孟亮 高遠(yuǎn) 陳賓 馬堅 劉永 王微 趙雅琳

壞死細(xì)胞對周圍正常血管平滑肌細(xì)胞增殖遷移的影響及作用機(jī)制研究

孟亮 高遠(yuǎn) 陳賓 馬堅 劉永 王微 趙雅琳

目的觀察壞死的血管平滑肌細(xì)胞對周圍正常細(xì)胞增殖和遷移能力的影響，同時探討其可能的作用機(jī)制。方法采用無血清無糖低氧條件制備血管平滑肌細(xì)胞壞死模型，收集壞死細(xì)胞培養(yǎng)上清液干預(yù)正常細(xì)胞。實驗設(shè)置無血清低糖DMEM培養(yǎng)的對照組、壞死上清（NCS）干預(yù)組、壞死上清與IL-1拮抗劑聯(lián)合干預(yù)組、壞死上清與IL-6拮抗劑聯(lián)合干預(yù)組、IL-1α干預(yù)組以及IL-6干預(yù)組。CCK-8方法檢測細(xì)胞增殖能力變化，Transwell方法檢測細(xì)胞遷移能力變化，RT-PCR方法檢測各組細(xì)胞中IL-6和CRPmRNA表達(dá)情況，Western blot方法檢測各組細(xì)胞CRP、Akt、p-Akt蛋白的表達(dá)。結(jié)果與對照組相比，NCS組、IL-1α組和IL-6組細(xì)胞的增殖能力和遷移能力均顯著性增加（P＜0.05），同時，NCS和IL-1α組血管平滑肌細(xì)胞IL-6表達(dá)升高（P＜0.05），NCS組、IL-1α組和IL-6組細(xì)胞CRP和p-Akt的表達(dá)也呈增加趨勢（P＜0.05）；而NCS+IL-1 RA組和NCS+IL-6 RA組細(xì)胞增殖、遷移能力較NCS組有所下降（P＜0.05），CRP和p-Akt的表達(dá)也相應(yīng)有所降低（P＜0.05）。結(jié)論壞死的血管平滑肌細(xì)胞可能通過釋放IL-1α促進(jìn)周圍正常細(xì)胞IL-6的表達(dá)，進(jìn)而上調(diào)CRP和p-Akt的表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖遷移。

血管平滑肌細(xì)胞壞死增殖遷移

doi∶10.3969/j.issn.1673-0364.2015.02.012

血管重塑性疾病包括高血壓、動脈粥樣硬化、血管術(shù)后再狹窄等，是血管為適應(yīng)體內(nèi)外環(huán)境變化而發(fā)生的形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能改變，包括細(xì)胞增殖、遷移、凋亡和基質(zhì)的合成、降解等一系列動態(tài)變化[1]。血管平滑肌細(xì)胞（Vascular smoothmuscle cell，VSMC）是動脈壁的主要成分，位于血管中膜，缺血、缺氧和機(jī)械損傷等均可引起VSMC損傷、凋亡和壞死，壞死的VSMC可釋放多種細(xì)胞因子及表面活性物質(zhì)，激活VSMC表面受體，使VSMC由成熟的、靜止的、具有收縮性質(zhì)的收縮表型轉(zhuǎn)變成未成熟的、具有增殖和遷移能力的分泌表型，使其異常增殖并向內(nèi)膜下遷移，這是血管重塑性疾病的病理基礎(chǔ)[2-4]。我們的前期研究表明，經(jīng)氧糖剝奪處理的壞死VSMC上清液中白細(xì)胞介素1（interleukin-1，IL-1）含量顯著性增加，收集此條件培養(yǎng)液干預(yù)正常VSMC，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的增殖和遷移能力均有所增強(qiáng)[5]，但其作用機(jī)制尚未明確。本研究旨在探討壞死VSMC上清液對正常VSMC增殖、遷移能力的影響，并進(jìn)一步探討其促炎和促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移的作用機(jī)制，以期為血管重塑性疾病的恢復(fù)及治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株與試劑

人主動脈平滑肌細(xì)胞（上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所），IL-1α和IL-6（R&D公司），IL-1RA（Imgenex公司），IL-6RA（Sigma公司），CCK-8檢測試劑盒（碧云天生物工程研究所），Transwell小室和Matrigel（BD公司），CRP、Akt、p-Akt抗體（Santa Cruz公司），低糖DMEM培養(yǎng)液和胎牛血清（Hyclone公司），總RNA提取試劑盒、TIAN Script cDNA第一鏈合成試劑盒購自（北京天根生化科技有限公司），引物委托生工生物（上海）有限公司合成，其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及實驗分組

