唐玉玲，馬莉，趙丹，賈林，楊銳，楊曉萍△

細胞與分子生物學(xué)

1,25（OH）2D3對人腎小球系膜細胞增殖及mTOR/p70s6K表達的影響

唐玉玲1，馬莉1，趙丹2，賈林1，楊銳1，楊曉萍2△

目的探討1,25-二羥基維生素D3［1,25（OH）2D3］對人腎小球系膜細胞增殖的影響及其在腎小球系膜細胞調(diào)控中對mTOR/p70s6K信號通路的作用。方法體外培養(yǎng)人腎小球系膜細胞，取傳代培養(yǎng)至3～7代細胞分為4組：正常對照組（加含5%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基），VD組［加1,25（OH）2D310-8mol/L］，R組（加雷帕霉素5 mg/L），R+ VD組［加雷帕霉素5 mg/L及1,25（OH）2D310-8mol/L］，干預(yù)48 h。采用細胞增殖與活性檢測試劑盒CCK-8檢測細胞增殖情況，流式細胞術(shù)檢測細胞周期時相分布，免疫熒光法檢測細胞中mTOR、p70s6K的表達情況。結(jié)果正常對照組、VD組、R組、R+VD組：（1）吸光度值（A450）依次降低，組間多重比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；抑制率（IR）依次升高。（2）G1期細胞比例依次增加，S期、G2/M期依次減少，增殖指數(shù)（PI）依次降低，除R組與VD組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義外，其余組間多重比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。（3）系膜細胞中mTOR、p70s6K蛋白表達強度均依次降低，除R組與VD組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義外，其余組間多重比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論1,25（OH）2D3可顯著抑制人系膜細胞增殖，且其可能通過抑制mTOR/p70s6K信號通路調(diào)控腎小球系膜細胞增殖。

腎小球系膜細胞；細胞增殖；細胞周期；核糖體蛋白質(zhì)S6激酶類,70-kDa；1,25-二羥基維生素D3；mTOR/p70s6K信號通路

系膜細胞異常增殖是導(dǎo)致各種腎小球腎炎向終末期腎病（ESRD）發(fā)展的中心環(huán)節(jié)，有效抑制系膜細胞增殖是防治腎小球腎炎的重要策略。1,25-二羥基維生素D3［1,25（OH）2D3］具有多種新型生物學(xué)效應(yīng)，包括促使腫瘤細胞生長停滯、誘導(dǎo)細胞凋亡和分化。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）/p70s6K激酶（p70s6K）信號通路在正常及癌細胞的生長、增殖、分化、凋亡、代謝中扮演重要角色［1］。研究證實，mTOR/p70s6K信號通路的異常與多種惡性腫瘤有關(guān)，mTOR在骨肉瘤、腎細胞癌、結(jié)腸癌等多種腫瘤細胞中呈高表達［2-4］。但目前mTOR/p70s6K信號通路在人系膜細胞中的作用尚少見報道。本研究通過CCK-8法及流式細胞術(shù)觀察活性維生素D3對人腎小球系膜細胞增殖的影響，并通過免疫熒光法觀察人腎小球系膜細胞中mTOR、p70s6K蛋白的表達情況，探討活性維生素D3在腎小球系膜細胞調(diào)控中對mTOR/p70s6K信號通路的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細胞株人腎小球系膜細胞株（湘雅醫(yī)學(xué)院中心實驗室提供），本課題組前期通過形態(tài)學(xué)觀察及免疫熒光實驗鑒定為人系膜細胞。

1.1.2 主要試劑1,25（OH）2D3、LY294002、碘化丙啶（美國Sigma公司）,雷帕霉素（上海生工公司）,胰蛋白酶（美國Gibco公司）,CCK-8試劑盒、兔抗人mTOR單克隆抗體（美國cell signal公司）,兔抗人p70s6K單克隆抗體（海艾博抗貿(mào)易有限公司）,山羊抗兔IgG二抗（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。

1.1.3 儀器與設(shè)備細胞培養(yǎng)箱（美國Thermo Forma公司），普通光學(xué)顯微鏡、倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司），ELX-800酶標(biāo)儀（美國Biokit公司），流式細胞儀（德國Partec公司），激光共聚焦顯微鏡（德國ZEISS公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)用含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基復(fù)蘇腎小球系膜細胞，置于5%CO2、37℃飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細胞生長至70%～80%融合時，用0.25%胰蛋白酶消化，傳代繼續(xù)培養(yǎng)，取3～7代用于實驗。

