氧化還原引發(fā)制備乙氧酰胺苯甲酯分子印跡微球及其表征

李兆周，李智麗，陳秀金，李道敏，高紅麗，曹 力，侯玉澤，李松彪，牛曉慧，趙振威，趙曉波，陳 慧，陳鳳閣

(河南科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽 471023)

乙氧酰胺苯甲酯(Ethopabate，ETP)是一種廣譜抗球蟲增效劑，對雞巨型、布氏艾美耳球蟲以及其他小腸球蟲具有較強(qiáng)的殺滅作用，與其他抗球蟲藥物混合使用時(shí)不僅可以抑制卵囊，阻斷四氫葉酸的合成，還可以降低抗藥性，提高藥效，因此常被制成復(fù)方制劑用于獸醫(yī)臨床。2010版《中國獸藥典》(第一部)已收載其原料及制劑，規(guī)定其制劑的休藥期為7 d。我國農(nóng)業(yè)部文件《動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留限量》(農(nóng)牧發(fā) ［2002］235號)規(guī)定:ETP在禽肝臟和腎臟中的最高殘留限量為1 500 μg/kg，肌肉中的最高殘留限量為 500 μg/kg［1］。

ETP在畜牧生產(chǎn)中長期大量應(yīng)用會導(dǎo)致其在動(dòng)物性食品中殘留，從而對人類健康和環(huán)境生態(tài)具有潛在危害。建立和完善殘留檢測方法，定期進(jìn)行監(jiān)控，是控制其殘留的有效途徑。目前，基于各類生物性抗體的免疫分析方法需要制備結(jié)合抗原和有特異性識別作用的抗體，制備過程較為復(fù)雜，且分析過程中的穩(wěn)定性較差，精密度較低。ETP的儀器檢測方法主要有薄層色譜法、紫外分光光度法、高效液相色譜法［2］、高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法等［3］。其中，薄層色譜法操作簡單，常用作定性，但其定量的準(zhǔn)確度和靈敏度較低。紫外分光光度法的定量誤差較大，難以排除樣品基質(zhì)的干擾。色譜法的檢出限較高，難以滿足痕量獸藥殘留和出口貿(mào)易檢測的實(shí)際需要，而且需進(jìn)行步驟復(fù)雜的樣品凈化和富集［4］。色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法的檢測靈敏度高，但價(jià)格相對昂貴。由于許多動(dòng)物性食品的基質(zhì)較為復(fù)雜，干擾物質(zhì)較多，前處理步驟比較繁瑣［5］。因此，亟需開發(fā)選擇性強(qiáng)和效果好的樣品前處理和分析方法。

分子印跡技術(shù)能夠獲得在空間和結(jié)合位點(diǎn)上與某種分子完全匹配的聚合物，具有構(gòu)效的預(yù)定性、識別的特異性和廣泛的實(shí)用性［6］。基于該技術(shù)所制備的分子印跡聚合物(Molecular imprinting polymers，MIPs)可以特異性地識別目標(biāo)化合物，且制備方法簡單，穩(wěn)定性好，適用于多種環(huán)境條件，使用壽命長，可多次重復(fù)使用，成本低。針對食品中的有毒有害物質(zhì)，開發(fā)基于MIPs的新型分離介質(zhì)，建立相應(yīng)的樣品處理和分析方法，成為一個(gè)方興未艾的研究熱點(diǎn)。

