫應(yīng)答和免疫保護(hù)力試驗結(jié)果來評價疫苗免疫效果,為注射用布氏菌活疫苗的應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

      1 材料與方法

      1.1 主要材料

      1.1.1 動物

      SPF級BALB/C小鼠,6~8周齡,雌性,共120只,由中國食品藥品檢定研究院(簡稱中檢院)實驗動物中心提供,實驗動物生產(chǎn)許可證號: SCXK(京)2009-0017,飼養(yǎng)于中國食品藥品檢定研究院清潔級動物室。

      1.1.2 菌株

      皮下注射用布氏菌活疫苗104M菌株及羊布氏菌M5弱毒株均由中檢院結(jié)核病疫苗室提供。

      1.1.3 實驗儀器

      Bio-Ⅱ-A生物安全柜購自西班牙Telstar公司;Dragon-MK3酶標(biāo)儀購自芬蘭Labsystems公司;DH6000 AB型恒溫培養(yǎng)箱購自天津市泰斯特儀器公司;高速離心機(jī)購自德國ePPendorf;ImmunoSPot Analyzer購于CTL ImmunSPot;CO2培養(yǎng)箱購于NaPco Scientific ComPany;加樣槍購于Gilson公司。

      1.1.4 試劑耗材

      牛血清白蛋白和ConA購自美國Sigma公司;ELISPOT試劑盒Mouse IFN-γELISPot Kit購自美國BD公司;達(dá)優(yōu)-淋巴細(xì)胞分離液、無血清培養(yǎng)基、IFN-γ及IL-4 ELISA預(yù)包被試劑盒均購自達(dá)科為生物技術(shù)公司;辣根酶標(biāo)記羊抗小鼠IgG購自北京中杉金橋公司;TMB底物顯色液購自美AMRESCO公司;Br-PPD(布魯氏菌純蛋白衍生物)由中檢院結(jié)核病疫苗室提供。

      1.2 方法

      1.2.1 動物分組及免疫

      將120只BALB/C小鼠隨機(jī)分成3組,每組40只,分別為布氏菌活疫苗104M低劑量組(5× 107個菌·只-1)與高劑量組(2×108個菌·只-1),生理鹽水對照組,3組均為后肢皮下注射,劑量為0.2 m L·只-1。

      1.2.2 動物血清和脾臟淋巴細(xì)胞的制備

      免疫1,3,6和12個月后,分別對每組5只小鼠進(jìn)行摘眼球取血,分離血清,20℃保存,用于抗體水平檢測。將每只動物無菌取出的脾臟放在篩網(wǎng)上,滴加淋巴細(xì)胞分離液研磨,研磨液用巴氏管吸入到15 mL離心管中,滴加200~500μL達(dá)優(yōu)-無血清培養(yǎng)基進(jìn)行低速離心,在25℃條件下,800 g離心30 m in,吸出淋巴細(xì)胞層,加入10 m L無血清培養(yǎng)基,顛倒洗滌,室溫,250 g離心收集細(xì)胞,用于ELISPOT細(xì)胞免疫的檢測。

      1.2.3 體液免疫檢測

      用間接ELISA法檢測免疫1,3,6和12個月后小鼠血清抗Br-PPD IgG的效價。以Br-PPD蛋白4μg ·m L-1的濃度包被96孔酶標(biāo)板,4℃過夜;以PBS-T 300μL洗板5次,用1%的BSA封閉(200μL·孔-1),37℃靜置1 h;每孔加入100μL的50×開始倍比稀釋的待檢血清,37℃靜置1 h;按1∶5000倍稀釋辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG,洗板后每孔加入100μL,37℃靜置1 h;洗板,加入100μL·孔-1的TMB底物顯色液,室溫避光15 min后,在波長為450 nm處檢測吸光值D450。

      1.2.4 細(xì)胞免疫檢測

      分泌IFN-γ、IL-4的脾臟淋巴細(xì)胞的數(shù)目檢測。小鼠免疫1,3,6和12個月后,分離小鼠脾臟淋巴細(xì)胞,取96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,每孔中加混有2.0×106個·mL-1濃度細(xì)胞100μL,分別加入100 μL布氏Br-PPD抗原(終濃度為10μg·m L-1)刺激,做復(fù)孔,另用細(xì)胞培養(yǎng)液作陰性對照,一孔加ConA作陽性對照(終濃度為5μg·m L-1)。共同孵育22 h后,按ELISPOT操作依次加入檢測抗體等試劑,洗板,顯色,計數(shù)斑點數(shù)。

