李四軍柳柯唐嗣泉楊仕明

1川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，四川省南充市文化路63號

2中國人民解放軍總醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科耳鼻咽喉研究所

小鼠耳蝸內(nèi)外毛細胞胞吞功能的實驗研究

李四軍1柳柯2唐嗣泉1楊仕明2

1川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，四川省南充市文化路63號

2中國人民解放軍總醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科耳鼻咽喉研究所

目的研究小鼠內(nèi)外毛細胞胞吞功能的異同，探討毛細胞胞吞功能與動物聽功能之間的關(guān)系。方法選擇出生后1月齡的正常C57BL/6J小鼠耳蝸基底膜在體外培養(yǎng)，以染料FM1-43為胞吞示蹤劑，應用活細胞成像技術(shù)觀察耳蝸內(nèi)外毛細胞胞吞現(xiàn)象。結(jié)果 內(nèi)毛細胞的胞吞活動主要集中在細胞底部及核下區(qū)，而外毛細胞的胞吞活動則主要集中在核上區(qū)和外側(cè)壁區(qū)。而且，在不同的觀察時間點上，內(nèi)毛細胞對FM1-43的攝入量均顯著高于外毛細胞(P<0.05)。結(jié)論內(nèi)毛細胞的胞吞活動集中出現(xiàn)在細胞底部及核下區(qū)，說明這種胞吞活動與內(nèi)毛細胞帶狀突觸的功能密切相關(guān)；外毛細胞的胞吞活動主要出現(xiàn)在核上區(qū)及細胞外側(cè)壁，表明這種活動更多參與了外毛細胞纖毛及離子通道。內(nèi)毛細胞比外毛細胞具有更強大的胞吞功能，表明內(nèi)毛細胞在聽功能的發(fā)育和維持中發(fā)揮著更為關(guān)鍵的作用。

胞吞；內(nèi)外毛細胞；FM1-43；突觸

聽覺的發(fā)育和維持與從耳蝸到聽覺中樞整個傳導通路的完整性密切相關(guān)。在聽覺的傳導和感知過程中，耳蝸外毛細胞主要負責聲音的放大和機電轉(zhuǎn)化作用[1],而內(nèi)毛細胞則主要承擔著突觸囊泡向突觸間隙的釋放和激發(fā)突觸后興奮性反應的功能。這種神經(jīng)興奮活動向聽覺中樞傳導的同步性和一致性是聲音編碼的核心任務之一。在聲音的編碼過程中，耳蝸內(nèi)毛細胞和聽神經(jīng)末梢之間形成的突觸結(jié)構(gòu)發(fā)揮著十分關(guān)鍵的作用，這個突觸結(jié)構(gòu)又被稱為帶狀突觸[2，3，4]。先前的研究表明，內(nèi)毛細胞帶狀突觸和內(nèi)毛細胞的胞吞作用關(guān)系密切，似乎說明內(nèi)毛細胞在胞吞作用中具有更加獨特的表現(xiàn)以適應聲音編碼的需要[5，6]。然而，在聲音的傳導和編碼過程中，內(nèi)外毛細胞的胞吞功能是否具有顯著的區(qū)別呢？如果兩者間確實存在顯著差別，那么這種差別又具有什么意義呢？到目前為止，學術(shù)界對于上述問題并沒有十分明確的答案。為了解釋上述疑問，本研究擬應用活細胞成像技術(shù)對小鼠耳蝸內(nèi)外毛細胞的胞吞作用進行動態(tài)觀察和比較，以探討內(nèi)外毛細胞在聽力發(fā)育及成熟過程中的不同作用。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

選擇健康的小鼠C57BL/6J（生后1月齡SPF級），雌雄不限，由中國軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心提供。本動物實驗研究已通過中國人民解放軍解放軍總醫(yī)院和川北醫(yī)學院實驗動物倫理委員會的批準。苯乙烯染料FM1-43（invitrogen），0.25%胰酶（hy?clone）,L-15培養(yǎng)基（gibco）,PBS(天津灝洋生物公司)，F(xiàn)BS（invitrogen），F(xiàn)12培養(yǎng)基（gibco）。

