我國(guó)甜菜花葉病毒基因與馬鈴薯Y病毒屬其它家族序列的比較與分析

丁廣洲，李永剛，趙春雷，王希，張玉霜，劉娜，陳麗，陳連江*

（1.黑龍江省甜菜工程技術(shù)研究中心，黑龍江哈爾濱150080；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院甜菜研究所，黑龍江哈爾濱150080）

我國(guó)甜菜花葉病毒基因與馬鈴薯Y病毒屬其它家族序列的比較與分析

丁廣洲1，3，李永剛2，趙春雷1，3，王希1，3，張玉霜1，3，劉娜1，3，陳麗1，3，陳連江1，3*

（1.黑龍江省甜菜工程技術(shù)研究中心，黑龍江哈爾濱150080；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院甜菜研究所，黑龍江哈爾濱150080）

為弄清發(fā)生在我國(guó)甜菜花葉病毒的基因序列基本特征，將發(fā)生和流行于我國(guó)的甜菜花葉病毒基因與美國(guó)和斯洛伐克等地的花葉病病毒以及同屬于馬鈴薯Y病毒屬的其它病毒進(jìn)行比較和分析。研究表明，我國(guó)甜菜花葉病毒基因全序列9591bp，編碼3085個(gè)氨基酸，含有若干馬鈴薯Y病毒屬高度保守的結(jié)構(gòu)功能域。該病毒含有10個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白（分別為P1，HC-pro，P3，6K1，CI，6K2，VPg，NIa，NIb和CP），并將各蛋白的交割位點(diǎn)序列與其它馬鈴薯Y病毒屬成員進(jìn)行了比較。通過(guò)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，甜菜花葉病毒與落葵皺紋花葉病毒、平蓮花葉病毒較高度同源，另與花生斑駁病毒和香雪蘭花葉病毒近緣。

甜菜花葉病毒基因；馬鈴薯Y病毒屬；系統(tǒng)發(fā)育

甜菜花葉病毒是馬鈴薯Y病毒科（Potyviridae）Y病毒屬（Potyvirus）家族的典型成員，病毒粒子為線性，單分子正義RNA。甜菜花葉病毒在體外相對(duì)不穩(wěn)定，10 min熱滅活點(diǎn)55～60℃，一般稀釋限點(diǎn)為1/4000。20℃的傳染潛伏時(shí)間最高可達(dá)48 h。-20℃?zhèn)魅拘源婊钇谙逓?年左右。甜菜花葉病是較具破壞性的流行病害之一，由于該病毒可經(jīng)多種蚜蟲(chóng)非持久性傳播，而且寄主范圍十分廣泛，所以，在田間防治上相對(duì)比較困難。在甜菜主產(chǎn)區(qū)時(shí)常發(fā)生甜菜花葉病與黃化毒病的混合侵染，使受害癥狀進(jìn)一步加劇，造成甜菜生產(chǎn)的嚴(yán)重?fù)p失[1]。甜菜花葉病在中國(guó)新疆、內(nèi)蒙古、山西、河北和黑龍江等甜菜產(chǎn)區(qū)每年都有發(fā)生，感染植株自癥狀表現(xiàn)起，塊根產(chǎn)量每周降低2%～2.1%[2]。收獲期測(cè)糖，病株含糖率平均降低3～3.4個(gè)百分點(diǎn)，經(jīng)熒光檢測(cè)，葉片葉綠素含量降幅高達(dá)59%[3]。近年來(lái)，又相繼出現(xiàn)了關(guān)于甜菜花葉病毒感染和危害生菜及鷹嘴豆等其他作物的報(bào)道[4-5]。Moran等（2002）、M.Glasa等（2003）、L.G.Nemchinov等（2004；2015）、Haiying Xiang等（2007）分別從流行于澳大利亞、斯洛伐克、美國(guó)和中國(guó)的甜菜花葉病毒中分離獲得BtMV基因序列[6-9]。

為進(jìn)一步了解和分析發(fā)生和流行于我國(guó)的甜菜花葉病毒基因的結(jié)構(gòu)與進(jìn)化情況，本研究選取了部分同屬于馬鈴薯Y病毒家族的植物病毒進(jìn)行了研究與分析。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究的數(shù)據(jù)資料來(lái)源于NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）核酸及其氨基酸序列。

