張 穎，魯瑩瑩，姜 昭，單德鑫，曹 博，Kehinde O.Erinle

（東北農(nóng)業(yè)大學資源與環(huán)境學院，哈爾濱 150030）

阿特拉津污染脅迫對典型細菌DNA損傷研究

張 穎，魯瑩瑩，姜 昭，單德鑫，曹 博，Kehinde O.Erinle

（東北農(nóng)業(yè)大學資源與環(huán)境學院，哈爾濱 150030）

采用隨機擴增多態(tài)性DNA標記（RAPD）方法，研究阿特拉津濃度為0、25、50、75、100和125 mg·L-1污染脅迫條件下對阿特拉津高效降解菌Arthrobacter sp.DNS10和Acinetobacter sp.DNS32與非阿特拉津降解菌Escherichia coli K12和Micrococcus luteus N19生長影響及基因組DNA損傷情況。結(jié)果表明，在阿特拉津污染脅迫24 h后，隨阿特拉津濃度增高，Escherichia coli K12和Micrococcus luteus N19生長速度受抑制強度逐漸明顯。利用隨機引物對上述四種細菌基因組DNA進行PCR擴增。結(jié)果表明，菌株Escherichia coli K12和Micrococcus luteus N19處理組與對照組之間RAPD指紋圖譜存在明顯差異，在阿特拉津濃度為100 mg·L-1時，基因組模板穩(wěn)定性（GTS）分別降至52.3%和61.2%。同一濃度下，阿特拉津降解菌Acinetobacter sp.DNS32基因組模板穩(wěn)定性為82.9%，Arthrobacter sp. DNS10基因組模板穩(wěn)定性為92.1%。研究表明，阿特拉津脅迫對Escherichia coli K12和Micrococcus luteus N19基因組DNA產(chǎn)生損傷；阿特拉津降解菌Arthrobacter sp.DNS10和Acinetobacter sp.DNS32對阿特拉津脅迫有較高耐受性，適于阿特拉津降解。

隨機擴增多態(tài)性DNA；阿特拉津；細菌；基因毒理效應；DNA損傷

網(wǎng)絡出版時間2015-4-30 14:44:00 [URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20150430.1444.012.html

張穎,魯瑩瑩,姜昭,等.阿特拉津污染脅迫對典型細菌DNA損傷研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學學報,2015,46(5):60-67.

Zhang Ying,Lu Yingying,Jiang Zhao,et al.Application of RAPD to detect atrazine induced DNA damage in typical bacterial cells[J].Journal of Northeast Agricultural University,2015,46(5):60-67.(in Chinese with English abstract)

阿特拉津（Atrazine），是三氮苯類除草劑，常用于清除玉米、高粱、甘蔗和果園等作物中禾本科雜草和闊葉雜草。由于價格便宜，操作簡便，而迅速推廣和廣泛使用。我國于20世紀70年代開始使用阿特拉津。對阿特拉津需求量不斷增加[1]。阿特拉津在環(huán)境中遷移速度快、難降解，在環(huán)境中可存在長達457周[2]。對土壤、水體大氣及各類生態(tài)系統(tǒng)造成嚴重污染。

阿特拉津分子結(jié)構(gòu)中含1個氯原子，導致其對生物產(chǎn)生毒性作用，影響動植物生長、繁殖[3-5]。近年來阿特拉津生態(tài)毒理學研究受到廣泛關注，揭示其環(huán)境行為及制毒機制，通過對不同動植物研究表明，阿特拉津影響生物體蛋白質(zhì)合成、DNA鏈斷裂、脂肪酸組成改變等[6-7]。然而，針對阿特拉津?qū)ξ⑸锂a(chǎn)生的毒理效應研究鮮見。

隨機擴增多態(tài)性DNA標記（RAPD）技術由美國科學家Wiliams和Welsh于1990年分別研究提出[8-9]。RAPD技術是建立在PCR技術基礎上的分子標記手段，以單隨機多態(tài)核苷酸序列（通常為10個堿基對）為引物，對基因組DNA進行擴增，RAPD擴增結(jié)果能反映出基因組相應區(qū)域的DNA特性，當基因組DNA序列發(fā)生變化后，使引物結(jié)合位點發(fā)生改變，而產(chǎn)生不同指紋圖譜[10-11]，因此生物基因組DNA受環(huán)境污染物脅迫影響情況通過RAPD技術檢驗。近年來，RAPD技術已廣泛應用于環(huán)境污染物對動物、植物和微生物DNA損傷檢測和遺傳毒性分析[12-17]。