傳統(tǒng)的MIPs制備一般采用本體聚合法，操作簡便，對儀器設(shè)備條件要求低，但需要研磨、篩分和漂洗等復(fù)雜的后處理工藝，所得MIPs的形狀不規(guī)則，尺寸不均勻，產(chǎn)率較低，且費(fèi)時(shí)、費(fèi)力［7］。針對本體聚合的問題，Mayes等［8］提出了懸浮聚合法用于MIPs的合成，此法可以直接生成微球形的MIPs，省去了后處理過程，大大提高了產(chǎn)率和吸附性能，簡化了后處理工藝。在印跡聚合過程中，引發(fā)聚合條件是影響MIPs識別性能的重要因素之一，模板和單體所形成的預(yù)聚復(fù)合體越穩(wěn)定，則MIPs識別性能越好［9］。懸浮聚合法多采用熱分解引發(fā)劑如偶氮二異丁腈［10－11］、偶氮二異庚腈［12］等，在加熱或紫外光照射條件下進(jìn)行微球的制備［13］，雖能成功聚合，但會影響模板－單體預(yù)聚復(fù)合體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，尤其是具有熱敏或光敏性的模板分子。采用氧化還原引發(fā)體系可以有效解決這一問題，該引發(fā)體系能降低生成自由基的活化能，提高聚合反應(yīng)的速率，進(jìn)而降低反應(yīng)溫度，提高聚合物的識別性能［14－16］。

本文選擇氧化還原引發(fā)方式，以ETP為模板分子，甲基丙烯酸為功能單體，乙腈為致孔劑，季戊四醇三丙烯酸酯為交聯(lián)劑，制備并表征了具有特異性吸附能力的ETP MIPs微球。與常用的熱分解引發(fā)劑相比，本文所用引發(fā)劑的引發(fā)溫度較低，可大幅減少引發(fā)溫度對預(yù)聚復(fù)合體的影響，提高M(jìn)IPs的特異性和識別能力。所制備的微球狀聚合物能最大限度地減少傳統(tǒng)本體聚合法后處理過程中識別位點(diǎn)的破壞，且具有比表面積較大，分散性和均勻度較好等特點(diǎn)，有利于目標(biāo)化合物的特異性識別［17］。所制備的MIPs有望用于食品或環(huán)境中ETP的快速、靈敏分析。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑及儀器

ETP對照品(湖北威德利化學(xué)科技有限公司);乙酰苯胺(N-phenylacetamide，NPA)、聚乙烯醇1788、4-氨基苯甲酸甲酯(Methyl-4-aminobenzoate，MBZ)(阿拉丁試劑有限公司);乙腈、甲醇、N，N-二甲基苯胺、過氧化苯甲酰(天津市德恩化學(xué)試劑有限公司);甲基丙烯酸(MAA)、丙烯酰胺(AM)、4-乙烯基吡啶(4-VP)、季戊四醇三丙烯酸酯(美國Alfa Aesar公司)。除對照品外，所用試劑均為分析純。

TGL－18C高速臺式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠);1260高效液相色譜儀(美國安捷倫公司);FA1004電子分析天平(上海上平儀器有限公司);101－2A電熱鼓風(fēng)干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司);KQ3200DE超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);DK－8D三孔電熱恒溫水槽(上海一恒科技有限公司);STARe差示掃描量熱儀(瑞士梅特勒－托利多集團(tuán));VERTEX 70傅立葉變換紅外光譜儀(德國布魯克公司)。

1.2 分子印跡聚合物的制備

準(zhǔn)確稱量1.5 g聚乙烯醇1788加入100 mL蒸餾水，加熱并攪拌至完全溶解，冷卻至室溫后轉(zhuǎn)入250 mL的四口瓶中，水浴25℃，以400 r/min的轉(zhuǎn)速攪拌，通氮?dú)?0 min待用。稱取1 mmol ETP至25 mL燒杯，加入功能單體(甲基丙烯酸、4-乙烯基吡啶或丙烯酰胺)、交聯(lián)劑(季戊四醇三丙烯酸酯)和致孔劑，超聲5 min混勻;再加入引發(fā)劑過氧化苯甲酰和N，N-二甲基苯胺各0.4 mmol，超聲5 min混勻。在氮?dú)猸h(huán)境下，將混合溶液緩慢滴入四口瓶內(nèi)，密封，以400 r/min的速度攪拌，水浴25℃引發(fā)聚合24 h。聚合反應(yīng)結(jié)束后，將所得聚合物微球離心，棄去上清液，依次用蒸餾水洗滌5次，甲醇洗滌3次，乙醇洗滌3次，每次20 min。將離心的沉淀物于55℃真空干燥后，放入索氏提取器中用甲醇－乙酸混合溶液(9∶1)洗脫至無模板分子被檢出，然后用甲醇洗脫除去殘留溶劑，將MIPs取出，55℃干燥至恒重，以分級篩分級，獲得平均粒徑大小為50～70 μm的ETP分子印跡聚合物［9］?？瞻追肿佑≯E聚合物(Non－molecular imprinting polymer，NIP)的合成方法除不加模板分子外，其他步驟與上述方法相同。