      體外再刺激免疫小鼠脾細(xì)胞因子產(chǎn)生水平檢測。取48孔細(xì)胞培養(yǎng)板,每孔中加2.0×106個· m L-1濃度細(xì)胞400μL,每孔分別加入50μL布氏Br-PPD抗原(終濃度為10μg·m L-1)刺激。分別以ConA(終濃度為5μg·m L-1)和培養(yǎng)基為陽性和陰性對照。37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中孵育22 h,孵育完畢后,對培養(yǎng)物進(jìn)行離心,取各孔細(xì)胞培養(yǎng)液上清,用小鼠IFN-γ、IL-4 ELISA試劑盒檢測體外刺激物刺激小鼠脾細(xì)胞分泌IFN-γ、IL-4的情況。

      1.2.5 布魯氏菌活疫苗長期免疫保護(hù)力檢測

      對免疫1,3,6和12個月后每組動物皮下攻擊羊種布魯氏菌M5弱毒株,攻擊劑量為5×108只-1,攻擊部位為后肢皮下。攻擊4周后斷頸處死動物,無菌取脾臟,通過脾臟細(xì)菌計數(shù)評價布魯氏菌活疫苗皮下注射的免疫保護(hù)力。

      1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

      實驗數(shù)據(jù)以ˉX±S表示,各組動物的效價取以10為底的對數(shù)后進(jìn)行t檢驗;用GraPhPad Prism 6繪圖及SPSS統(tǒng)計軟件分析,結(jié)果以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

      2 結(jié)果與分析

      2.1 小鼠血清中抗Br-PPD IgG水平測定

      小鼠血清用間接ELISA方法測抗體水平,結(jié)果顯示,陰性組小鼠檢測不到特異性抗體,低劑量組和高劑量組小鼠均可檢測出抗體,但整體滴度不高,同一免疫時間點,低、高劑量組IgG效價水平無顯著性差異(P>0.05);從長期免疫效果來看,免疫1,3,6,12個月抗體效價呈先上升再下降趨勢,結(jié)果表明,隨著免疫時間增加,體液免疫應(yīng)答先增強(qiáng)后減弱。結(jié)果見圖1。

      圖1 血清IgG抗體效價

      2.2 酶聯(lián)免疫斑點(ELISOPT)結(jié)果

      將以形成斑點的96孔板終止反應(yīng),自然風(fēng)干過夜后上機(jī)計數(shù)并拍照,對每孔內(nèi)的斑點進(jìn)行質(zhì)控。最終斑點計數(shù)顯示低劑量組和高劑量組在Br-PPD抗原刺激下分泌的IFN-γ、IL-4的脾臟淋巴細(xì)胞數(shù)明顯多于陰性對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。從長期免疫效果來看,免疫1,3,6,12個月脾臟淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子IFN-γ總體數(shù)量呈下降趨勢;IL-4數(shù)量相對較少,結(jié)果見圖2、圖3。

      圖2 脾臟淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ斑點數(shù)目

      圖3 脾臟淋巴細(xì)胞分泌IFN-4斑點數(shù)目

      2.3 體外再刺激免疫小鼠脾細(xì)胞因子檢測結(jié)果

      利用ELISA方法檢測以Br-PPD抗原體外刺激小鼠脾細(xì)胞分泌細(xì)胞因子水平。結(jié)果顯示,在Br-PPD抗原刺激下分泌的IFN-γ、IL-4的含量明顯高于陰性組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。從長期免疫效果來看,免疫1,3,6,12個月脾臟脾細(xì)胞分泌IFN-γ含量呈先上升后下降的趨勢,免疫3個月分泌量最高;IL-4含量呈先下降后上升的趨勢,但總體含量較低,結(jié)果見圖4、圖5。

      圖4 脾臟脾細(xì)胞分泌IFN-γ含量

      圖5 脾臟脾細(xì)胞分泌IFN-4含量

      2.4 布氏菌活疫苗免疫保護(hù)力檢測結(jié)果

      為評價皮下注射布氏菌活疫苗的長期免疫保護(hù)力,用羊布氏菌M5弱毒株皮下攻擊免疫動物,以脾臟布氏菌分離數(shù)為指標(biāo)。結(jié)果顯示,在同一免疫時間點,低劑量組和高劑量組動物脾臟載菌數(shù)明顯低于陰性組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);從長期免疫效果來看,免疫1,3,6,12個月,低劑量組和高劑量組動物脾臟載菌數(shù)呈先減少后增加趨勢,表明免疫3個月保護(hù)力最強(qiáng),隨后免疫保護(hù)力隨時間延長逐漸減弱,結(jié)果見圖6。