Escherichia coli K12（E.coli K12）和Micrococcus luteus N19（M.luteus N19）分別是革蘭氏陰性菌與革蘭氏陽性菌代表，近年來廣泛應用于微生物生態(tài)毒理學研究[18]。本研究采用RAPD技術，研究不同阿特拉津污染脅迫對典型細菌生長狀況及基因組DNA影響，分析四種細菌基因組DNA損傷情況以及基因組DNA模板穩(wěn)定性，考查阿特拉津?qū)Φ湫图毦鶧NA損傷情況，揭示阿特拉津?qū)毦亩纠硇?；以及阿特拉津降解菌Arthrobacter sp.DNS10 （DNS10）和Acinetobacter sp.DNS32（DNS32）對阿特拉津耐受程度，通過比較進一步了解阿特拉津降解菌DNS10和DNS32實際應用前景。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗所用E.coli K12和M.luteus N19為東北農(nóng)業(yè)大學環(huán)境污染控制與修復研究室保藏菌種，對阿特拉津無降解能力；DNS10和DNS32是前期實驗室篩選出的阿特拉津降解菌[19-20]。

1.2 培養(yǎng)液

利用傳統(tǒng)的LB培養(yǎng)液開展相關試驗，每升LB培養(yǎng)液中含酵母膏5 g，蛋白胨10 g，NaCl 10 g，蒸餾水1 000 mL。調(diào)節(jié)培養(yǎng)pH 7.0，121℃滅菌30 min。冷卻后待用。

1.3 方法

1.3.1 試驗設計

將供試菌株E.coli K12、M.luteus N19、DNS10 和DNS32接入30 mL LB培養(yǎng)基中，于30℃，120 r·min-1條件下進行預培養(yǎng)12 h，離心收集上述四種供試菌株菌體細胞，重懸于無菌蒸餾水中，利用紫外分光光度計（TU-1800 SPC，北京普析）調(diào)節(jié)菌液OD600值為0.9。按1%（V/V）接種量接種到新液體LB培養(yǎng)基中，加入適量阿特拉津（純度≥97%，山東省農(nóng)藥研究中心）丙酮溶液，使其在培養(yǎng)液中阿特拉津濃度分別為25、50、75、100和125 mg·L-1，同時設不添加阿特拉津的樣品為空白處理，每個濃度處理設3組重復，將上述所用樣品于30℃，120 r·min-1條件下繼續(xù)培養(yǎng)，分別在阿特拉津加入后24 h取樣，進行基因組DNA提取。

1.3.2 細菌生長情況測定

測定600 nm波長下培養(yǎng)液吸光值，即OD600。

1.3.3 細菌DNA提取

細菌總DNA提取采用CTAB法進行：取1.5 mL菌液，10 000 r·min-1離心10 min，去上清液；加入500 μL TE懸浮菌體，37℃水浴15 min。加入30 μL SDS（10%），3 μL蛋白酶K（20 μg·mL-1），混勻37℃水浴1 h，加入100 μL NaCl（5 mol·L-1），8 μLCTAB/NaCl溶液，混勻，65℃水浴10 min，用等體積酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1）抽提2次，加500 μL異丙醇，顛倒混勻，-20℃靜止20 min，10 000 r·min-1離心5 min，DNA沉淀用70%乙醇漂洗后，晾干，溶解于50 μL TE，加入1 μL RNase。37℃水浴30 min。0.6%瓊脂糖凝膠電泳（JY1000C電泳儀，北京君意東方電泳設備有限公司）進行檢測，-20℃保存。

1.3.4 RAPD分析

借助PCR儀（東勝龍PCR儀，北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司）對上述不同處理條件下培養(yǎng)菌株基因組DNA進行RAPD分析。RAPD反應體系采用25 μL體系，體系包括：2 μL DNA模板、2 μL引物（10 mmol·L-1）、0.5 μL dNTPs（10 μmol·L-1）、2.5 μL 10×Taq Buffer（500 mmol·L-1Tris-HCl；100 mmol·L-1KCl；15 mmol·L-1MgCl2；1%Tritonx-100）、0.6 μL Taq DNA聚合酶（2.5 U·μL-1）和17.4 μL ddH2O。反應程序為：94℃預變性5 min，94℃變性1 min，37℃退火40 s，72℃延伸90 s，40個循環(huán)，最后在72℃充分延伸10 min。反應產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳分離，溴化乙錠EB染色，凝膠數(shù)碼成像系統(tǒng)（Gel DOCTMXR+，美國BioRad）檢測。