1.2 方法

將發(fā)生于我國(guó)的甜菜花葉病毒基因通過(guò)NCBI的Blast檢索系統(tǒng)（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast）進(jìn)行序列的同源性分析，然后從中選取相關(guān)的馬鈴薯Y病毒基因家族序列，采用ClustalX軟件做初步的多序列匹配排列（Multiple Alignments），最后采用BioEdit軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)生于我國(guó)的甜菜花葉病毒基因結(jié)構(gòu)域及與其它病毒基因結(jié)構(gòu)域位點(diǎn)的比較與分析

發(fā)生和流行在我國(guó)的甜菜花葉病毒基因全序列為9591bp，5’端有1個(gè)165 bp的非編碼區(qū)，編碼3085個(gè)氨基酸，依次構(gòu)成了P1 protein（313aa）；HC-protein（457 aa）；P3-protein（347aa）；6K1-protein（52aa）；CI-protein（634aa）；6K2-protein（52aa）；Vpg-protein（191aa）；NIa-protein（247aa）；Nib-protein（516aa）和Coat protein（276 aa），詳見(jiàn)圖1。甜菜花葉病毒蛋白含有高度保守的結(jié)構(gòu)功能區(qū)，在馬鈴薯Y病毒屬家族蛋白組成結(jié)構(gòu)中，鋅指蛋白結(jié)構(gòu)域和PTK結(jié)構(gòu)域參與蚜蟲(chóng)的互動(dòng)傳播，位于甜菜花葉病毒蛋白P3多肽的340～371 aa和HC蛋白的622～624aa殘基分別為鋅指蛋白結(jié)構(gòu)域和PTK結(jié)構(gòu)域；493～496aa是FRNK結(jié)構(gòu)域，其功能是響應(yīng)蚜蟲(chóng)的傳播和表現(xiàn)病癥；CI蛋白屬于RNA解旋酶的第二大族群，在結(jié)構(gòu)域的1254～1262aa是GAVGSGKST序列，其功能是綁定NTP。另6個(gè)解螺旋結(jié)構(gòu)功能域分別是位于1277～1283 aa的LEPTRPL結(jié)構(gòu)域；位于1343～1346 aa的DESH結(jié)構(gòu)域；位于1369～1376 aa的LKVSATPP結(jié)構(gòu)域；位于1420～1423 aa的LVYV結(jié)構(gòu)域；位于1472～1483 aa的VATNIIENGVTL結(jié)構(gòu)域和位于1516～1527 aa的GERLQRLGRVGR結(jié)構(gòu)域。甜菜花葉病毒Nib蛋白具有馬鈴薯Y病毒多肽典型的保守功能域GNNSGQPSTVVDNTLMV（2600~ 2616 aa）and GDD（2644～2646 aa）以及與其相應(yīng)的更大的SG-(X)3-T-(X)3-NT-(X)30-GDD結(jié)構(gòu)域，其為依賴(lài)于RNA聚合酶的RNA活性位點(diǎn)。

通過(guò)與花生斑駁病毒（Peanut mottle virus）、菜豆黃花葉病毒（Bean yellow mosaic virus）基因編碼的蛋白比較，花生斑駁病毒蛋白含有3099個(gè)氨基酸，鏈接10個(gè)結(jié)構(gòu)域的9個(gè)位點(diǎn)分別是IHQY/S；YVVG/G；VVYQ/ A；VRYQ/S；VQYQ/S；VRYQ/G；VATE/G；VEYQ/S；VRYQ/S。菜豆黃花葉病毒的鏈接10個(gè)結(jié)構(gòu)域的9個(gè)位點(diǎn)分別是IREF/S；YRVG/G；YTFQ/A；YRFQ/S；LQFE/S；FVFQ/G；FDFE/S；LSFQ/S；CRFQ/S，而甜菜花葉病毒的鏈接結(jié)點(diǎn)分別為T(mén)MHY/S；YRVG/G；VEYQ/A；VKYQ/S；VQYQ/G；VQYQ/G；VREE/G；VVEQ/G；VTYQ/G（見(jiàn)圖1）。關(guān)于結(jié)構(gòu)域的鏈接結(jié)點(diǎn)的差異是否事關(guān)傳播媒介的選擇，目前還不得而知。