      圖6 羊布氏菌M5攻擊感染后脾臟中的細(xì)菌載量

      3 小結(jié)和討論

      布魯氏菌是一種革蘭氏陰性細(xì)胞內(nèi)寄生菌,家畜感染后導(dǎo)致流產(chǎn),人感染后引發(fā)波狀發(fā)熱、心內(nèi)膜炎、關(guān)節(jié)炎和骨髓炎。機(jī)體對布氏菌的清除依賴于體液免疫和細(xì)胞免疫的聯(lián)合作用。布氏菌感染宿主后被APC提呈給吞噬細(xì)胞,同時激發(fā)APC分泌IL-12、IL-4細(xì)胞因子,引起Th0細(xì)胞(CD4+)分別分化Th1和Th2細(xì)胞[10-11]。Th1細(xì)胞分泌IFN-γ激活吞噬細(xì)胞的吞噬功能,參與細(xì)胞免疫;Th2細(xì)胞分泌IL-4細(xì)胞因子主要參與體液免疫[12-13]。

      本試驗以低、高劑量皮下免疫布氏菌活疫苗,免疫1個月、3個月、6個月、12個月后分別檢測抗體水平,結(jié)果顯示,陰性組小鼠檢測不到特異性抗體,低劑量組和高劑量組小鼠均可檢測出抗體,但整體滴度不高,同一免疫時間點,低、高劑量組IgG效價水平相近;從長期免疫效果來看,免疫1,3,6,12個月抗體效價呈先上升再下降趨勢,即1~3個月體液免疫在逐漸增強(qiáng),到達(dá)3~6個月整體水平相對較穩(wěn)定,隨后6~12個月衰減。細(xì)胞免疫ELISPOT檢測結(jié)果顯示,在Br-PPD抗原刺激下分泌IFN-γ和IL-4的脾臟淋巴細(xì)胞數(shù)均明顯多于陰性對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);從長期免疫效果來看,免疫1,3,6,12個月脾臟淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子IFN-γ總數(shù)目呈下降趨勢;IL-4水平相對較低。ELISA方法檢測體外刺激細(xì)胞因子檢測顯示,在Br-PPD抗原刺激下分泌的IFN-γ、IL-4的含量明顯高于陰性組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);從長期免疫效果來看,免疫1,3,6,12個月脾臟脾細(xì)胞分泌IFN-γ含量呈先上升后下降的趨勢,免疫3個月含量最高;分泌IL-4含量呈先下降后上升的趨勢,免疫3個月含量最低,但與IFN-γ含量相比總體含量較低。本次試驗細(xì)胞免疫結(jié)果顯示,在Br-PPD抗原刺激下,檢測到分泌IFN-γ脾細(xì)胞數(shù)目及含量遠(yuǎn)高于IL-4,結(jié)果表明參與細(xì)胞免疫應(yīng)答主要以Th1型為主,Th2型為輔。

      疫苗的效力試驗是評價疫苗免疫保護(hù)力最可靠的指標(biāo)。傳統(tǒng)布氏疫苗的效力評價主要是使用豚鼠,效力實驗用強(qiáng)毒株攻擊,本次研究參照中國藥典效力測定的方法[14],以小鼠為動物模型,使用羊布氏菌M5弱毒株攻擊,大大提高了實驗的經(jīng)濟(jì)性和安全性。結(jié)果顯示,在同一免疫時間點,低劑量組和高劑量組動物脾臟載菌數(shù)明顯低于陰性組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);從長期免疫效果來看,免疫1,3,6,12個月,低劑量組和高劑量組動物脾臟載菌數(shù)均呈先減少后增加趨勢,免疫3個月低、高劑量脾臟分離不出攻擊株,表明免疫3個月保護(hù)力達(dá)到最強(qiáng),隨后免疫保護(hù)力隨時間延長逐漸減弱,這一點與細(xì)胞免疫中IFN-γ含量結(jié)果基本一致。高劑量免疫組,在免疫后6~12個月脾臟載菌數(shù)明顯低于低劑量,顯示出一定效量關(guān)系??傮w上,免疫后12個月的保護(hù)力與免疫后1個月基本持平,表明該疫苗長期保護(hù)力較好。