將人主動脈血管平滑肌細(xì)胞接種于含有10%胎牛血清、100 U/m L青霉素、100μg/m L鏈霉素的低糖DMEM培養(yǎng)液中，在37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)。2~3 d更換一次培養(yǎng)液，待細(xì)胞生長至80%~90%融合時進(jìn)行消化傳代。實驗設(shè)置無血清低糖DMEM培養(yǎng)對照組（Control）、壞死血管平滑肌細(xì)胞上清條件培養(yǎng)液組（NCS）、NCS條件培養(yǎng)液聯(lián)合IL-1受體拮抗劑干預(yù)組（NCS+IL-1 RA）、NCS條件培養(yǎng)液聯(lián)合IL-6受體拮抗劑干預(yù)組（NCS+IL-6 RA）、添加30μg/mL IL-1α干預(yù)組（IL-1α）以及添加150 ng/mL IL-6干預(yù)組（IL-6）。

1.3 NCS條件培養(yǎng)液的制備

[5]的方法，使用前將無血清無糖培養(yǎng)基通入5%CO2、10%H2、85%N2混合氣體飽和15min，即制成無血清無糖低氧溶液。將對數(shù)生長期的VSMCs換液為此條件溶液后，置于含5%CO2、10% H2、85%N2混合氣體的厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h后離心收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，即為NCS條件培養(yǎng)液。

1.4 CCK-8方法檢測細(xì)胞增殖

將細(xì)胞接種至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，加入上述實驗分組中不同的條件培養(yǎng)液培養(yǎng)1 d、2 d、3 d、4 d、5 d后，每孔加入10μL CCK-8試劑孵育，測定其在450 nm處的吸光度值，每組設(shè)置5個復(fù)孔。

1.5 Transwell方法檢測各組細(xì)胞遷移能力

4℃過夜解凍Matrigel，用無血清DMEM按1∶9稀釋后，包被于Transwell小室膜上，將小室放入24孔板，用無血清培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度至1×106cells/mL，取細(xì)胞懸液100μL接種至上室，下室中分別加入各組細(xì)胞培養(yǎng)液500μL，每組重復(fù)5次，置于37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)48 h后取出小室。用棉簽擦去未遷移的細(xì)胞后，將小室置于40 mL/L甲醛中固定15 min，自然晾干后蘇木素染色5 min，蒸餾水沖洗，倒置顯微鏡下（200×）計數(shù)遷移至微孔膜下層的細(xì)胞。每樣本選取3個視野計數(shù)，取均數(shù)。

1.6 RT-PCR方法檢測IL-6、CRPmRNA表達(dá)

TRIzol法提取各組細(xì)胞的總RNA，按照cDNA第一鏈合成試劑盒說明書中的方法，將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以管家基因β-actin為內(nèi)參，進(jìn)行PCR反應(yīng)。IL-6的上、下游引物序列為：5'-AATAACCACCCCTGACCCAAC-3'，5'-CCAGAAGAAGGAATGCCCATT-3'，擴(kuò)增片段長度為198 bp；CRP的上、下游引物序列為：5'-GACATCTTCTTGCTGCTGGA-3'，5'-CAGTTTGGCTTCTGTCCTCA-3'，擴(kuò)增片段長度為110 bp；β-actin的上、下游引物序列為：5'-CTTAGTTGCGTTACACCCTTTCTTG-3'，5'-CTGTCAC CTTCACCGTTCCAGTTT-3'，擴(kuò)增片段長度為156 bp。參照2×Taq PCRMasterMix試劑盒說明書，在200μL反應(yīng)管中加入cDNA模板2μL，上下游引物各1μL，2×Taq PCR Master-mix 10μL，最后加入ddH2O補(bǔ)足總體積至20μL。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性20 sec，60℃退火20 sec，72℃延伸30 sec，共30個循環(huán)，最后72℃延伸5 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后于1.5%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，利用凝膠成像系統(tǒng)，將圖片掃描入電腦并進(jìn)行灰度分析。

1.7 Western blot方法檢測CRP、Akt、p-Akt的表達(dá)

采用RIPA裂解液提取總蛋白，BCA法定量蛋白，取40μg蛋白加入上樣緩沖液混勻，煮沸變性后進(jìn)行SDS-PAGE。電泳結(jié)束后電轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗CRP（1∶100）、Akt（1∶100）、p-Akt（1∶100），4℃孵育過夜。TTBS洗膜，加入1∶5 000辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗37℃孵育45min。洗膜后加入ECL發(fā)光液反應(yīng)5min，在暗室中曝光顯影，曝光后剝脫抗體，加入β-actin內(nèi)參抗體孵育（1∶10 000），同樣方法曝光顯影。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，各組數(shù)據(jù)以表示，組間比較采用t檢驗，P＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞增殖能力檢測