圖1 3種不同病毒結(jié)構(gòu)蛋白的氨基酸切割位點(diǎn)比較Fig.1 Amino acid cleavage sites comparison of BtMV(Beet mosaic virus)with PeMoV(Peanut mottle virus)and BYMV(Bean yellow mosaic virus)

2.2 我國(guó)甜菜花葉病毒基因與其它國(guó)家甜菜花葉病毒基因的親緣關(guān)系分析

為明確我國(guó)甜菜花葉病毒與其它國(guó)家甜菜花葉病毒的親緣關(guān)系，采取BioEdit軟件對(duì)流行在我國(guó)的甜菜花葉病毒與美國(guó)、澳大利亞（同英國(guó)）、斯洛伐克等地的BtMV生理小種做了遺傳發(fā)育進(jìn)化樹(shù)分析（見(jiàn)圖2），從圖中可以看出，發(fā)生和流行于我國(guó)的甜菜花葉病毒生理小種1與英國(guó)和斯洛伐克的近緣；而生理小種2與發(fā)生在美國(guó)的BtMV具有較近的親緣關(guān)系。

圖2 發(fā)生在我國(guó)的甜菜花葉病毒與其他國(guó)家的BtMV親緣關(guān)系比較Fig.2 Genetic relationship of Chinese BtMV with that of other countries

2.3 我國(guó)甜菜花葉病毒與其它馬鈴薯Y病毒屬家族的系統(tǒng)進(jìn)化分析

甜菜花葉病毒與花生斑駁病毒編碼多肽的同源性達(dá)55%[同8]，為了明確甜菜花葉病毒與同屬馬鈴薯Y病毒屬家族的進(jìn)化關(guān)系，本文通過(guò)NCBI對(duì)BtMV進(jìn)行了目標(biāo)性的BLSTp分析，從中選取了21個(gè)經(jīng)Blast比對(duì)后高度同源的序列（詳見(jiàn)表1），將其相對(duì)應(yīng)的種作為外類(lèi)群，構(gòu)建了甜菜花葉病毒的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。

圖3是經(jīng)BioEdit軟件完成的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，該進(jìn)化樹(shù)顯示以上22種病毒分屬于三大族：芋花葉病毒NC003537、西葫蘆黃花葉病毒NC003224、菜豆壞死病毒NC004047、豇豆蚜傳花葉病毒NC004013、東亞西番蓮病毒AB690452、豹紋蝶Y病毒NC010954、紫藤脈花葉病毒NC007216、大豆花葉病毒NC002634、西瓜花葉病毒NC006262、菜豆普通花葉病毒NC003397、花生條紋矮化病毒PSU34972和魚(yú)腥草花葉病毒NC009742為一族。其中豹紋蝶Y病毒NC010954、紫藤脈花葉病毒NC007216、大豆花葉病毒NC002634高度近緣；第二族由甜菜組（圖中橢圓內(nèi)區(qū)域）與落葵皺紋花葉病毒NC009741以及和平蓮花葉病毒NC009743和花生斑駁病毒NC002600、香雪蘭花葉病毒NC014064組成，落葵皺紋花葉病毒與和平蓮花葉病毒高度同緣，花生斑駁病毒和香雪蘭花葉病毒近緣；第三族包括香蕉苞片花葉病毒NC009745；洋蔥黃矮病毒NC005029；菜豆黃花葉病毒BYU47033；辣椒斑駁病毒NC001517和蕪菁花葉病毒NC002509。其中辣椒斑駁病毒和蕪菁花葉病毒相對(duì)近緣。

表1 用于多序列比對(duì)的其它馬鈴薯Y病毒屬及序列[10-25]

從圖3中可以看出，甜菜花葉病毒組與落葵皺紋花葉病毒以及和平蓮花葉病毒處于同一支脈，說(shuō)明甜菜花葉病毒與落葵皺紋花葉病毒、和平蓮花葉病毒較近緣。另花生斑駁病毒和香雪蘭花葉病毒與甜菜花葉病毒、落葵皺紋花葉病毒及和平蓮花葉病毒同處一族。

