自噬在鎘致大鼠腎臟損傷中的作用

秦永剛，李晨旭，李 雷，王永杰，盧日峰，杜海英，陳巾宇，郭 麗

（1.吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生毒理學(xué)教研室，吉林 長春 130021；2.吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院預(yù)防醫(yī)學(xué)教學(xué)實驗中心，吉林 長春 130021；3.吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)教研室，吉林 長春 130021）

鎘損傷是以腎臟和骨骼損傷為主要中毒表現(xiàn)的環(huán)境污染性疾病，目前關(guān)于鎘對于腎臟損傷機制的國內(nèi)外文獻中，其損傷機制經(jīng)證實涉及細胞凋亡、氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化等［1－4］。作為細胞損傷的另一機制，自噬在腎臟損傷中起重要作用［5］，但是自噬在鎘所致腎臟損傷中作用的研究較少；已有研究［6］僅以離體細胞作為研究對象研究了自噬在鎘造成的腎損傷中的作用，而在體內(nèi)實驗中，自噬在鎘所致腎損傷的作用未見報道。本研究擬利用不同濃度氯化鎘對Wistar大鼠染毒，制備鎘中毒腎損傷動物模型，觀察鎘對腎臟功能的影響，并對腎臟自噬指標進行檢測，探討自噬在鎘損傷中的作用，為臨床治療鎘中毒提供實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和主要試劑 選取40只健康雄性Wistar成年大鼠，體質(zhì)量（240±20）g，購自吉林大學(xué)實驗動物中心，動物合格證號：SCXK－（吉）2008－0005；氯化鎘購自天津市復(fù)光科技有限公司，LC3B和Beclin1抗體購自美國Epitomics公司。

1.2 動物分組及腎損傷模型制備 將40只大鼠隨機分為空白對照組、低劑量染毒組（0.2mg·kg－1CdCl2）、中劑量染毒組（0.4mg·kg－1CdCl2）和高劑量染毒組（0.8mg·kg－1CdCl2），每組10只。染毒組大鼠腹腔注射給予0.2、0.4和0.8mg·kg－1氯化鎘溶液制備損傷模型［7－8］，空白對照組大鼠給予等量生理鹽水。連續(xù)染毒5周，期間大鼠自由飲水飲食，觀察大鼠一般狀況，并記錄大鼠體質(zhì)量變化。

1.3 腎功能生化指標檢測 染毒5周后取各組大鼠全血，用全自動生化儀檢測各組大鼠血中肌酐、尿素氮和β2微球蛋白表達水平。

1.4 原子吸收法測定大鼠腎臟組織中鎘水平 采用高氯酸與硝酸（1∶4混合）濕法消化大鼠腎臟，定容后采用原子吸收光譜儀測定大鼠腎臟組織中鎘水平。

1.5 免疫組織化學(xué)法檢測大鼠腎臟組織中自噬相關(guān)蛋白Beclin1的表達水平 石蠟切片常規(guī)脫蠟、脫水，枸櫞酸溶液98℃抗原修復(fù)5min，內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑室溫25min，動物非免疫血清封閉30min，一抗Beclin1（1∶200稀釋）4℃過夜，生物素標記的二抗室溫40min，鏈霉素抗生物素蛋白－過氧化物酶30min，DAB顯色，蘇木精染核5min，弱氨水返藍，常規(guī)脫水、透明，中性樹膠封片。采用Image Pro Plus 6.0分析Beclin1積分吸光度（IA）值，以IA值表示Beclin1蛋白表達水平。

1.6 Western blotting法檢測大鼠腎臟組織中自噬相關(guān)蛋白LC3B相對表達水平 蛋白提取，制備15%分離膠、5%濃縮膠，在樣品孔中加入30μg蛋白樣品，80V電泳，100mA轉(zhuǎn)膜2h，一抗LC3B（1∶1000稀釋）4℃過夜，TBST室溫洗膜3次，HRP標記的二抗室溫45min，TBST室溫洗膜3次，暗室中加ECL發(fā)光液，曝光，顯影定影。采用Quantity One軟件對所得圖像進行灰度值分析，重復(fù)測量取均值。LC3B相對表達水平＝LC3B灰度值／內(nèi)參β－actin灰度值。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。各組大鼠體質(zhì)量、血清肌酐、尿素氮、β2微球蛋白、組織中鎘水平、Beclin1蛋白表達水平值和LC3B相對表達水平以表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩組間均數(shù)比較采用SNK－q法。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠一般狀況和體質(zhì)量 染毒組大鼠在染毒開始后出現(xiàn)食量減少，精神狀態(tài)萎靡，毛色無光；第3周開始高劑量染毒組大鼠體質(zhì)量明顯低于空白對照組（P＜0.05）；到第5周染毒結(jié)束，中劑量染毒組和高劑量染毒組大鼠體質(zhì)量均顯著低于空白對照組（P＜0.05）。見表1。