      本次試驗是皮下注射布氏菌活疫苗長期免疫學(xué)評價及免疫保護(hù)力的初步研究,試驗表明,布氏疫苗采用皮下免疫途徑是可行的,免疫后能長時間獲得很好的免疫效果,因此皮下注射用布氏菌活疫苗有希望成為新一代布氏疫苗,不但接種方式簡單,而且接種劑量更低、長期誘導(dǎo)機(jī)體免疫,至于能否真正應(yīng)用于人用疫苗,還有待強(qiáng)毒布魯氏菌攻擊保護(hù)試驗和臨床試驗進(jìn)一步研究。

      [1] Cutler S J,Whatmore A M,Commander N J.Brucellosis-new asPects of an old disease[J].Journal of APPlied M icrobiology,2005,98:1270-1281.

      [2] Godfroid J,Cloeckaert A,Liautard J P,et al.From the discovery of the Malta fever's agent to the discovery of a marinemammal reservoir,brucel-losis has continuously been a re-emerging zoonosis[J].Veterinary Research,2005,36: 313-326.

      [3] PaPPas G,Akritidis N,Bosilkovsk iM,et al.Brucellosis[J]. The New England Journal of Medicine,2005,352: 2325-2336.

      [4] ClaPP B,Skyberg JA,Yang X,et al.Protective live oral brucellosis vaccine stimulate Th1 and Th17 cell resPonses[J]. Infection and Immunity,2011,79(10):4165-4174.

      [5] Greenfield R A,Drevets D A,Machado L J,et al.Bacterial Pathogens as biologicalweaPons and agents of bioterrorism[J]. American Journal of the Medical Sciences,2002,323: 299-315.

      [6] Schurig G G,Sriranganathan N,Corbel M J.Brucellosis vaccines:Past,Present and future[J].Veterinary M icrobiology,2002,90:479-496.

      [7] Mense M G,Van De Verg L L,Bhattacharjee AK,et al. Bacteriologic and histologic features in mice after intranasal inoculation of Brucella melitensis[J].American Journal of Veterinary Research,2001,62(3):398-405.

      [8] Olsen S C,Waters W R,Stoffregen W S.An aerosolized Brucella sPP.challenge model for laboratory animals[J]. Zoonoses Public Health,2007,54(8):281-285.

      [9] Cheville N F,Olsen S C,Jensen A E,et al.Effects of age at vaccination on efficacy of Brucella abortus strain RB51 to Protect cattle against b rucellosis[J].American Journal of Veterinary Research,1996,57(8):1153-1156.

      [10] Medzhitov R,Janeway C A Jr.Innate immunity:imPact on the adaPtive immune resPonse[J].Current OPinion in Immunology,1997,9(1):4-9.

      [11] Underhill D M,Ozinsky A H,Adeline M,et al.The Toll-like recePtor 2 is recruited to macroPhage Phagosomes and d iscriminates between Pathogens[J].Nature,1999,401(6755):811-815.

      [12] Germain R N.MHC-dePendent antigen Processing and PePtide Presentation[J].Cell,1994,76(2):287-299.

      [13] Clark L B,F(xiàn)oy T M,Noelle R J.CD40 and its ligand[J]. Advances in Immunology,1996,63:43-78.

      [14] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[M].3部.北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2005:77-79.

      (責(zé)任編輯:盧福莊)

      S 852.61+4,R 378.5

      A

      0528-9017(2015)03-0412-04

      10.16178/j.issn.0528-9017.20150341

      2014-12-19

      “重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(2014ZX09304311-002)人獸共患病鼠疫、布氏等疫苗評價技術(shù)研究

      陳 成(1989-),男,安徽安慶人,碩士生,研究方向為生物學(xué)。E-mail:ccbioteam@sina.com。

      王國治。E-mail:tbtestlab@viP.tom.com;黃長江。E-mail:cjhuang5711@163.com。

      文獻(xiàn)著錄格式:陳成,魏東,李恪梅,等.皮下注射布氏菌活疫苗免疫持久性觀察[J].浙江農(nóng)業(yè)科學(xué),2015,56(3):412-416.

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