1.2儀器與設(shè)備

活細胞檢測儀（Deltavision英國公司），解剖顯微鏡（olympus公司）。

1.3實驗方法

1.3.1動物取材

實驗用小鼠酒精消毒，充分麻醉后斷頸，快速正中剪開顱骨，去除腦組織，取出兩側(cè)聽泡置于盛有L-15培養(yǎng)基中；于在解剖顯微鏡下快速取出耳蝸，分離耳蝸聽泡殼與耳蝸器官，分離基底膜與螺旋韌帶連接處，操作過程中注意保護內(nèi)外毛細胞，最終留下基底膜置于PBS中。

1.3.2實驗步驟

①毛細胞分離：將分離好的基底膜放置于0.25%胰酶液中2min，將帶有10%FBS培養(yǎng)基終止消化2min,以PBS液漂洗（3次，每次2min）,加入F12培養(yǎng)基分離的毛細胞中靜置10min。②內(nèi)外毛細胞的定位：將分離的毛細胞培養(yǎng)皿置于倒置活細胞儀下，用高倍（100 X）光學顯微鏡快速找到內(nèi)外毛細胞并定位（根據(jù)毛細胞的纖毛和核位置以及內(nèi)外毛細胞的形態(tài)）。③染色與活細胞顯微鏡觀察儀：于拍攝前配好濃度為1.3mmol/L FM1-43混合液，拍攝開始后加入FM1-43混合液,活細胞顯微鏡100×油浸物鏡下及動態(tài)拍攝，激發(fā)光波長FITC 488 nm,對所觀察的內(nèi)外毛細胞連續(xù)動態(tài)觀察，掃描時間間隔10s。

1.4統(tǒng)計方法

計量資料以均值±標準差（±SD）來表示,不同時間點的內(nèi)外毛細胞胞吞熒光值采用t檢驗。所有數(shù)據(jù)輸入SSPSS17.0，P值<0.05為組間差異具有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

在本實驗中，胞吞活動通過FM1-43的綠色熒光強度來表示。我們發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)M1-43的熒光信號在內(nèi)毛細胞的頂端快速出現(xiàn)(圖1a)；進一步，隨著時間的延長，F(xiàn)M1-43熒光信號強度在內(nèi)毛細胞基底部和突觸釋放活躍結(jié)構(gòu)區(qū)域也顯著增強（圖1b,c,d）；在120秒時間點，我們發(fā)現(xiàn)整個內(nèi)毛細胞胞膜均顯示出熒光信號，而在內(nèi)毛細胞基底部及突觸釋放結(jié)構(gòu)區(qū)域其強度明顯增強。FM1-43熒光強度在120秒的最高峰值為445（見圖1b）。在480秒時，熒光強度最高峰值為513，且突觸釋放活躍結(jié)構(gòu)區(qū)域也顯著增強伴隨時間緩慢增加(見圖1c)。在1200秒時，內(nèi)毛細胞熒光最高峰值為588，突觸釋放活躍結(jié)構(gòu)區(qū)域熒光強度達到高峰，然而此時內(nèi)毛細胞熒光平均值增加不明顯，突觸釋放活躍結(jié)構(gòu)區(qū)域熒光強度未見增強(圖1d，表2)，表明小鼠內(nèi)毛細胞的胞吞活動在此時間點接近飽和。在本實驗中，我們測得的內(nèi)毛細胞熒光均值分別為：165.16±33.16（60s），177.63±34.02(120s)，258.17±32.33(480s)，385.25±64.06(1200s)。

