王莉爽++陳文++譚清群++吳石平++袁潔

摘要 根據(jù)已報(bào)道的黃瓜花葉病毒（CMV）外殼蛋白（CP）基因序列合成1對引物，對侵染煙草的黃瓜花葉病毒貴州分離物的病毒外殼蛋白基因進(jìn)行基因擴(kuò)增和序列分析。結(jié)果表明：40個CMV貴州分離物和CMV株系亞組ⅠB系列CP基因核苷酸相似性為95.1%～100.0%，與CMV株系亞組ⅠA系列CP基因核苷酸相似性為92.3%～98.2%，亞組ⅡCP基因核苷酸相似性為78.2%～80.5%。表明貴州CMV分離物與CMV株系亞組ⅠB系列同源性關(guān)系更密切，因而它們都屬于CMV株系亞組ⅠB系列。

關(guān)鍵詞 煙草；黃瓜花葉病毒；株系分化

中圖分類號 S432.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-5739（2015）17-0141-02

黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）是雀麥花葉病毒科（Bromoviridae）黃瓜花葉病毒屬（Cucumovirus）的典型成員，在全球均有分布[1-2]。CMV由60多種蚜蟲非持久性傳播，能侵染85科365屬1 000多種單子葉、雙子葉、木本及草本植物[3]。CMV株系變異較多，世界上報(bào)道的有100多個株系。Palukaitis等根據(jù)寄主范圍、癥狀反應(yīng)、血清學(xué)以及CP序列差異將CMV分為亞組Ⅰ和亞組Ⅱ[4]。Roossinck等基于基因組RNA3的5′端的非編碼區(qū)序列將亞組Ⅰ進(jìn)一步分為亞組ⅠA和亞組ⅠB[5]。CMV劃分亞組和株系的方法很多，其中分子生物學(xué)方法的CP基因同源性分析比較是研究黃瓜花葉病毒亞組鑒定和株系劃分最根本、最可靠的方法。由于CMV是生產(chǎn)上侵染煙草的重要病害之一，嚴(yán)重地影響煙葉的產(chǎn)量和質(zhì)量。

本研究對貴州省煙草不同主產(chǎn)區(qū)中侵染煙草的CMV分離物CP基因進(jìn)行了序列比較，確定貴州CMV分離物所屬亞組，為抗病育種、品種引進(jìn)等研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)樣品。煙草病毒材料為2013—2014年在興義、興仁、威寧、福泉、道真等20個縣市40個鄉(xiāng)鎮(zhèn)采集并檢測出的黃瓜花葉病毒陽性樣品（表1）。

1.1.2 引物合成。參考相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的黃瓜花葉病毒外殼蛋白基因序列引物[6]，該引物由上海生物公司合成，序列為：CMV-F：ATGGACAAATCTGAATCAACC，CMV-R：TAAGCTGG ATGGACAACCCGT。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 血清學(xué)檢測。疑似樣品粗汁液用美國Agdia公司的DAS-ELISA檢測試劑盒進(jìn)行檢測，檢測方法參照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.2 病毒RNA的提取。采用柱式病毒提取試劑盒（上海生物工程公司生產(chǎn)）提取煙草病毒RNA。

1.2.3 cDNA合成及PCR擴(kuò)增。采用RT-PCR兩步法對PVY的P1基因序列和CP基因序列進(jìn)行擴(kuò)增。第1鏈cDNA合成反應(yīng)體系體積為20 μL，其中，RNA 2 μL，下游引物1 μL，5×RT Buffer 4 μL，10 mmol/L dNTP 2 μL，40 U/μL RNase Inhibitor 1 μL，M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶1 μL，加ddH2O至20 μL。反應(yīng)條件：65 ℃ 5 min，迅速插入冰上5 min，42 ℃延伸60 min。

PCR反應(yīng)體系：10×PCR Buffer 5 μL，2.5 mmol/L dNTP 1 μL，10 mmol/L正反向引物各1 μL，Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.5 μL，cDNA 5 μL，補(bǔ)加滅菌的ddH2O至50 μL。反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性2 min后開始以下循環(huán)：94 ℃變性1 min，55 ℃ 退火 30 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后，72 ℃延伸10 min，4 ℃ 保存。反應(yīng)結(jié)束后取2 μL PCR產(chǎn)物于1%的瓊脂糖凝膠電泳中檢測擴(kuò)增結(jié)果。

