二甲雙胍對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖及miR-21-5p和PDCD4表達(dá)的影響

江萌 馬偉元 孫青

二甲雙胍對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖及miR-21-5p和PDCD4表達(dá)的影響

江萌 馬偉元 孫青

目的 探討二甲雙胍對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞增殖的影響及其可能的作用機(jī)制。方法 以HaCaT細(xì)胞為研究對(duì)象，分別給予不同濃度二甲雙胍（25、50、75、100 mmol/L）刺激24 h，CCK8法檢測(cè)HaCaT細(xì)胞增殖活性；實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)HaCaT細(xì)胞中miR-21-5p及其下游靶基因PDCD4 mRNA表達(dá)水平；蛋白免疫印跡法檢測(cè)HaCaT細(xì)胞中PDCD4蛋白表達(dá)水平。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。結(jié)果二甲雙胍可抑制HaCaT細(xì)胞增殖，25、50、75、100 mmol/L二甲雙胍作用于HaCaT細(xì)胞24 h后，細(xì)胞抑制率分別為5.43%±3.67%、19.61%±6.95%、45.93%±9.56%、61.91%±6.93%，各組細(xì)胞抑制率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=246.90，P<0.05）；25 mmol/L組與對(duì)照組（0.00%±3.00%）相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其余各組抑制率均較對(duì)照組顯著增高（P<0.05）；實(shí)驗(yàn)組不同濃度組間比較，差異也均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。25、50、75、100 mmol/L 二甲雙胍實(shí)驗(yàn)組miR-21-5p mRNA相對(duì)表達(dá)量（2-ΔΔCt）分別為0.90±0.11、0.33±0.05、0.21±0.07、0.14±0.04，PDCD4 mRNA相對(duì)表達(dá)量（2-ΔΔCt）分別為2.11±0.64、7.22±1.13、11.16±1.23、19.12±3.16，各組細(xì)胞miR-21-5p mRNA和PDCD4 mRNA的表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F值分別為36.99和96.26，均P<0.05）；25 mmol/L組與對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其余各組miR-21-5p及PDCD4 mRNA的表達(dá)均較對(duì)照組顯著下調(diào)或上調(diào)（均P<0.05）；實(shí)驗(yàn)組不同濃度組間比較，差異也均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與對(duì)照組相比，25、50、75、100 mmol/L二甲雙胍實(shí)驗(yàn)組PDCD4蛋白表達(dá)明顯升高，其相對(duì)表達(dá)量分別為1.22±0.08、2.09±0.20、2.26±0.11、2.37±0.07，組間表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=75.37，P<0.05）。25 mmol/L組與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其余各組均較對(duì)照組明顯升高（P<0.01）。結(jié)論 二甲雙胍在體外能夠顯著抑制HaCaT細(xì)胞的增殖，可能通過(guò)下調(diào)miR-21-5p的表達(dá)，使其下游靶基因PDCD4表達(dá)上調(diào)，從而發(fā)揮抑制細(xì)胞增殖的作用。

角蛋白細(xì)胞；二甲雙胍；銀屑??；細(xì)胞增殖；miR-21-5p；PDCD4；HaCaT細(xì)胞

二甲雙胍（metformin）作為一種胰島素增敏劑，是臨床治療2型糖尿病的一線藥物［1］。近年來(lái)體外研究證實(shí)，二甲雙胍可顯著抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖［2-5］，但其對(duì)皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞的作用尚不清楚。miR-21-5p及其下游靶基因PDCD4（programmed cell death 4）在多種腫瘤中存在異常表達(dá)［6］。在角質(zhì)形成細(xì)胞異常增殖性疾病如銀屑病中，其皮損內(nèi)miR-21-5p的表達(dá)也顯著上調(diào)［7］。然而關(guān)于二甲雙胍對(duì)miR-21-5p與PDCD4在角質(zhì)形成細(xì)胞中表達(dá)的影響及兩者之間的相互關(guān)系，目前國(guó)內(nèi)外鮮有報(bào)道。本研究以HaCaT細(xì)胞為研究對(duì)象，通過(guò)探討二甲雙胍對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖及miR-21-5p和PDCD4表達(dá)的影響，為二甲雙胍在角質(zhì)形成細(xì)胞異常增殖性疾病中的應(yīng)用提供一定的理論支持。

