短發(fā)夾RNA 載體穩(wěn)定抑制端粒相關(guān)蛋白TERF2IP1 表達(dá)的HCT116細(xì)胞的構(gòu)建

廉沈沂，孟麟，楊永勇，壽成超

北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院暨北京市腫瘤防治研究所 生物化學(xué)與分子生物學(xué)實驗室，惡性腫瘤發(fā)病機(jī)制及轉(zhuǎn)化研究教育部重點實驗室，北京 100142

染色體不穩(wěn)定和端粒末端結(jié)構(gòu)的異常是導(dǎo)致多種腫瘤發(fā)生的重要因素之一，也是多種腫瘤癌前病變的標(biāo)志事件[1-2]。端粒相關(guān)蛋白TERF2IP1（端粒結(jié)合蛋白2相互作用蛋白1）是端粒末端Shelterin 復(fù)合物成員之一，主要發(fā)揮維持基因組穩(wěn)定，調(diào)節(jié)端粒長度的功能[3-4]。近年有研究報道提示，TERF2IP1作為保守的核蛋白，不僅可以通過與TRF2 的結(jié)合，在端粒末端發(fā)揮抑制同源重組修復(fù)和非同源重組修復(fù)的作用，還可以通過與胞漿蛋白的結(jié)合轉(zhuǎn)位至細(xì)胞漿中，參與NF-κB信號通路的活化[5]。同時，TERF2IP1蛋白也可作為轉(zhuǎn)錄因子，通過與染色質(zhì)的非端粒位點的結(jié)合，參與下游多種信號通路的調(diào)控[5-8]。為避免短發(fā)夾RNA（short hairpin RNA，shRNA）的脫靶效應(yīng)，提高獲得穩(wěn)定干擾細(xì)胞系的成功率，我們設(shè)計并合成了分別針對TERF2IP1基因不同位點的4 對寡核苷酸序列，克隆至pGP-H1/Hygro 載體，瞬時轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌細(xì)胞系，通過抗性篩選，獲得穩(wěn)定低表達(dá)TERF2IP1基因的結(jié)腸癌HCT116 細(xì)胞系，為后續(xù)研究TERF2IP1 蛋白在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用提供了技術(shù)平臺，對研究TERF2IP1在腫瘤進(jìn)展中的功能具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 材料

結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116及載體pGP-H1/Hygro均由北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院暨北京市腫瘤防治研究所實驗室保存。

1.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

將合成的TERF2IP1shRNA正義和反義寡核苷酸序列退火形成雙鏈DNA，與經(jīng)BamHⅠ/HindⅢ雙酶切的pGP-H1/Hygro 載體混合，用T4DNA 連接酶4℃連接過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆菌種進(jìn)行擴(kuò)增，并大量提取質(zhì)粒，質(zhì)粒送北京華大基因公司測序。

1.3 純陽性干擾細(xì)胞的篩選

轉(zhuǎn)染前一日將HCT116 細(xì)胞按5×106/孔鋪到6孔板。用LipofectAMINE 2000 轉(zhuǎn)染質(zhì)粒：稀釋要轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒4 μg 到400 μL 無血清培養(yǎng)基中，同時稀釋LipofectAMINE 2000 10 mL到400 mL無血清培養(yǎng)液中，5 min內(nèi)將質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染液輕輕混合均勻，室溫放置30 min；棄去培養(yǎng)液，用無血清DMEM 培養(yǎng)液漂洗細(xì)胞2次，加上述混合物至六孔板細(xì)胞中，繼續(xù)培養(yǎng)4～6 h，換完全培養(yǎng)基培養(yǎng)；2 d后用400 μg/mL 的潮霉素篩選抗性克隆，每隔2～3 d 換液（含400 mg/mL潮霉素）；12～15 d后細(xì)胞克隆開始形成，并有一定的細(xì)胞數(shù)量，用無菌小濾紙片蘸取消化液，將細(xì)胞克隆消化后轉(zhuǎn)移到24孔板中繼續(xù)培養(yǎng)，在這一過程中，注意不要使各個克隆之間有相互污染；24孔板長滿后，消化轉(zhuǎn)移至6 孔板中繼續(xù)培養(yǎng)；6 孔板培養(yǎng)4～6 d，將各個細(xì)胞克隆消化，其中1/3 部分繼續(xù)培養(yǎng)，剩余2/3 部分進(jìn)行后續(xù)檢測；將檢測為陽性的克隆轉(zhuǎn)到10 cm皿中繼續(xù)培養(yǎng)，同時凍存保種。