1.3 掃描電子顯微鏡表征

將MIPs微球加至載物臺上，噴金處理后用場發(fā)射掃描電鏡(Field emission scanning electron microscope，SEM)進(jìn)行形貌觀察并采集照片。

1.4 差熱分析

應(yīng)用差示掃描量熱法(Differential scanning calorimetry，DSC)分析聚合物微球的熱穩(wěn)定性，起始溫度25℃，空氣氛圍，升溫速率為10℃·min－1，試樣質(zhì)量為9 mg。

1.5 紅外光譜測定

采用KBr壓片法，用傅立葉變換紅外光譜儀掃描，獲取MIPs的紅外光譜圖，根據(jù)紅外光譜圖中吸收峰的位置、形狀、強(qiáng)度獲得與分子結(jié)構(gòu)有關(guān)的信息。

1.6 乙氧酰胺苯甲酯及其類似物分析

在進(jìn)行吸附性能研究前，須建立底物的定量分析方法。參考文獻(xiàn)報(bào)道，本研究采用高效液相色譜法對ETP及其結(jié)構(gòu)類似物NPA和MBZ進(jìn)行分析［2］。色譜條件:固定相為Angilent Zarbax SB C18色譜柱，250 mm×4.6 mm(i.d.);流動(dòng)相為乙腈－水(35∶65)混合液;檢測波長268 nm;進(jìn)樣量10 μL;柱溫為室溫;流速1 mL·min－1。

1.7 吸附性能研究

1.7.1 靜態(tài)平衡吸附量 在塑料離心管中加入50 mg的MIPs和5 mL 0.5 mmol·L－1ETP的乙腈溶液，混勻，在25℃下，以200 r/min的速度振蕩24 h，離心后取上清液，用乙腈稀釋10倍，取1 mL注入高效液相色譜儀測定其平衡濃度，依據(jù)式(1)計(jì)算模板分子的吸附量Qw。

式中Qw為靜態(tài)平衡吸附量(mmol·g－1);Cs0為底物起始濃度(mmol·L－1);Cs為吸附平衡時(shí)底物的濃度(mmol·L－1);V為底物溶液的體積(mL);m為MIPs的加入量(mg)。

依據(jù)靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)結(jié)果，計(jì)算聚合物微球的分離系數(shù)和印跡因子，根據(jù)式(2)計(jì)算底物在聚合物和溶液兩相中的分離系數(shù)K。

式中，Cp為聚合物結(jié)合底物的濃度(μmol·g－1);Cs為溶液中底物的平衡濃度(mmol·L－1)。由式(3)計(jì)算聚合物微球的印跡因子IF。

其中，Kpmip為MIP的分離系數(shù);Kpnip為NIP的分離系數(shù)。

1.7.2 等溫吸附曲線 將5 mL不同濃度的ETP乙腈溶液作為吸附液，在25℃下準(zhǔn)確稱取10份50 mg MIPs，測定其對模板分子的吸附量，以吸附量對模板分子的濃度作圖，繪制等溫吸附曲線，將獲得的數(shù)據(jù)用于式(4)的Scatchard分析［18］。根據(jù)Scatchard曲線的斜率與截距求出聚合物的平衡解離常數(shù)與最大表觀吸附量。