一、材料

1.細(xì)胞株：HaCaT細(xì)胞（美國(guó)ATCC公司），由本實(shí)驗(yàn)室-70℃凍存。

2.主要試劑：0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化液、DMEM高糖培養(yǎng)液、胎牛血清（美國(guó)Gibco公司）；CCK8試劑盒（日本同仁化學(xué)研究所）；一步法反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒（瑞士Roche公司）；miRNA qRT-PCR檢測(cè)試劑盒（廣州復(fù)能基因有限公司）；二甲雙胍（美國(guó)Sigma公司）；Trizol試劑（美國(guó)Invitrogen公司）；DEPC及無(wú)RNA酶水（北京索萊寶生物技術(shù)公司）；氯仿、異丙醇、無(wú)水乙醇等均為分析純（國(guó)藥集團(tuán)上海試劑公司）。BCA蛋白定量試劑盒、RIPA裂解液（強(qiáng)）、PVDF膜、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（碧云天生物技術(shù)公司）；兔抗人PDCD4多克隆抗體（英國(guó)Abcam公司）；鼠抗β肌動(dòng)蛋白單克隆抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG以及山羊抗鼠IgG（美國(guó)Santa Cruz公司）。

二、方法

1.CCK8法檢測(cè)二甲雙胍對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖的影響：將HaCaT細(xì)胞穩(wěn)定傳代3次后分組，①對(duì)照組：未加二甲雙胍刺激；②實(shí)驗(yàn)組：分 4 組，分別加入 25、50、75、100 mmol/L 二甲雙胍。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HaCaT細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化后，以密度為2×104/ml接種到96孔板上，每孔100μl，每組處理因素設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置空白組，即培養(yǎng)基+CCK8試劑。待細(xì)胞貼壁長(zhǎng)至70%融合時(shí)用于實(shí)驗(yàn)，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)基，磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗2次，加入100μl含有不同濃度二甲雙胍的無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h進(jìn)行生長(zhǎng)同步化。之后每孔加入10μl CCK8溶液，在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育1 h，選擇450 nm波長(zhǎng)，在酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔吸光度（A值），實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值。細(xì)胞抑制率=［1-（實(shí)驗(yàn)組吸光度-空白組吸光度）/（對(duì)照組吸光度-空白組吸光度）］×100%。

2.實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)二甲雙胍刺激后HaCaT細(xì)胞中miR-21-5p及PDCD4 mRNA表達(dá)水平：25～100 mmol/L二甲雙胍刺激HaCaT細(xì)胞24 h后，按Trizol說(shuō)明書提取細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA的濃度及純度。cDNA的合成操作嚴(yán)格按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，miR-21-5p采用poly A加尾法反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)miR-21-5p mRNA表達(dá)水平，以U6作為內(nèi)參照，引物由廣州復(fù)能基因有限公司生產(chǎn)，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10min，95℃變性10 s，60℃退火 20 s，72℃延伸10 s，循環(huán)40次。檢測(cè)PDCD4 mRNA表達(dá)水平，以β肌動(dòng)蛋白作為內(nèi)參照，引物PDCD4及β肌動(dòng)蛋白由生工生物工程（上海）股份有限公司代為合成，引物序列PDCD4上游 5′-CCCGAGGGATTCTGAAGGAAG-3′，下游 5′-TCACCGGAAAAGAGAGAGTCAC-3′，β 肌動(dòng)蛋白上游 5′-AGTTGCGTTACACCCTTTC-3′，下游 5′-CCTTCACC GTTCCAGTTT-3′，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性 20 s，95 ℃變性 3 s，55℃退火30s，55℃延伸30s，循環(huán)40次。每個(gè)樣品重復(fù)3次，根據(jù)循環(huán)閾值（Ct值）計(jì)算miR-21-5p及PDCD4 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。計(jì)算公式：△Ct值=目的基因Ct值-內(nèi)參基因Ct值，△△Ct=△Ct實(shí)驗(yàn)-△Ct對(duì)照。以對(duì)照組目的基因表達(dá)量為1，2-△△Ct值即為實(shí)驗(yàn)組目的基因較對(duì)照組目的基因表達(dá)的倍數(shù)。