表1 不同時間點各組大鼠體質(zhì)量Tab.1 Body weights of rats at different time points in various groups （n＝10，，m／g）

表1 不同時間點各組大鼠體質(zhì)量Tab.1 Body weights of rats at different time points in various groups （n＝10，，m／g）

＊P＜0.05compared with blank control group；△P＜0.05compared with low dose group.

0 3 4 5 Blank control 247.80±8.17 306.80±14.27 322.Group Body weight（week）60±22.67 339.40±15.68 CdCl2 Low dose 244.60±6.80 285.20±24.69 298.40±21.53 310.60±22.93 Middle dose 246.20±7.53 285.80±19.08 291.20±13.28 299.00±24.37＊High dose 245.40±7.67 280.20±15.64＊ 284.60±19.37＊ 287.60±28.08＊△

2.2 各組大鼠腎功能生化指標 與空白對照組比較，低劑量染毒組大鼠生化指標表達水平改變不明顯，中、高劑量染毒組大鼠血清肌酐、尿素氮和β2微球蛋白表達水平明顯升高（P＜0.05）；與低劑量染毒組比較，高劑組染毒組大鼠尿素氮和中、高劑量組大鼠血清肌酐表達水平明顯升高（P＜0.05）。見表2。

2.3 各組大鼠腎臟組織中鎘水平 空白對照組大鼠腎臟中僅見微量鎘蓄積，低、中和高劑量染毒組大鼠腎臟組織中均有鎘蓄積，且低、中、高劑量染毒組大鼠鎘的蓄積量呈遞增趨勢。與低劑量染毒組比較，中、高劑量染毒組大鼠腎臟組織中鎘水平顯著升高（P＜0.05）；與中劑量染毒組比較，高劑量染毒組大鼠腎臟組織中鎘水平顯著升高（P＜0.05）。見表3。

2.4 各組大鼠腎臟組織中自噬相關(guān)蛋白Beclin1的表達水平 空白對照組大鼠腎臟組織基本不表達Beclin1，而染毒組大鼠隨著染毒劑量的增加腎臟組織Beclin1的表達水平也隨之增加。與空白對照組比較，低、中和高劑量染毒組大鼠腎臟組織中Beclin1表達水平明顯升高（P＜0.05）；中、高劑量染毒組大鼠腎臟組織中Beclin1表達水平顯著高于低劑量染毒組（P＜0.05），同時高劑量染毒組大鼠腎臟組織中Beclin1表達水平顯著高于中劑量染毒組（P＜0.05）。見表3和圖1（見插頁一）。

表2 各組大鼠腎功能指標Tab.2 Renal function indexes of rats in various groups （n＝10，）

表2 各組大鼠腎功能指標Tab.2 Renal function indexes of rats in various groups （n＝10，）

＊P＜0.05compared with blank control group；△P＜0.05compared with low dose group.

Group BUN［cB／（mmol·L－1）］ CR［cB／（μmol·L－1）］ β2－MG［ρB／（mg·L－1）］Blank control 5.27±0.64 26.4±2.2 1.08±0.03 CdCl2 Low dose 5.63±0.91 26.6±3.1 1.12±0.04 Middle dose 6.51±0.51＊ 31.2±3.4＊△ 1.18±0.06＊High dose 6.85±0.91＊△ 31.6±4.2＊△ 1.17±0.08＊

表3 各組大鼠腎臟組織中鎘水平、Beclin1表達水平和LC3B相對表達水平Tab.3 Levels of cadmium，expression levels of Beclin1and relative expression levels of LC3Bin kidney tissue of rats in various groups （n＝10，）

表3 各組大鼠腎臟組織中鎘水平、Beclin1表達水平和LC3B相對表達水平Tab.3 Levels of cadmium，expression levels of Beclin1and relative expression levels of LC3Bin kidney tissue of rats in various groups （n＝10，）

＊P＜0.05compared with blank control group；△P＜0.05compared with low dose group；#P＜0.05compared with middle dose group.