式中，Kd為結(jié)合位點(diǎn)的平衡解離常數(shù)，C為模板分子的平衡濃度(mmol·L－1)，Qmax為最大表觀吸附量(mmol·g－1)。

1.8 選擇性評價(jià)

選用印跡因子最高的MIPs進(jìn)行選擇性評價(jià)。將50 mg MIPs放入塑料離心管中，分別加入5.0 mL 0.5 mmol·L－1模板分子及其結(jié)構(gòu)類似物的乙腈溶液(對于不溶于乙腈的物質(zhì)采用甲醇溶解)，置于25℃恒溫氣浴搖床中振蕩24 h，將該混合液在20 000 g轉(zhuǎn)速下離心15 min，取適量上清液用相應(yīng)溶劑稀釋10倍，分別測定模板分子及其類似物的平衡濃度，并計(jì)算MIPs對不同底物的Qw，K和IF［19］。

2 結(jié)果與討論

2.1 聚合條件的優(yōu)化

采用四因素三水平(L934)正交設(shè)計(jì)法優(yōu)化印跡體系，根據(jù)所得聚合物的印跡因子篩選最優(yōu)的反應(yīng)條件和體系。在對模板分子進(jìn)行印跡的過程中，致孔劑起著重要作用，既作為溶劑溶解模板分子、功能單體、交聯(lián)劑和引發(fā)劑，也可以保證所制備的聚合物有合適的孔徑，減少傳質(zhì)阻力，使模板分子及其結(jié)構(gòu)類似物能夠自由結(jié)合識別位點(diǎn)。致孔劑的理化性質(zhì)與聚合物的性能間有密切關(guān)系，其極性越低，越有利于模板分子和單體之間氫鍵的形成。據(jù)此，本研究分別選擇乙腈、氯仿和乙腈－氯仿混合溶劑(1∶1)制備印跡聚合物，根據(jù)所得聚合物的吸附性能指標(biāo)優(yōu)選最佳的致孔劑。此外，模板分子的加入量分別選擇1，2，3 mmol;功能單體分別選擇酸堿性不同的甲基丙烯酸、4-乙烯基吡啶和丙烯酰胺;根據(jù)模板分子和功能單體化學(xué)結(jié)構(gòu)中的氫鍵作用位點(diǎn)，模板分子與功能單體的摩爾比分別選擇1∶4，1∶6和1∶8(見表1)。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels for orthogonal design

不同條件下所得聚合物的IF見表2。其中K1，K2和K3為相應(yīng)水平所得IF的總和，k1，k2和k3分別為K1，K2和K3的平均值，R為極差。從表可知，不同因素對所得結(jié)果影響的順序?yàn)镃＞B＞D＞A，說明致孔劑的理化性質(zhì)對模板分子和功能單體之間的非共價(jià)鍵相互作用的影響較大，最優(yōu)的試驗(yàn)組合為A1B1C3D2，即:當(dāng)模板分子加入量為1 mmol，功能單體為MAA，致孔劑為乙腈，模板單體摩爾比為1∶6時(shí)，所得聚合物的印跡效應(yīng)最好。依此最佳組合制備MIPs，表征其各項(xiàng)性能指標(biāo)。

表2 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of orthogonal test

(續(xù)表2)

2.2 聚合物微球表面形貌觀察

ETP印跡聚合物微球和空白聚合物微球的電鏡掃描圖片見圖1，由圖可見，聚合物微球形貌規(guī)則，表面均勻、平滑，空白聚合物微球的分布較為均勻，粒徑較ETP印跡微球大(見圖1A)，部分ETP印跡微球表面分布有大小不等的孔洞(見圖1B)，可能是由于模板分子的加入抑制了聚合過程中鏈的延伸，致使聚合產(chǎn)物的分子量下降，粒徑變小，分布變寬，表面孔洞增多增大。此外模板分子的加入使反應(yīng)體系的極性增大，聚合物微球在反應(yīng)體系中的溶解度下降而過早地沉淀出，這是ETP聚合物微球小于空白微球的另一原因［20］。