3.蛋白免疫印跡法檢測(cè)二甲雙胍刺激后HaCaT細(xì)胞中PDCD4 蛋白表達(dá)水平：25、50、75、100 mmol/L 二甲雙胍刺激HaCaT細(xì)胞24 h后，預(yù)冷的PBS沖洗2遍，加入RIPA裂解液于冰上裂解30min后，13 690×g離心10min；吸上清，BCA蛋白定量試劑盒檢測(cè)蛋白濃度后，加入6×上樣緩沖液混勻煮沸5min，取約40μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，電轉(zhuǎn)印至PVDF膜上；5%脫脂奶粉封閉2 h后，加入鼠抗β肌動(dòng)蛋白單克隆抗體（1∶1 000）、兔抗人PDCD4多克隆抗體（1∶2 000），4℃孵育過(guò)夜；洗膜3次，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG以及山羊抗鼠IgG（1∶5 000稀釋），室溫孵育1h，洗膜3次，ECL化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。所有目的蛋白條帶均以β肌動(dòng)蛋白為內(nèi)參進(jìn)行校正，圖像處理用Image J分析軟件進(jìn)行目的蛋白相對(duì)灰度值分析。

4.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以±s表示，多組數(shù)據(jù)之間的分析采用單因素方差分析（One-way ANOVA），兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

三、結(jié)果

1.二甲雙胍對(duì) HaCaT細(xì)胞增殖的影響：25、50、75、100 mmol/L二甲雙胍刺激HaCaT細(xì)胞24 h后，細(xì)胞抑制率分別為（5.43±3.67）%、（19.61±6.95）%、（45.93±9.56）%、（61.91±6.93）%，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=246.90，P＜0.05），25 mmol/L組與對(duì)照組（0.00%±3.00%）相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（q=1.49，P＞0.05），其余各組抑制率均較對(duì)照組顯著增高（q值分別為5.42、12.69、17.09，P＜0.05或P＜0.01）；50、75、100 mmol/L 組與 25 mmol/L 組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（q值分別為3.93、11.19、15.60，均P＜0.05）；75、100 mmol/L組與50 mmol/L組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（q值分別為7.27、11.67，均P＜0.05）；100 mmol/L濃度組與75 mmol/L組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（q=4.41，P＜0.05）。二甲雙胍能顯著抑制HaCaT細(xì)胞增殖且呈明顯的濃度依賴性。

2.二甲雙胍對(duì)HaCaT細(xì)胞miR-21-5p及PDCD4 mRNA表達(dá)的影響：25、50、75、100 mmol/L 二甲雙胍組 miR-21-5p mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.90±0.11、0.33±0.05、0.21±0.07、0.14±0.04。組間表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=36.99，P＜0.05）。25 mmol/L組與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（q=1.79，P＞0.05），其余各組均較對(duì)照組顯著下調(diào)（q值分別為10.21、12.02、13.10，P＜0.01）。50、75、100 mmol/L 組與25 mmol/L組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（q值分別為8.42、10.24、11.31，P＜0.05）；75、100 mmol/L 組與 50 mmol/L 組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（q值分別為1.82、2.89，P＞0.05）；100 mmol/L組與75 mmol/L組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（q=1.08，P＞ 0.05）。

25、50、75、100 mmol/L 二甲雙胍組 PDCD4 mRNA 相對(duì)表達(dá)量分別為2.11±0.64、7.22±1.13、11.16±1.23、19.12±3.16，組間表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=96.26，P＜0.05）。25 mmol/L組與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（q=1.85，P＞0.05），其余各組均較對(duì)照組顯著上調(diào)（q值分別為13.84、23.72、40.11，P＜0.05 或P＜0.01）。50、75、100 mmol/L 組與25 mmol/L組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（q值分別為10.55、20.43、36.82，P＜0.01）；75、100 mmol/L 組與 50 mmol/L 組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（q值分別為9.88、26.27，P＜0.01）；100 mmol/L組與75 mmol/L組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（q=16.39，P＜0.01）。