CCK-8方法檢測細(xì)胞增殖能力結(jié)果顯示，與對照組相比，NCS組、IL-1α組和IL-6組細(xì)胞增殖能力有所增加（P＜0.05），在NCS培養(yǎng)液中添加IL-1 RA和IL-6 RA可降低NCS引起的細(xì)胞增殖（P＜0.05），使細(xì)胞增殖能力降至對照組水平（圖1）。

圖1 細(xì)胞增殖能力檢測（±s，n=5）Fig.1 Detection of proliferation of VSM Cs(±s,n=5)

2.2 細(xì)胞遷移能力檢測

Transwell檢測結(jié)果示，與對照組相比，NCS組、IL-1α組和IL-6組細(xì)胞遷移數(shù)均有所增加（P＜0.05），而NCS+IL-1 RA組和NCS+IL-6 RA組同NCS組相比細(xì)胞遷移數(shù)目下降（P＜0.05）（圖2、3）。

圖2 細(xì)胞遷移能力檢測（±s，n=3）Fig.2 Detection ofm igration of VSMCs±s,n=3)

圖3 各組細(xì)胞遷移能力比較Fig.3 Comparison ofm igration of VSMCs in each group

2.3 IL-6、CRPmRNA表達(dá)情況

RT-PCR結(jié)果顯示，NCS組、IL-1α組細(xì)胞IL-6和CRPmRNA表達(dá)均有所增加（P＜0.05），IL-6組細(xì)胞CRPmRNA表達(dá)也增加（P＜0.05）。而NCS+IL-1 RA組細(xì)胞IL-6表達(dá)較NCS組有所下降，NCS+IL-1 RA組和NCS+IL-6 RA組細(xì)胞CRPmRNA表達(dá)較NCS組均有所降低，說明壞死上清培養(yǎng)液可通過IL-1α促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞IL-6表達(dá)上調(diào)，從而促進(jìn)CRP的表達(dá)（圖4）。

圖4 各組細(xì)胞IL-6和CRPm RNA表達(dá)情況（±s，n=3）Fig.4 Them RNA expression of IL-6 and CRP in VSMCs (s,n=3)

圖5 CRP、Akt、p-Akt蛋白表達(dá)（±s，n=3）Fig.5 The expression of CRP,Akt and p-Akt in VSMCs (±s,n=3)

2.4 CRP、Akt、p-Akt蛋白表達(dá)情況

Western blot方法檢測CRP、Akt、p-Akt的蛋白表達(dá)，實驗結(jié)果顯示，NCS組、IL-1α組和IL-6組的CRP和p-Akt蛋白表達(dá)均顯著高于對照組（P＜0.05），而NCS+IL-1 RA和NCS+IL-6 RA組中的CRP和p-Akt蛋白表達(dá)與NCS組比較則有所降低，說明壞死上清液通過IL-1α上調(diào)IL-6的表達(dá)，從而增加CRP的表達(dá)及Akt的磷酸化水平（圖5）。

3 討論

VSMC存在兩種不同的表型，即收縮型和合成型，收縮型在神經(jīng)及激素的影響下可調(diào)節(jié)血管壁張力、維持組織的血流量，而合成型VSMC參與血管壁的形成和損傷修復(fù)，能夠在生長因子的刺激下分裂和增殖，血管壁受損后，中層VSMC的增殖平衡受到破壞，反應(yīng)性的遷移、增殖并分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)，導(dǎo)致DNA合成及細(xì)胞分裂，從而形成肥厚的新生內(nèi)膜，是血管重塑性疾病的關(guān)鍵因素[6]。已有研究表明，血管壁的慢性和急性損傷能夠誘導(dǎo)多種生長因子和炎癥細(xì)胞因子表達(dá)，通過不同的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑促進(jìn)與增殖、遷移相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致VSMC的增殖和遷移[7]。

IL-1由單核-巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞以及VSMC等分泌產(chǎn)生，作為一種重要的促炎因子能夠調(diào)控多種炎癥因子和生長因子的表達(dá)[8]。IL-1與血管重塑性疾病密切相關(guān)，敲除IL-1受體的小鼠和野生型小鼠相比較，其主動脈粥樣硬化斑塊體積和腦梗死體積均有所縮小，腦梗死后殘存的神經(jīng)元數(shù)量較多，神經(jīng)功能受損程度較低[9]。同時，IL-1受體在腦組織缺血損傷后有重要的神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)[10]。本實驗結(jié)果表明，在壞死VSMC培養(yǎng)上清液的誘導(dǎo)下，正常VSMC的增殖、遷移能力顯著增強(qiáng)；同時，細(xì)胞內(nèi)IL-6mRNA表達(dá)水平有所增加，加入IL-1拮抗劑和IL-6拮抗劑后，細(xì)胞的增殖、遷移能力下降，而單獨添加IL-1α和IL-6均可提高細(xì)胞增殖、遷移能力，說明壞死VSMC上清液可能通過IL-1α促進(jìn)正常細(xì)胞IL-6表達(dá)，從而導(dǎo)致細(xì)胞增殖、遷移。