1.2.2 實驗分組及細胞干預(yù)收集生長良好的對數(shù)期腎小球系膜細胞，計數(shù)后接種于培養(yǎng)瓶中，待細胞完全貼壁后棄完全培養(yǎng)基，加入L-DMEM同步化24 h，設(shè)4組：（1）正常對照組，L-DMEM培養(yǎng)基（5%FBS）。（2）VD組，1,25（OH）2D3（10-8mol/L）。（3）R組，雷帕霉素（5 mg/L）。（4）R+VD組，雷帕霉素（終濃度為5 mg/L）+1,25（OH）2D3（終濃度為10-8mol/L）。

1.2.3 CCK-8法檢測系膜細胞增殖情況參照CCK-8試劑盒說明書操作。取對數(shù)期人腎小球系膜細胞，調(diào)整濃度為1×104個/mL，200 μL/孔接種于96孔板內(nèi)；按照實驗分組干預(yù)48 h，干預(yù)結(jié)束后PBS沖洗1次，加入100 μL L-DMEM及10 μL CCK-8溶液，培養(yǎng)4 h后振蕩15 min，酶標(biāo)儀檢測各孔在450 nm波長處的吸光度值（A450）。每組設(shè)4個復(fù)孔，設(shè)置空白調(diào)零孔（只加L-DMEM及CCK-8溶液）。實驗重復(fù)3次，并計算抑制率（inhibition rate，IR）=［A（對照組）-A（實驗組）］/A（對照組）× 100%。

1.2.4 流式細胞術(shù)檢測系膜細胞細胞周期分布情況取對數(shù)期人腎小球系膜細胞，調(diào)整濃度為2×105個/mL，接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)；按照實驗分組干預(yù)48 h，干預(yù)結(jié)束后收集細胞，4℃預(yù)冷的70%乙醇重懸，4℃固定過夜；上機前離心1次，PBS洗滌1次，1×Buffer液重懸細胞，加入RNA酶（終濃度為10 g/L），37℃孵育30 min，加入PI染液（終濃度為50 mg/L），4℃避光反應(yīng)30 min，移入流氏管中，再加入PBS至2 mL，上機檢測。實驗重復(fù)3次，計算細胞增殖指數(shù)（proliferation index，PI）=（S期+ G2/M期細胞比例）（/G1期+S期+G2/M期細胞比例）×100%。

1.2.5 免疫熒光檢測及結(jié)果判定取對數(shù)期人腎小球系膜細胞，調(diào)整濃度為8×103個/孔，接種于6孔板內(nèi)的蓋玻片上，加入10%DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后按實驗分組干預(yù)48 h，干預(yù)結(jié)束后PBS浸洗3次，每孔加入4%多聚甲醛500 μL固定20 min；PBS浸洗3次，加10%正常山羊血清100 μL，室溫封閉30 min，加一抗，4℃孵育過夜（一般大于18 h）；PBS浸洗3次，避光滴加FITC標(biāo)記兔抗山羊IgG（1∶100），室溫反應(yīng)1.5 h，5%甘油封片，最后采用激光共聚焦顯微鏡觀察并采圖，AIM軟件測定熒光強度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用方差分析，組間多重比較用LSD法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CCK-8法檢測各組干預(yù)48 h后對人腎小球系膜細胞增殖的影響正常對照組、VD組、R組、R+ VD組A450依次降低，組間多重比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；正常對照組、VD組、R組、R+VD組IR依次升高。見表1。

Tab.1The effects of 48-hour drug treatment on mesangial cell proliferation，which was measured by CCK-8 colorimetric assay表1 CCK-8法檢測各組干預(yù)48 h后對人系膜細胞增殖的影響（n=10）

2.2 流式細胞術(shù)檢測各組干預(yù)48 h后對人腎小球

系膜細胞細胞周期的影響正常對照組、VD組、R組、R+VD組G1期細胞比例依次增加，S期、G2/M期依次減少，PI依次降低，除R組與VD組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義外，其余組間多重比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。見表2、圖1。

Tab.2The effects of 48-hour drug treatment on mesangial cell cell cycles，which was measured by flow cytometry表2 流式細胞術(shù)檢測各組干預(yù)48 h后對人腎小球系膜細胞細胞周期（n=10，%）

Tab.2The effects of 48-hour drug treatment on mesangial cell cell cycles，which was measured by flow cytometry表2 流式細胞術(shù)檢測各組干預(yù)48 h后對人腎小球系膜細胞細胞周期（n=10，%）