1.4 實時熒光定量RT-PCR 檢測TERF2IP1 mRNA的表達(dá)

為檢測shRNA 干擾HCT116 細(xì)胞后TERF2IP1mRNA 的表達(dá)情況，按TRIzol 說明書提取HCT116-control-shRNA 組 和HCT116-TERF2IP1-shRNA 組細(xì)胞的總RNA，反轉(zhuǎn)成cDNA，取1 μL cDNA 進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將1 OD的Real-Time PCR上、下游引物分別用TE配成1 mg/mL的儲液，37℃溶解，上、下游引物各取1 μL混勻稀釋至10 μL，取1 μL進(jìn)行Real-Time PCR 反應(yīng)（94℃初始變性4 min；94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環(huán)40 次），最后用2-ΔΔCT對結(jié)果進(jìn)行分析。

1.5 Western印跡檢測TERF2IP1的表達(dá)

用本實驗室自制的細(xì)胞裂解緩沖液［50 mmol/L Tris-Cl（pH7.5），150 mmol/L NaCl，1% NP-40，0.5%脫氧膽酸鈉，0.1% SDS］，新鮮加入蛋白酶抑制劑及DTT，裂解干擾的細(xì)胞，4℃、12 000 r/min 離心15 min，收取裂解上清作為樣品，用BCA 法測定樣品蛋白濃度，取等量上清液進(jìn)行SDS-PAGE，將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，用含5%脫脂奶粉的PBST液于室溫封閉1.5 h，加入TERF2IP1鼠單抗（1∶1000稀釋），GAPDH作為內(nèi)參，4℃反應(yīng)過夜，PBST洗膜3次，5 min/次，加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗（1∶2000）室溫反應(yīng)45 min，PBST 洗膜3 次，5 min/次，暗室內(nèi)用ECL 發(fā)光法顯色5 min，檢測目的條帶，壓片顯影定影，以GAPDH作為內(nèi)參分析結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 TERF2IP1 shRNA序列的設(shè)計

根據(jù)文獻(xiàn)報道的TERF2IP1基因小干擾RNA（siRNA）序列，按照shRNA 表達(dá)載體的構(gòu)建原則重新設(shè)計TERF2IP1shRNA基因的正義和反義寡核苷酸序列。為提高干擾效率，共設(shè)計4對TERF2IP1基因的shRNA序列。TERF2IP1shRNA和對照shRNA序列由北京賽百盛公司合成（表1）。

2.2 重組shRNA質(zhì)粒載體的測序鑒定

測序結(jié)果顯示，對照shRNA 和4 條TERF2IP1shRNA 序列均已正確插入pGP-H1/Hygro 載體（圖1）。

2.3 shRNA 干擾HCT116 細(xì)胞后TERF2IP1 基因的表達(dá)

表1 構(gòu)建用oligo DNA序列

圖1 shRNA質(zhì)粒載體的測序結(jié)果

提取轉(zhuǎn)染空載體組和轉(zhuǎn)染干擾序列組的HCT116 細(xì)胞總RNA，采用實時熒光定量PCR 檢測各組細(xì)胞的TERF2IP1相對表達(dá)量。結(jié)果見圖2，轉(zhuǎn)染對照組和轉(zhuǎn)染干擾序列組中可見TERF2IP1基因的陽性表達(dá)，TERF2IP1干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組中其表達(dá)量明顯降低，TERF2IP1基因的表達(dá)抑制率分別為43%、27%、17%和53%。