C反應(yīng)蛋白（C-reaction protein，CRP）是機(jī)體非特異性免疫機(jī)制的一部分，可與C-多糖結(jié)合，在Ca2+存在時可結(jié)合細(xì)胞膜上磷酸膽堿，激活補(bǔ)體的經(jīng)典途徑，增強(qiáng)白細(xì)胞吞噬作用，調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞或單核-巨噬細(xì)胞功能，促進(jìn)巨噬細(xì)胞組織因子的生成。CRP是心血管疾病預(yù)后的敏感預(yù)測指標(biāo)，同時與血管重塑性疾病密切相關(guān)[11]。研究表明，動脈粥樣硬化的血管損傷部位、動脈瘤組織和病變的冠狀動脈靜脈移植物均能產(chǎn)生CRP[12-14]。PI3K/Akt是調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、遷移的重要信號通路，同時，CRP與PI3K/Akt信號通路密切相關(guān)[15]，PI3K/Akt可參與CRP誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞增殖[16-17]。本研究結(jié)果顯示，NCS組、IL-1α組和IL-6組細(xì)胞中CRP和p-Akt的蛋白表達(dá)均顯著升高，而添加壞死細(xì)胞上清液聯(lián)合IL-1拮抗劑和IL-6拮抗劑進(jìn)行干預(yù)處理后，VSMC中CRP和p-Akt的蛋白表達(dá)與NCS組比較出現(xiàn)下降，說明壞死的VSMC可能通過釋放IL-1而促進(jìn)IL-6表達(dá)，進(jìn)一步上調(diào)CRP的表達(dá)和Akt磷酸化水平，促進(jìn)周圍正常VSMC的增殖與遷移。

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Effectof Necrotic Cells on Proliferation and M igration of Surrounding Normal Vascular Smooth M uscle Cells and the Underlying Mechanisms

MENG Liang1,GAO Yuan2,CHEN Bin3,MA Jian4,LIU Yong1,WANG Wei1,ZHAO Yalin1.1 Fengtian hospital,Shenyang medical college,Shenyang 110024,China;2 The First Hospital of China Medical University, Shenyang 110001,China;3 Shenyang The Fourth Hospital of People,Shenyang 110031,China;4 Shenyangmedical college, Shenyang110034,China.Correspondingauthor:MENGLiang(E-mail:wzxyyc@163.com).

Objective To observe the effectofnecrotic vascular smoothmuscle cells(VSMCs)on proliferation and migration of surrounding normal cells and to explore the possiblemechanism.M ethods VSMCswas cultured in oxygen-and glucose deprived medium and the supernatantwas collected to intervene normally growing cells.The control group,NCS group,NCS+ IL-1 RA group,NCS+IL-6 RA group,IL-1αgroup and IL-6 group were set in this experiment.CCK-8 and Transwell assays were used to determ ine the proliferation andm igration of VSMCs.ThemRNA expression of IL-6 and CRPwere detected by RTPCR,and the protein expression of CRP,Aktand p-Aktwere evaluated byWestern blot.Results Compared with the control group,the proliferation and migration ability of NCSgroup,IL-1αgroup and IL-6 group were significantly higher than that in the controlgroup(P＜0.05).Meanwhile,the expression of IL-6 were obviously increased in NCSgroup and IL-1αgroup(P＜0.05), and theexpression ofCRPand p-Aktwerealsoelevated in the threegroups(P＜0.05).Otherwise,the proliferation andmigration ability of NCS+IL-1 RA group and NCS+IL-6 RA group were decreased and the expression of CRP and p-Akt were also declined(P＜0.05).Conclusion Necrotic vascular smooth muscle cellsmay promoting the proliferation and migration of surroundingnormal cellsby inducing theexpression of IL-6 and upregulating theexpression ofCRPand p-Akt.

Vascular smoothmuscle cells;Necrosis;Proliferation,Migration

Q813.1+1

A

1673－0364（2015）02－0095－05

2015年1月9日；

2015年3月14日）

遼寧省科學(xué)技術(shù)計劃項目（2011225020）。

110024遼寧省沈陽市沈陽醫(yī)學(xué)院奉天醫(yī)院（孟亮，劉永，王微，趙雅琳）；110001遼寧省沈陽市中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院（高遠(yuǎn)）；110031遼寧省沈陽市沈陽市第四人民醫(yī)院（陳賓）；110034遼寧省沈陽市沈陽醫(yī)學(xué)院（馬堅）。

孟亮（E-mail：wzxyyc@163.com）。