本試驗所用引物購自上海生物工程技術有限公司，用40個S系列引物對四種細菌基因組DNA進行擴增，篩選出10條能擴增出帶型清晰、重復性好的引物進行正式試驗（見表1）。

表1 試驗所篩選的隨機引物序列Table 1 Sequences of 10 primers used in this experiment

1.3.5 基因組模板穩(wěn)定性

基因組模板穩(wěn)定性（GTS，%）可定性衡量RAPD圖譜的變化趨勢。基因組DNA模板穩(wěn)定性計算公式為GTS（%）=（1-a/n）×100%。其中“a”是處理產(chǎn)生的多態(tài)性條帶，即與對照組相比缺失或增加的條帶，“n”是在對照組總條帶的數(shù)目[21]。

2 結(jié)果與分析

2.1 阿特拉津污染脅迫對典型細菌生長速度的影響

通過測定OD600反映細菌生長情況如圖1所示，在阿特拉津污染脅迫條件下，菌株E.coli K12 和M.luteus N19生長速度低于阿特拉津降解菌DNS10和DNS32，并且OD600隨阿特拉津濃度增加呈下降趨勢。而阿特拉津降解菌在阿特拉津濃度為125 mg·L-1污染脅迫下，生長速度與無阿特拉津組相比變化不大。此結(jié)果說明阿特拉津降低菌株E.coli K12和M.luteus N19生長速度，并且與阿特拉津污染脅迫濃度呈正相關效應，而即使在阿特拉津濃度為125 mg·L-1條件下，對菌株DNS10和DNS32生長速度影響不大。

圖1 四種細菌在阿特拉津污染脅迫下的生長情況Fig.1 Atrazine induced growth inhibition of four kinds of tested strains

2.2 典型細菌基因組DNA隨機擴增多態(tài)性分析

2.2.1 菌株DNS10基因組多態(tài)性分析

將所得電泳圖片用軟件Quantity one 4.6.2進行分析結(jié)果顯示，在無阿特拉津添加條件下（對照處理），菌株DNS10基因組DNA共擴增出63個RAPD條帶，分子大小從158 bp（S236）到3 545 bp （S43）。阿特拉津脅迫濃度為25 mg·L-1處理組，DNS10基因組DNA的RAPD譜帶在數(shù)目上與對照相比，無明顯變化，在所選取的10個引物中，僅引物S236新增1條2 285 bp譜帶。在阿特拉津濃度為50、75、100和125 mg·L-1處理下，各產(chǎn)生5條多態(tài)性條帶（與對照相比增加或減少的譜帶，a+b），總譜帶變化（a+b+c+d），分別為28、30、26和28。此結(jié)果說明，在一定阿特拉津污染濃度范圍內(nèi)，菌株Arthrobacter sp.DNS10基因組DNA多態(tài)性較穩(wěn)定。

2.2.2 菌株DNS32基因組多態(tài)性分析

將對照組Acinetobacter sp.DNS32基因組DNA進行RAPD擴增，10個引物共擴增出70條譜帶，條帶分子大小為146 bp（S205）～2 939 bp（S261）。阿特拉津污染脅迫濃度為25、50、75、100和125 mg·L-1，產(chǎn)生多態(tài)性條帶分別為3、7、9、12和13，基因組發(fā)生變化的總譜帶數(shù)目分別為24、28、31、31和40條，均隨阿特拉津污染脅迫濃度增大而逐漸增多，呈正相關效應。

2.2.3 菌株E.coli K12基因組DNA多態(tài)性分析

將菌株對照組E.coli K12基因組DNA進行RAPD擴增，10個引物共擴增出67條譜帶，分子大小為116 bp（S205）～3 204 bp（S2045）。如表2所示，阿特拉津污染脅迫下E.coli K12基因組DNA的RAPD指紋圖譜在條帶數(shù)目及強度方面均發(fā)生明顯變化。與對照組相比，隨阿特拉津濃度升高，RAPD擴增得到的多態(tài)性譜帶呈先增高后降低趨勢，且在100 mg·L-1時達到最大。在試驗所選的5個濃度梯度下，產(chǎn)生的多態(tài)性條帶分別為19、19、24、29和28條。同時可以看出，基因組發(fā)生變化的總譜帶數(shù)目也隨阿特拉津處理濃度增大而逐漸增多，呈正相關效應。表明隨阿特拉津濃度升高對大腸桿菌基因組DNA的損傷效果逐漸增強。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，不同阿特拉津濃度污染脅迫下，經(jīng)10條引物擴增后，消失的條帶數(shù)均多于增多的條帶數(shù)。由此得出阿特拉津污染脅迫造成菌株E.coli K12基因組DNA損傷，降低基因豐富度。