細胞周期各時相分布G1期54.50±1.53 62.84±1.77a 68.14±1.20a 71.28±1.15abc 119.07＊組別正常對照組VD組R組R+VD組F S期33.05±1.97 27.53±2.11a 20.56±2.54a 19.00±2.47abc 94.39＊G2/M期12.01±1.49 11.30±1.81a 11.80±0.56a 7.49±1.28abc 14.28＊PI 45.26±1.53 38.19±1.77a 31.83±1.20a 28.24±1.15abc 105.42＊

Fig.1The effects of 48-hour drug treatment on mesangial cell cell cycles,which was measured by flow cytometry圖1 流式細胞術(shù)檢測各組干預(yù)48 h后對人腎小球系膜細胞細胞周期的影響

2.3 免疫熒光檢測各組干預(yù)48 h后腎小球系膜細胞中mTOR、p70s6K的表達情況正常對照組、VD組、R組、R+VD組系膜細胞中mTOR、p70s6K蛋白表達強度均依次降低，除R組與VD組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義外，其余組間多重比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。見表3，圖2、3。

Tab.3The expression of mTOR，p70s6K were detected by immunofluorescence in each group of mesangial cells表3 各組系膜細胞中mTOR、p70s6K免疫熒光強度比較（n=6）

Tab.3The expression of mTOR，p70s6K were detected by immunofluorescence in each group of mesangial cells表3 各組系膜細胞中mTOR、p70s6K免疫熒光強度比較（n=6）

mTOR免疫熒光強度246.25±73.76 191.91±23.89a 178.42±21.47a 108.78±13.74abc 19.27＊組別正常對照組VD組R組R+VD組F p70s6K免疫熒光強度452.12±22.55 287.11±22.72a 244.52±25.73a 226.13±25.27abc 32.63＊

3 討論

1,25（OH）2D3除了有調(diào)節(jié)鈣磷代謝和免疫系統(tǒng)的功能外，還能調(diào)控多種組織來源細胞的生長和分化，主要表現(xiàn)為抑制多種腫瘤細胞、免疫細胞及腎臟系膜細胞增殖、分化相關(guān)的基因表達，最終影響細胞增殖、凋亡與分化［5］。有研究顯示1,25（OH）2D3可抑制體外培養(yǎng)的小鼠系膜細胞的增殖［6］。本課題組前期研究也證實，1,25（OH）2D3可通過阻滯細胞周期而顯著抑制正常人系膜細胞的增殖［7］。本研究結(jié)果顯示：與正常對照組比較，VD組人系膜細胞的生長被顯著抑制，并將細胞周期阻滯于G1期，進一步證實1,25（OH）2D3能顯著抑制人系膜細胞的進程，阻滯系膜細胞增生，與前期研究結(jié)果一致。

細胞分裂增殖的實質(zhì)是DNA復(fù)制，而細胞DNA復(fù)制及蛋白合成與mTOR信號通路的活化密切相關(guān)。mTOR屬于PI3K蛋白激酶類家族，是PI3K/Akt信號通路下游的一個效應(yīng)蛋白，其底物調(diào)控與細胞生長、存活和增殖相關(guān)蛋白的合成有關(guān)［8］。mTOR通過激活其下游靶蛋白p70s6K提高下游蛋白翻譯效率，促進蛋白質(zhì)合成及細胞生長、增殖［9］。阻斷該信號通路的活化，mTOR靶向抑制劑雷帕霉素可通過抑制mTOR及其下游底物p70S6K、4E-結(jié)合蛋白1（4E-BP1）的活性，促進柯薩奇病毒（CVB3）所致HeLa細胞的病變效應(yīng)及細胞凋亡，從而影響細胞增殖［10］。本研究結(jié)果顯示，與正常對照組比較，R組系膜細胞增殖顯著被抑制，并將細胞周期阻滯于G1期，提示mTOR/p70s6K信號通路在系膜細胞的增殖過程中可能起著重要的調(diào)控作用。

有研究顯示，mTOR/p70s6K信號通路在細胞的生存、生長與增殖中起中心調(diào)控作用，其活化可以抑制多種刺激誘發(fā)的細胞凋亡，促進細胞周期進展，從而促進細胞的生存和增殖，同時參與血管形成，并參與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移［11］。Li等［12］研究證實，丹參酮IIA（T2A）通過mTOR/p70s6K/4E-BP1信號通路可抑制乳腺癌細胞中缺氧誘導(dǎo)因子（HIF）-1α蛋白的合成及血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的表達，進而抑制該腫瘤血管的生成與生長。Yang等［13］發(fā)現(xiàn)，依維莫司（mTORC1）可協(xié)同活性維生素D3下調(diào)mTOR底物p70s6K和起始因子4E-BP1的表達，誘導(dǎo)急性早幼粒細胞U937的增殖與分化，增加活性維生素D3介導(dǎo)的p21（waf1）轉(zhuǎn)錄活性及維生素D受體（VDR）乙?；健＆?硫辛酸可通過mTOR/p70s6K/4E-