3.二甲雙胍對(duì)HaCaT細(xì)胞中PDCD4蛋白表達(dá)的影響：25、50、75、100 mmol/L 二甲雙胍刺激 HaCaT 細(xì)胞 24 h 后，與對(duì)照組相比，PDCD4蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為1.22±0.08、2.09±0.20、2.26±0.11、2.37±0.07，組間表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=75.37，P＜0.05）。25 mmol/L組與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（q=3.00，P＞0.05），其余各組均較對(duì)照組顯著上調(diào)（q值分別為14.99、17.28、18.83，P＜0.01）。50、75、100 mmol/L濃度組與25 mmol/L組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（q值分別為11.98、14.28、15.83，P＜0.01）；75、100 mmol/L 組與50 mmol/L組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（q值分別為2.64、2.15，P＞0.05）；100 mmol/L組與75 mmol/L 組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（q=1.94，P＞0.05）。見(jiàn)圖1。

圖1 蛋白免疫印跡法檢測(cè)不同濃度二甲雙胍刺激HaCaT細(xì)胞24 h PDCD4蛋白的表達(dá) 1：對(duì)照組；2～ 5：25、50、75、100 mmol/L二甲雙胍組

四、討論

二甲雙胍作為臨床一線的口服降糖藥，在體內(nèi)主要通過(guò)激活腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）信號(hào)通路，抑制下游相關(guān)酶的活性來(lái)調(diào)節(jié)糖和脂肪的代謝［8］。目前研究發(fā)現(xiàn)［9-11］，二甲雙胍可以降低糖尿病患者多種腫瘤的發(fā)生率。體外研究［2-5］表明，二甲雙胍可以抑制肝癌、前列腺癌、宮頸癌、卵巢癌等腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)與增殖，并能縮小荷瘤裸鼠腫瘤體積［3］，但是二甲雙胍的抗腫瘤機(jī)制尚不完全清楚。研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍可以通過(guò)激活MAPK信號(hào)通路抑制角質(zhì)形成細(xì)胞增殖［12］。本研究結(jié)果顯示，二甲雙胍在體外能顯著抑制HaCaT細(xì)胞增殖，其抑制率與二甲雙胍濃度呈明顯的濃度依賴性。MicroRNA是一類長(zhǎng)約22個(gè)核苷酸的非編碼蛋白質(zhì)單鏈RNA，在真核生物體內(nèi)與其靶mRNA的3′UTR堿基配對(duì)，通過(guò)抑制mRNA的翻譯或直接使其降解，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)，在細(xì)胞分化、生物發(fā)育及疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮巨大作用［13］。其中miR-21-5p因其在多種腫瘤中的表達(dá)上調(diào)而被認(rèn)為是一種致癌基因，而且在角質(zhì)形成細(xì)胞異常增殖性疾病如銀屑病中，其皮損microRNA表達(dá)譜篩選發(fā)現(xiàn)，miR-21-5p表達(dá)也顯著上調(diào)［7］。PDCD4 最早由 Shibahara 等［14］于 1995年在小鼠體內(nèi)首次發(fā)現(xiàn)，并證明其高表達(dá)在細(xì)胞凋亡中的作用，成為越來(lái)越受重視的促凋亡因子。近年來(lái)研究認(rèn)為PDCD4是一種新的抑癌基因［15］，而且miR-21-5p及其下游靶基因PDCD4的異常表達(dá)在多種腫瘤細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移中是起著重要作用，如腎癌細(xì)胞、多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞、胃癌細(xì)胞等［16-18］。本研究檢測(cè)了不同濃度二甲雙胍刺激HaCaT細(xì)胞24 h后，miR-21-5p及其下游靶基因PDCD4的表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)50～100 mmol/L二甲雙胍刺激下，miR-21-5p的表達(dá)水平顯著下調(diào)，而PDCD4的表達(dá)水平顯著上調(diào)。由此推測(cè)二甲雙胍可能通過(guò)下調(diào)HaCaT細(xì)胞中miR-21-5p的表達(dá)，使其下游靶基因PDCD4表達(dá)上調(diào)，從而發(fā)揮抑制細(xì)胞增殖的作用。