圖1 ETP空白聚合物微球(A)與印跡聚合物微球(B)的電鏡掃描圖片F(xiàn)ig.1 Images of ETP NIP(A)and MIP(B)microspheres characterized by scanning electron microscope

圖2 ETP MIP和NIP的紅外光譜Fig.2 Infrared spectra of ETP MIP and NIP

2.3 紅外光譜表征

圖2為印跡聚合物和空白微球的紅外圖譜測定結(jié)果，在NIP微球中，由于存在MAA之間的相互作用，使得NIP的紅外吸收強(qiáng)于MIP。在印跡過程中，模板分子的加入打破了單體間的相互作用，從而使得吸收峰明顯減弱。其中，在3 000～4 000 cm－1范圍內(nèi)的吸收主要反映了氫鍵的形成，該處吸收的差異表明MIP在印跡聚合過程中形成了較強(qiáng)的氫鍵相互作用。圖中1 730 cm－1為MAA分子中C‖O鍵的伸縮振動(dòng)，在印跡過程中模板分子的—NH與MAA的C‖O基團(tuán)發(fā)生了相互作用，使得C‖O鍵的振動(dòng)減弱，吸收減少，并發(fā)生了輕度藍(lán)移。在500～1 500 cm－1之間也出現(xiàn)不同程度的吸收差異，表明模板和單體的相互作用使聚合物分子結(jié)構(gòu)中的多處化學(xué)鍵發(fā)生了振動(dòng)頻率和幅度改變，MIP和NIP紅外圖譜的差異證實(shí)了印跡效應(yīng)的存在。

2.4 熱穩(wěn)定性分析

ETP MIP和NIP微球的DSC圖譜見圖3，當(dāng)聚合物受熱后，其吸熱逐漸增多，NIP和MIP微球分別在68.6℃和83.5℃達(dá)到其吸熱的峰值，隨后吸熱逐漸減少以至幾乎沒有熱量吸收，此吸熱過程顯示上述溫度為聚合物的相變溫度。MIP微球由于加入了模板分子，聚合物的交聯(lián)度相對較低，因此其相變溫度也較低。當(dāng)溫度升至200℃后，聚合物逐漸呈現(xiàn)放熱過程，推測聚合物在此溫度下開始出現(xiàn)不同程度的分解。差熱分析結(jié)果表明，聚合物的熱穩(wěn)定性較好，能夠滿足實(shí)驗(yàn)室和現(xiàn)場檢測環(huán)境的需要。

圖3 ETP MIP與NIP微球的DSC圖譜Fig.3 DSC spectra of ETP MIP and NIP microspheres

2.5 聚合物的吸附性能

在研究吸附性能前，建立了ETP及其結(jié)構(gòu)類似物NPA和MBZ的高效液相色譜定量分析方法，依據(jù)化合物的濃度(Y，mg/L)及其對應(yīng)的峰面積(X)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行定量分析［3－4］，結(jié)果見表3。由表可知，所得標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性良好，檢出限(3倍信噪比)和定量下限(10倍信噪比)能夠滿足吸附性能分析的需要。

表3 ETP及其結(jié)構(gòu)類似物的定量分析結(jié)果Table 3 Quantitative analysis results of ETP and structural analogues

依據(jù)各底物的定量分析方法，表征最優(yōu)聚合條件下所得MIPs的吸附性能，將實(shí)驗(yàn)原始數(shù)據(jù)代入公式(1)～(4)，聚合物的各項(xiàng)吸附性能參數(shù)見表4。

表4 ETP印跡聚合物吸附性能表征結(jié)果Table 4 Characterization of adsorption properties of ETP imprinted polymer