BP1信號通路劑量依賴性地調(diào)控高糖誘導(dǎo)的腎小球系膜細胞增生及細胞外基質(zhì)的形成［14］。本研究結(jié)果顯示，R+VD組較另3組人腎小球系膜細胞的增殖抑制更為明顯，提示1,25（OH）2D3可協(xié)同雷帕霉素加強對系膜細胞的抑制作用，1,25（OH）2D3可能通過阻滯mTOR/p70s6K信號通路抑制系膜細胞增殖。另外，免疫熒光結(jié)果顯示，正常對照組中mTOR、p70s6K蛋白有表達，提示mTOR/p70s6K信號通路確實存在于正常人系膜細胞中；與正常對照組比較，VD和R組mTOR、p70s6K蛋白表達均顯著降低，進一步證實1,25（OH）2D3能通過阻滯mTOR/p70s6K信號通路抑制系膜細胞增殖。與VD組比較，R+VD組mTOR、p70s6K蛋白表達顯著降低，提示1,25（OH）2D3可協(xié)同雷帕霉素下調(diào)mTOR、p70s6K的表達，從而抑制系膜細胞增殖，與Yang等［13］研究結(jié)果一致。

綜上所述，1,25（OH）2D3可顯著抑制人腎小球系膜細胞增殖，將系膜細胞周期阻滯于G1期，其機制可能是通過抑制mTOR/p70s6K信號通路來實現(xiàn)的，但仍有待進一步研究證實。

（圖2、3見插頁）

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（2015-04-17收稿 2015-05-11修回）

（本文編輯 陳麗潔）

Effects of 1,25（OH）2D3on proliferation and mTOR/p70s6K expressions of human glomerular mesangial cells

TANG Yuling1，MA Li1，ZHAO Dan2，JIA Lin1，YANG Rui1，YANG Xiaoping2△
1 Medical College of Shihezi University，Xinjiang 832000，China；2 Department of Nephrology，the First Affiliated Hospital of Medical College of Shihezi University△

ObjectiveTo investigate the effects of 1,25-dihydroxyvitamin D3［1,25（OH）2D3］on cell proliferation in hu?man glomerular mesangial cells and it′s effects on the regulation of mTOR/p70s6K signaling pathway in this cell line.MethodsThe cultured human mesangial cells at passage 3-7 were divided into four groups:control group，VD group（addition of 10-8mol/L of 1,25-dihydroxyvitamin D3），R group（addition of 5 mg/L of rapamycin）and R+VD group（addition of 5 mg/L ra?pamycin combined with 10-8mol/L of 1,25-dihydroxyvitamin D3）.Drug incubation last 48 h.The effect of mesangial cell pro?liferation was measured by CCK-8 colorimetric assay.The cell cycles were measured by flow cytometry.The expression of mTOR and p70s6K were detected by immunofluorescence.Results（1）The absorbance of A450was higher in control group than that in VD group than that in R group than that in R+VD group.But the inhibition rate（IR）was lower in control group than that in VD group than that in R group than that in R+VD group.All comparisons were of statistic significance.（2）Cells in G1phase were higher while cells in G2/M and S phases as well as proliferation rate（PI）were lower in control group than those in VD group than those in R group than those in R+VD group.All comparisons were of statistic significance except in?dexes between group R and group VD.（3）mTOR and p30s6K expressions in mesangial cells were higher in control group than those in VD group than those in R group than those in R+VD group.All comparisons were of statistic significance ex?cept indexes between group R and group VD.Conclusion1,25-dihydroxyvitamin D3might inhibit mesangial cell prolifera?tion significantly through mTOR/p70s6K signaling pathways.

mesangial cells；cell proliferation；cell cycle；ribosomal protein S6 kinases,70-kDa；1,25（OH）2D3；mTOR/ p70s6K signaling pathway

R692

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.10.001

國家自然科學(xué)基金資助項目（81160090）

1新疆石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院（郵編832000）；2新疆石河子大學(xué)第一附屬醫(yī)院腎病科

唐玉玲（1987），女，碩士在讀，主要從事腎病系統(tǒng)疾病研究

△通訊作者E-mail:sbkyxp@163.com