為進(jìn)一步明確甜菜花葉病毒（DQ674264）與落葵皺紋花葉病毒（NC009741）以及和平蓮花葉病毒（NC009743）和花生斑駁病毒（NC002600）、香雪蘭花葉病毒（NC014064）的結(jié)構(gòu)域相似性，采用BioEdit軟件對(duì)5條蛋白質(zhì)序列進(jìn)行了比對(duì)分析，經(jīng)過(guò)氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，甜菜花葉病毒與其他病毒的主要氨基酸差異在CP功能域，P3功能域序列相似度最高，不同病毒功能域的異同可以為抗不同病毒的基因工程操作提供思路。

3 討論

病毒普遍存在于作物生產(chǎn)環(huán)境之中。截至2012年，國(guó)際病毒分類(lèi)委員會(huì)（ICTV）報(bào)告了2619種病毒（ICTV Master Species List，2012 v2）[26]。甜菜花葉病毒是危害甜菜的世界性病害之一，寄主植物中的抗性機(jī)制取決于在基因相互作用中發(fā)揮作用的不相容基因，包括從寄主中獲得的抗性（R）基因產(chǎn)物，以及從病原體中獲得的相應(yīng)的無(wú)毒基因產(chǎn)物。病毒外殼蛋白（CP）參與病毒生物學(xué)的多個(gè)方面，包括：衣殼化，病毒復(fù)制，細(xì)胞間或系統(tǒng)運(yùn)動(dòng)，以及介體傳播和癥狀發(fā)展[27]。通過(guò)對(duì)甜菜花葉病毒蛋白保守的結(jié)構(gòu)功能區(qū)的分析，鋅指蛋白和PTK結(jié)構(gòu)域、FRNK結(jié)構(gòu)域的功能認(rèn)知，CI蛋白R(shí)NA解旋酶的功能認(rèn)知，以及依賴(lài)于RNA聚合酶的RNA活性位點(diǎn)分析，可為抗病毒的基因工程操作提供借鑒和指導(dǎo)。同時(shí)，研究甜菜花葉病毒的基因序列及其發(fā)育與進(jìn)化，對(duì)發(fā)現(xiàn)和探求寄主植物的抗病性具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

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Comparison and Analysis of DNA Sequence of Beet Mosaic Virus(BtMV) from China and Other Members of Genus Potyvirus

DING Guang-zhou1,3,LI Yong-gang2,ZHAO Chun-lei1,3,WANG Xi1,3,ZHANG Yu-shuang1,3,LIU Na1,3, CHEN Li1,3,CHEN Lian-jiang1,3
(1.Sugar Beet Engineering Research Center of Heilongjiang Province/Heilongjiang University,Harbin 150080,China;2.College of Agriculture,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China;3.Sugar Beet Research Institute,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Harbin 150080,China）

In order to understand the basics of a beet mosaic virus,we have compared DNA sequences of Beet mosaic virus(BtMV)endemic in China with those isolated from the US and Slovakia,including other virus belonging to genus potyvirus.The full-length sequence of BtMV isolated from China consists of 9,591bp,with encoding 3,085 amino acids,containing highly conserved functional domain of potyvirus.The polyprotein of BtMV isolated from China gives rise to ten proteins(P1,HC-pro,P3,6K1,CI,6K2,VPg,NIa,NIb and CP),and cleavage sites of each protein were compared with those of other known potyviruses.Phylogenetic tree of the polyprotein revealed that BtMV-china was the most close to BaRMV and PeLMV,and was related to PeMoV and FreMV.

beet mosaic virus;potyviruses;phylogeny

S435.663

A

1007－2624（2015）06－0001－04

10.13570/j.cnki.scc.2015.06.001

2015-06-10

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目“甜菜花葉病不親和基因的克隆及抗病反應(yīng)機(jī)制和遺傳研究”(31171604)；本研究另由“中國(guó)博士后科學(xué)基金資助項(xiàng)目”（2012M520781）資助；黑龍江省博士后基金資助。

丁廣洲（1972-），男，博士，副研究員，從事甜菜抗病遺傳學(xué)與分子生物學(xué)研究。E-mail：dgz@hlju.edu.cn

陳連江（1957-），男，研究員，所長(zhǎng)，主要從事甜菜遺傳育種、栽培研究。E-mail：chen4004@163.com