表2 阿特拉津污染脅迫下E.coli K12基因組DNA的多態(tài)性變化Table 2 Change of DNA polymorphism of genome in E.coli K12 under atrazine

對阿特拉津污染脅迫條件下E.coli K12產(chǎn)生的RAPD多態(tài)性譜帶分子大小進行分析（見表3）。在阿特拉津濃度為25和50 mg·L-1脅迫條件下，10條引物擴增后雖然產(chǎn)生相同數(shù)目的多態(tài)性條帶，但產(chǎn)生條帶的引物及條帶分子大小存在差異。由此可知，不同引物可以檢測出DNA一級結(jié)構(gòu)上不同位點損傷。并且新增條帶分子大?。? 000 bp的條帶居多，尤其在濃度為100 mg·L-1時，在所增加的12條譜帶中，僅有引物S247擴增出1條532 bp譜帶，其他11條譜帶分子大小均在1 000 bp以上。

表3 E.coli K12基因組DNA的RAPD多態(tài)性譜帶及其譜帶的分子大小Table 3 Molecular sizes（base pair,bp） of appearance and disappearance of bands in atrazine treated E.coli K12

2.2.4 M.luteus N19基因組DNA多態(tài)性分析

將對照組進行RAPD擴增，10個引物共擴增出69條譜帶，分子大小為105 bp（S8）～3 792 bp（S236），在阿特拉津濃度為25 mg·L-1時，與對照組相比，新增條帶數(shù)目與消失條帶數(shù)目相等。當濃度升高到50和75 mg·L-1時，新增條帶數(shù)目均高于消失條帶數(shù)目，繼續(xù)提高阿特拉津濃度為100和125 mg·L-1時，新增條帶數(shù)目低于消失條帶數(shù)目，同時在阿特拉津濃度為100 mg·L-1時，多態(tài)性條帶數(shù)目最多為26條。在總變化譜帶方面，5個處理組分別為36、50、54、55和59條，呈現(xiàn)劑量-效應關系。不同引物RAPD擴增結(jié)果見表4。

對阿特拉津污染脅迫條件下M.luteus N19產(chǎn)生的RAPD多態(tài)性譜帶分子大小進行分析（見表5），不同濃度阿特拉津脅迫下，產(chǎn)生或缺失條帶分子大小相似度較高，且分布無規(guī)律。

表4 阿特拉津污染脅迫下M.luteus N19基因組DNA的多態(tài)性變化Table 4 Change of DNA polymorphism of genome in M.luteus N19 under atrazine

表5 M.luteus N19基因組DNA的RAPD多態(tài)性譜帶及其譜帶分子大小Table 5 Molecular sizes(base pair,bp)of appearance and disappearance of bands in atrazine treated M.luteus N19

2.3 基因組模板穩(wěn)定性

經(jīng)分析計算基因組模板穩(wěn)定性得到結(jié)果為，DNS10為98.4%（25 mg·L-1）和92.1%（50、75、100 和 125 mg·L-1）； DNS32為 95.7%、90.0%、87.1%、82.9%和81.4%；E.coli K12為71.7%、74.6%、61.2%、52.3%和58.2%；M.luteus N19為79.1%、65.7%、68.7%、61.2%和68.7%。由此可見，E.coli K12和M.luteus N19基因組DNA損傷最嚴重發(fā)生在阿特拉津濃度為100 mg·L-1情況下，并且革蘭氏陰性菌E.coli K12 DNA受損傷程度高于革蘭氏陽性菌M.luteus N19。

由圖2可知，阿特拉津污染脅迫并未對阿特拉津降解菌DNS10和DNS32產(chǎn)生明顯的DNA損傷，在所測阿特拉津濃度范圍內(nèi)，二者基因組模板穩(wěn)定性均在80%以上，并且DNS10穩(wěn)定性高于DNS32。

圖2 Arthrobacter sp.DNS10、Acinetobacter sp.DNS32、E.coil K12和M.luteus N19基因組DNA穩(wěn)定性Fig.2 Comparison of genomic DNA template stability of four bacteria exposed to different atrazine concentration