Relative expression level of LC3B Blank control 0.18±0.04 347.6±25.9 0.14±0.0 Group Level of cadmium［wB／（μg·g－1）］Expression level of Beclin1（IA）2 CdCl2 Low dose 25.95±2.90＊ 1641.9±221.8＊ 0.32±0.04＊Middle dose 43.62±8.60＊△ 18626.5±610.6＊△ 0.69±0.07＊△High dose 79.54±15.57＊△# 36348.2±718.8＊△# 0.83±0.08＊△#

2.5 各組大鼠腎臟組織中自噬相關(guān)蛋白LC3B的相對表達水平 低、中和高劑量染毒組LC3B相對表達水平均較空白對照組顯著增加（P＜0.05），且中、高劑量染毒組大鼠腎臟組織中LC3B的相對表達水平較空白對照組、低劑量組顯著增加（P＜0.05）。見表3和見圖2。

圖2 Western blotting法檢測各組大鼠腎臟組織中LC3B表達電泳圖Fig.2 Electrophoregram of expressions of LC3Bin kidney tissue of rats in various groups detected by Western blotting method

3 討 論

本研究結(jié)果表明：鎘染毒5周后，大鼠腎臟功能嚴重損傷，染毒組大鼠腎功能指標肌酐、尿素氮表達水平顯著增高，表明腎臟可能出現(xiàn)急慢性腎炎、重癥腎盂腎炎或各種原因?qū)е碌募甭阅I功能障礙；β2－微球蛋白表達水平升高，表明腎小管、腎小球可能出現(xiàn)功能性損傷。已有研究［9］表明：鎘在一定劑量內(nèi)即可對腎近端小管細胞造成明顯損傷，影響其正常功能；鎘也可對腎小體濾過屏障的超微結(jié)構(gòu)造成損傷［10］，致使腎臟功能不全；申元帥［11］的研究結(jié)果也支持鎘對于腎臟功能的損傷作用，與本實驗的研究結(jié)果一致。

自噬是一種降解胞質(zhì)材料和細胞器的溶酶體途徑，其在氨基酸饑餓、未折疊蛋白反應(yīng)和病毒感染等條件下均會被激活［12］，以實現(xiàn)細胞本身的代謝需要和某些細胞器的更新［13］。已有研究證實自噬在腎臟損傷中扮演著重要的角色。Inoue等［14］在利用NRK－52E研究腎臟損傷過程中發(fā)現(xiàn)：自噬參與了損傷細胞的死亡過程，因此可認為自噬可以作為腎臟細胞損傷的一種指標；而He等［15］認為：自噬可能通過促進腎小管的萎縮和分解來促進腎臟纖維化，也可能通過影響細胞內(nèi)過度膠原的降解來阻止腎臟纖維化；Wang等［16］發(fā)現(xiàn)：在對 MES13細胞加入鎘作用后細胞自噬作用明顯增強，表明鎘對細胞自噬有誘導(dǎo)作用。在本實驗中染毒組大鼠腎臟組織中自噬蛋白LC3B及Beciln1表達水平顯著升高，而在未染毒大鼠腎臟中其表達水平極低，表明自噬在鎘對腎臟的損傷過程中起到了一定的作用。本研究結(jié)果表明：在該實驗染毒劑量內(nèi)，腎臟組織中蓄積了大量鎘，且隨著染毒劑量增加，鎘的蓄積量也隨之增多，分析其機制可能是鎘被吸收轉(zhuǎn)運進入腎臟后，在腎臟中蓄積，損傷腎功能細胞，激活自噬機制，使細胞發(fā)生自噬性死亡。

綜上所述，鎘中毒可導(dǎo)致腎臟組織嚴重損傷，影響腎臟功能，自噬可能是鎘致腎臟損傷的作用機制之一，但其具體機制仍需進一步探究。

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