由表4可知，MIP的吸附能力顯著高于NIP，其印跡因子為4.93，對ETP的吸附能力較強(qiáng)。進(jìn)一步考察了MIP的吸附動(dòng)力學(xué)曲線(見圖4)。由圖可知，MIP在4 h內(nèi)對底物的吸附可達(dá)到穩(wěn)態(tài)，NIP在2 h內(nèi)即可達(dá)到穩(wěn)態(tài)。這表明氧化還原法引發(fā)所得聚合物的傳質(zhì)阻力較低，較易達(dá)到吸附平衡，有利于聚合物對底物的快速識別。

圖4 ETP印跡聚合物的吸附動(dòng)力學(xué)曲線Fig.4 Kinetic adsorption curves of ETP MIPs

圖5為印跡聚合物的等溫吸附曲線。在25℃下，聚合物在0.7 mmol·L－1ETP的溶液中達(dá)到飽和吸附，當(dāng)結(jié)合達(dá)到平衡后，單位質(zhì)量MIP的吸附量隨著模板分子濃度的增加而趨于飽和，且顯著高于NIP的吸附量。由圖可見，聚合物的吸附過程符合雙分子競爭吸附的Langmuir模型。隨后的Scatchard分析表明，在MIP上存在兩類位點(diǎn)，一類是能與模板分子特異性結(jié)合的位點(diǎn)，對模板分子具有高度的選擇性，存在于聚合物的表面和內(nèi)部;另一類是非特異性的結(jié)合位點(diǎn)。其中MIP高親和力位點(diǎn)的分離系數(shù)(KD1)和最大表觀吸附量(Qmax1)分別為 0.061 μmol·L－1和 15.28 μmol·g－1;MIP低親和力位點(diǎn)的分離系數(shù)(KD2)和最大表觀吸附量(Qmax2)分別為 0.40 μmol·g－1和 27.12 μmol·g－1。而NIP無特異性結(jié)合位點(diǎn)，只有非特異結(jié)合位點(diǎn)，因此其達(dá)到平衡時(shí)的吸附量低于MIP。其分離系數(shù)(KD)與最大表觀吸附量(Qmax)分別為0.35 μmol·L－1與 6.90 μmol·g－1。

2.6 聚合物的選擇性研究

為評價(jià)聚合物的選擇性，選擇印跡因子最高的MIPs進(jìn)行選擇性評價(jià)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表5。結(jié)果顯示，以ETP為模板的MIPs對NPA和MBZ均具有一定的識別能力，印跡因子(IF)在2以上。NPA和MBZ雖然與ETP的結(jié)構(gòu)非常類似，但分子結(jié)構(gòu)上的極性官能團(tuán)較少，這也可能是聚合物對二者識別能力稍低的原因之一，其次，底物的空間結(jié)構(gòu)也會影響聚合物的識別作用。選擇性評價(jià)實(shí)驗(yàn)表明，模板分子的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)對MIPs的識別起決定性作用，這進(jìn)一步印證了MIPs具有識別性能預(yù)定性的特點(diǎn)。

圖5 ETP印跡聚合物的等溫吸附曲線與Scatchard分析Fig.5 Isotherm curves and Scatchard analysis of ETP MIPs

3 結(jié)論

本文采用懸浮聚合法制備了ETP MIPs微球，結(jié)果表明，在氧化還原劑的引發(fā)下，以乙腈為致孔劑，ETP為模板分子，MAA為功能單體，季戊四醇三丙烯酸酯為交聯(lián)劑，三者的摩爾比為1∶6∶20時(shí)所得聚合物的印跡效應(yīng)最佳。本研究所得MIPs能夠用于復(fù)雜基質(zhì)中ETP的選擇性識別，研究結(jié)果不僅為樣品中ETP前處理和檢測方法的建立奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)也證實(shí)了氧化還原劑引發(fā)制備MIPs微球的可行性，豐富了分子印跡技術(shù)的應(yīng)用實(shí)踐，為熱和光不穩(wěn)定模板分子MIPs的引發(fā)制備提供了參考。

表5 ETP MIPs的選擇性評價(jià)結(jié)果Table 5 The results of selectivity assessment of ETP MIPs

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