2.4 HCT116 細(xì)胞的干擾和Western 印跡分析TERF2IP1蛋白的抑制效果

對實時熒光定量PCR檢測為有效干擾的單克隆進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，提取細(xì)胞總蛋白行Western 印跡檢測，結(jié)果如圖3。與轉(zhuǎn)染對照相比，轉(zhuǎn)染TERF2IP1-shRNA-1321 的細(xì)胞中TERF2IP1 蛋白的表達(dá)抑制率最高為48.6%，轉(zhuǎn)染TERF2IP1-shRNA-1037 和TERF2IP1-shRNA-1112后TERF2IP1蛋白的表達(dá)抑制率分別為63.1%和73.8%。實驗結(jié)果表明穩(wěn)定干擾TERF2IP1基因的HCT116細(xì)胞系構(gòu)建成功。

圖2 實時熒光定量PCR檢測shRNA對HCT116細(xì)胞中TERF2IP1 mRNA表達(dá)的影響

3 討論

圖3 Western印跡檢測shRNA對HCT116細(xì)胞中TERF2IP1蛋白表達(dá)的影響

迄今為止，關(guān)于TERF2IP1的功能和機(jī)制研究均證實TERF2IP1在維持端粒穩(wěn)定、抑制基因組不穩(wěn)定中發(fā)揮重要作用，同時在端粒外發(fā)揮基因調(diào)控的功能。近年研究表明，在乳腺癌細(xì)胞中敲低TERF2IP1基因的表達(dá)，可以抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移侵襲[5]。實驗證實TERF2IP1 與TERF2 協(xié)同與非端粒位點的DNA 結(jié)合，參與多通路基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，包括細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)蛋白、鈣離子通道調(diào)節(jié)蛋白及DNA損傷修復(fù)通路[6]。因此，我們可以推測TERF2IP1基因參與人類生理和病理狀態(tài)下多個過程，探索TERF2IP1在不同疾病尤其是腫瘤中的功能將會成為研究熱點。

RNA 干擾（RNAi）技術(shù)是通過雙鏈RNA 介導(dǎo)同源靶mRNA 的特異性降解，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄后基因的表達(dá)沉默，是一種高效、特異的基因調(diào)節(jié)技術(shù)，最初在1998 年的秀麗新小桿線蟲研究中被發(fā)現(xiàn)[9-10]。在RNAi技術(shù)實際應(yīng)用中，shRNA/siRNA的適宜作用濃度、最佳作用時間及轉(zhuǎn)染試劑都是影響基因沉默的關(guān)鍵因素，所以實驗的穩(wěn)定性和一致性較難控制。將shRNA靶序列克隆至含H1/U6啟動子和真核抗性篩選標(biāo)簽的載體中，進(jìn)行瞬時轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞抗性篩選，為獲得穩(wěn)定的特定基因沉默的細(xì)胞系提供了有力的實驗手段。

HCT116細(xì)胞具有在裸鼠體內(nèi)成瘤的能力，因此是研究結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移的有力工具。腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個多因素、多步驟的復(fù)雜過程，癌基因的激活是腫瘤發(fā)生的始動因素之一，癌基因激活后，除可導(dǎo)致細(xì)胞增殖和侵襲能力增強(qiáng)等生物表型外，也可導(dǎo)致染色體結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定進(jìn)而引起DNA 雙鏈斷裂等分子表型。因此，研究和探索腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移過程中的染色體和端粒相關(guān)分子事件，一直是研究人員持續(xù)關(guān)注的熱點問題[11-12]。為了更好地探討TERF2IP1在結(jié)腸癌中的功能和作用，我們根據(jù)短發(fā)夾RNA 的設(shè)計原則和要點，設(shè)計合成了4 對shRNA寡核苷酸序列，克隆至pGP-H1/Hygro 載體中，瞬時轉(zhuǎn)染HCT116 細(xì)胞后，利用潮霉素進(jìn)行細(xì)胞抗性的篩選，獲得穩(wěn)定干擾TERF2IP1基因表達(dá)的結(jié)腸癌細(xì)胞系。實時熒光定量PCR 和Western 印跡檢測結(jié)果均提示經(jīng)潮霉素篩選后穩(wěn)定干擾了HCT116 細(xì)胞中TERF2IP1基因的表達(dá)。該細(xì)胞模型的建立，為深入研究TERF2IP1基因的功能提供了有效的生物學(xué)工具，也為研究TERF2IP1基因與腫瘤的關(guān)系提供了技術(shù)支持。

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