3 討論與結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)不同濃度阿特拉津污染脅迫后，E.coli K12和M.luteus N19生長速度受抑制，四種細菌RAPD譜帶均發(fā)生變化，通過計算四種細菌基因組穩(wěn)定性，證明阿特拉津污染脅迫造成E. coli K12和M.luteus N19毒害作用并產(chǎn)生基因組DNA損傷。

Liu等研究重金屬鎘污染對大麥種子基因組DNA的影響，分析認為多態(tài)性條帶產(chǎn)生有以下幾種原因：①引物結(jié)合位點DNA損傷或DNA聚合酶與損傷DNA間相互作用。②由于遺傳重組導致寡聚核苷酸引物結(jié)合位點改變。③DNA結(jié)構(gòu)改變（堿基丟失、突變或同源重組）后新的DNA序列成為引物的新結(jié)合位點，導致新條帶出現(xiàn)[22]。Atienzar等研究認為，新增條帶也可能與自身DNA損傷程度、修復和復制有關[23]。研究發(fā)現(xiàn)，在處理組與對照組存在許多共有條帶，耿芳在研究鈾尾礦浸出液對斑馬魚DNA損傷的RAPD分析中將其稱為特征性條帶，并認為其代表斑馬魚群體DNA共同特征[24]。Theodorakis等通過對核素脅迫下蚊魚DNA損傷研究將RAPD指紋圖譜中出現(xiàn)頻率很高的譜帶，稱為污染指示帶，并通過Southern雜交分析認為，污染指示帶在序列和長度上保守[25]。

本研究表明，阿特拉津污染脅迫造成E.coli K12 和M.luteus N19生長速度緩慢及基因組DNA損傷，早期研究表明阿特拉津污染脅迫可誘導細菌產(chǎn)生氧化應激反應，導致菌體代謝失衡[26]。由此可見，E. coli K12和M.luteus N19在阿特拉津污染脅迫條件下，通過產(chǎn)生過多的活性氧自由基造成DNA損傷，產(chǎn)生遺傳毒性。本研究揭示阿特拉津降解菌Arthro?bacter sp.DNS10和Acinetobacter sp.DNS32在阿特拉津脅迫條件下，仍具有較高生長速度和基因組穩(wěn)定性。證明阿特拉津降解菌Arthrobacter sp.DNS10 和Acinetobacter sp.DNS32適于對阿特拉津污染土壤生物修復，應用前景良好。

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Application of RAPD to detect atrazine induced DNA damage in typical bacterial cells

ZHANG Ying,LU Yingying,JIANG Zhao,SHAN Dexin,CAO Bo,

Kehinde O.Erinle(School of Resource and Environmental Sciences,Northeast Agricultural University, Harbin 150030,China)

The random amplified polymorphic DNA(RAPD)assay was used to detect the DNA damage induced by different concentrations of atrazine(0-125mg·L-1)inArthrobactersp.DNS10(DNS10), Acinetobactersp.DNS32(DNS32),Escherichia coliK12(E.coliK12)andMicrococcus luteusN19(M. luteusN19),respectively.DNS10 and DNS32 which were isolated from soil could degrade atrazine effectively.The results revealed a reduction in viability ofE.coliK12 andM.luteusN19 with increasing atrazine concentration.Among the 40 test RAPD primers used in this study,only 10 primers obtained specific and stable polymorphic band for all the bacteria.The changes occurring in RAPD profiles ofE.coli K12 andM.luteusN19 exposed to atrazine included variation in band intensity,loss of normal bands and appearance of new bands compared with the control bacteria.The genomic template stability(GTS)ofE. coliK12 andM.luteusN19 were 52.3%and 61.2%with the atrazine concentration of 100 mg·L-1.At the same concentration GTS was 82.9%of DNS32,92.1%of DNS10.The results demonstrated that atrazinecaused DNA damage inE.coliK12 andM.luteusN19.Atrazine-degrading bacteria DNS10 and DNS32 had relatively high tolerance to atrazine stress,suitable for the bio-degradation of atrazine.

random amplified polymorphic DNA(RAPD);atrazine;bacteria;genotoxicity;DNA damage

S828.5

A

1005-9369（2015）05-0060-08

2014-04-08

國家科技重大專項（2012ZX07201003）

張穎（1972-），女，教授，博士，博士生導師，研究方向為環(huán)境污染的生物修復。E-mail:zhangyinghr@hotmail.com