綜上所述，二甲雙胍在體外能夠抑制HaCaT細(xì)胞的增殖，可能與調(diào)控細(xì)胞中miR-21-5p及PDCD4的表達(dá)有關(guān)。本研究為二甲雙胍在臨床上治療角質(zhì)形成細(xì)胞異常增殖性疾病提供了理論依據(jù)。

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2014-06-10）

（本文編輯：顏艷）

Effect of metformin on the proliferation of and expressions of miR-21-5p and PDCD4 in HaCaT human keratinocytes

Jiang Meng,Ma Weiyuan,Sun Qing.Department of Dermatology,Qilu Hospital of Shandong University,Jinan 250012,China

Sun Qing,Email:sunqing7226@163.com

ObjectiveTo evaluate the effect of metformin on the proliferation of keratinocytes,and to investigate its possible mechanism.MethodsHaCaT human keratinocytes were divided into several groups to remain untreated（control group）or be treated with different concentrations（25,50,75,100 mmol/L）of metformin for 24 hours（intervention groups）.Subsequently,CCK8 assay was conducted to evaluate the proliferation of HaCaT cells,real-time quantitative PCR to measure the mRNA expressions of miR-21-5p and its downstream target gene PDCD4,and Western blot to detect the expression of PDCD4 protein in HaCaT cells.Statistical analysis was done by using one-way analysis of variance for multiple group comparisons and SNK-q test for paired comparisons.ResultsAfter 24-hour treatment,the proliferation of HaCaT cells was inhibited by（5.43±3.67）%,（19.61±6.95）%,（45.93±9.56）%and（61.91±6.93）%by metformin of 25,50,75 and 100 mmol/L,respectively,with significant differences observed in cell proliferation inhibition rates among these intervention groups （F=246.90,P＜0.05）.Cellular proliferative activity was similar between the control cells（0.00±3.00%）and those treated with 25 mmol/L metformin,but significantly higher in the control cells than in the other 3 metformin-treated groups （allP＜0.05）,and significantly different between the 4 metformin-treated groups（allP＜0.05）.The relative mRNA expression level（2－△△Ct）of miR-21-5p was 0.90±0.11,0.33±0.05,0.21±0.07 and 0.14±0.04（F=36.99，P＜0.01）,while that of PDCD4 was 2.11±0.64,7.22±1.13,11.16±1.23 and 19.12±3.16（F=96.26,P＜0.05）,and the expression level of PDCD4 protein was 1.22±0.08,2.09±0.20,2.26±0.11 and 2.37±0.07（F=75.37,P＜0.05）,respectively,in HaCaT cells treated with metformin of 25,50,75 and 100 mmol/L.Similarly,no significant difference was observed between the control cells and those treated with 25 mmol/L metformin in the expression level of miR-21-5p mRNA,PDCD4 mRNA or protein,but decreased expression of miR-21-5p mRNA and increased expression of PDCD4 mRNA and protein were noted in cells treated with the other 3 concentrations of metformin compared with the control cells（allP＜0.05）,and significant differences were also found in the expression levels of miR-21-5p mRNA as well as PDCD4 mRNA and protein among the 4 intervention groups（allP＜0.05）.Conclusion Metformin can markedly inhibit the proliferation of HaCaT cellsin vitro,likely by downregulating miR-21-5p expression and upregulating PDCD4 expression.

Keratinocytes;Metformin;Psoriasis;Cell proliferation;miR-21-5p;PDCD4;HaCaT cells

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.03.017

國(guó)家自然科學(xué)基金（81071291、81402607）；山東省自然科學(xué)基金（Y2007C003）

250012濟(jì)南，山東大學(xué)齊魯醫(yī)院皮膚科

孫青，Email：sunqing7226@163.com