1.2.4 克隆與測序。RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)DNA回收試劑盒連接到載體，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a，涂布于含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上，篩選陽性克隆，送上海生物工程公司進(jìn)行雙向測序。

1.2.5 核苷酸序列分析。利用DNAman Version 5.0軟件進(jìn)行序列拼接和分析；以獲得的CP基因序列為基礎(chǔ)，用Mega5.0程序 的鄰近連接法（Neighbor-Joining，NJ）構(gòu)建TMV病毒CP基因組序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹，其各分支的可信度用Bootstrap檢測（1 000次重復(fù)）。用于CP基因比較和分析的TMV病毒及其序列登錄號如表2所示。

2 結(jié)果與分析

2.1 血清學(xué)檢測結(jié)果

145份煙草病毒病疑似病標(biāo)樣經(jīng)DAS-ELISA檢測，共檢出86份CMV陽性樣品。

2.2 RT-PCR擴(kuò)增

選出具有地方代表性的CMV分離物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，40個黃瓜花葉病毒貴州分離物均擴(kuò)增出約780 bp預(yù)期目的片段，沒有其他非特異性DNA條帶。

2.3 序列測定與分析

用DNAman Version 5.0對40個CMV貴州分離物CP基因進(jìn)行序列比對和分析，結(jié)果顯示：CMV貴州分離物和CMV株系亞組ⅠB系列CP基因核苷酸相似性為95.1%～100.0%，氨基酸同源性為94.6%～100.0%；與CMV株系亞組ⅠA系列CP基因核苷酸相似性為92.3%～98.2%，氨基酸同源性為93.3%～97.7%；亞組ⅡCP基因核苷酸相似性為78.2%～80.5%，氨基酸同源性為76.5%～78.8%。表明貴州CMV分離物與CMV株系亞組ⅠB系列同源性關(guān)系更密切，因而它們都屬于CMV株系亞組ⅠB系列。從構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹可知（圖1），40個貴州CMV分離物聚在一起與CMV株系亞組IB系列聚為一個大支，說明與亞組ⅠB系列親緣關(guān)系較近；CMV株系亞組ⅠA系列單獨(dú)聚為一支；CMV株系亞組Ⅱ單獨(dú)為一支，且與CMV分離物離的最遠(yuǎn)，說明CMV分離物與亞組Ⅱ的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。40條貴州CMV CP基因序列分為兩大支，遵義地區(qū)、銅仁地區(qū)、貴陽地區(qū)、黔東南州和黔西南州的縣市34條CMV分離物聚為第一大支；黔南州6條CMV分離物聚為第二大支。但是在第一大支中施秉、黃平、遵義、湄潭、印江、思南和威寧聚為一個亞支；興義、興仁、盤縣、貴陽、開陽和安順聚為一個亞支；平壩、赫章、黔西和大方聚為一個亞支，分為2個小亞支，平壩單獨(dú)為一個小亞支，其余3個縣的CMV分離物為另一個小亞支。說明貴州CMV分離物在不同的區(qū)域存在一定的差異。endprint

3 結(jié)論與討論

研究結(jié)果表明：40條貴州CMV分離物CP基因與CMV株系亞組ⅠB CP基因的核苷酸相似性和氨基酸同源性均較高，因此貴州CMV分離物屬于CMV株系亞組ⅠB系列。本試驗(yàn)結(jié)果與山東、新疆石河子、伊寧地區(qū)的黃瓜花葉病毒株系分化結(jié)果相符[7]。但是貴州CMV分離物中沒有發(fā)現(xiàn)CMV株系亞組Ⅱ，然而劉 勇等報(bào)道的云南、福建和湖南采集的64個CMV陽性樣品中，屬亞組Ⅰ的樣品為57個，占89.1%；屬亞組Ⅱ的樣品為10個，占15.6%；其中3個樣品為亞組Ⅰ和亞組Ⅱ的復(fù)合侵染[8]。說明相鄰省份間CMV的株系存在一定的差異，也可能是沒有采集到CMV株系亞組Ⅱ的黃瓜花葉病毒樣品，這有待于開展進(jìn)一步的研究。

4 參考文獻(xiàn)

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