另一方面，外毛細胞的胞吞實驗則顯示了完全不同的規(guī)律。FM1-43的熒光信號首先在外毛細胞胞體側(cè)膜出現(xiàn)（見圖2a）。隨著時間的延長，F(xiàn)M1-43熒光信號強度在外毛細胞細胞核上區(qū)和基底上外側(cè)區(qū)逐漸增強（見圖2b），在加入FM1-43后480秒時，外毛細胞核上區(qū)域的熒光信號明顯顯現(xiàn)。此時外毛細胞熒光信號最高峰值為319（圖2c）；1200秒時，F(xiàn)M1-43的熒光信號強度在外毛細胞核上區(qū)和基底上外側(cè)區(qū)表現(xiàn)為最強，其最高峰值為405(圖2d)，在此之后，外毛細胞的熒光信號強度不再有明顯的增加，相反其強度似乎有所減弱(圖2d，表2)。在外毛細胞中，我們測得的熒光均值分別為：132.83±15.4（60s），150.64±25.2(120s)，192.89±35.42(480s)，246.59±51.11(1200s)。通過比較內(nèi)外毛細胞FM1-43熒光值，結(jié)果顯示兩者在不同時間點均具有統(tǒng)計學差異（±SD,P<0.05，見圖3）。

圖1通過活細胞成像技術(shù)顯示的不同時間點小鼠內(nèi)毛細胞的胞吞活動由弱到強的變化趨勢。圖中綠色熒光代表FM1-43信號，綠色橢圓形狀為FM1-43標記下顯示的內(nèi)毛細胞，中間圓形淡染區(qū)域為細胞核。綠色熒光信號在核下區(qū)和細胞基底部較強。在本實驗中，a為加入FM1-43后60s,b為120s,c為480s,d為1200s。標尺=5um。

圖2活細胞成像技術(shù)顯示的外毛細胞的胞吞活動變化趨勢。圖中綠色橢圓形形狀為外毛細胞，中間圓形淡染區(qū)域為外毛細胞核。綠色熒光信號在核上區(qū)域和基底上外側(cè)區(qū)域較強。本實驗中a為加入FM1-43后60s,b為120s,c為480s,d為1200s。標尺=5um。

圖3小鼠耳蝸內(nèi)外毛細胞胞吞活動強度的比較。圖中黑色曲線代表內(nèi)毛細胞的胞吞功能（以FM1-43熒光值來表示），紅色曲線代表外毛細胞的胞吞活動。統(tǒng)計分析顯示兩者之間存在顯著性差異，內(nèi)毛細胞的胞吞能力顯著強于外毛細胞。

3　討論

耳蝸毛細胞將聲音信號轉(zhuǎn)化為電信號并向聽覺中樞傳遞過程中，需要快速和穩(wěn)定的突觸神經(jīng)遞質(zhì)釋放效率。由于每個內(nèi)毛細胞大約只有280個突觸囊泡，為了能夠?qū)崿F(xiàn)不斷循環(huán)釋放神經(jīng)遞質(zhì)的功能，內(nèi)毛細胞必須實現(xiàn)快速回收并充盈釋放后的突觸囊泡[7]。外毛細胞的作用則有所不同。它主要參與聲音放大和機電轉(zhuǎn)換作用。無論兩種毛細胞的作用有多大區(qū)別，有一點是確定無疑的，就是所有這些作用的實現(xiàn)都離不開細胞的胞吞功能的參與。根據(jù)苯乙烯類染料FM1-43作為標記胞膜的特點[7],我們可以實時追蹤突觸囊泡的胞吞及循環(huán)過程，因此利用FM-143來觀察細胞的胞吞功能目前已經(jīng)是一種十分常見的實驗方法。本實驗結(jié)果顯示，F(xiàn)M1-43的熒光信號在內(nèi)毛細胞的頂端快速出現(xiàn)，并隨著時間的延長，F(xiàn)M1-43熒光信號強度在內(nèi)毛細胞基底部和突觸釋放活躍結(jié)構(gòu)區(qū)域顯著增強。有學者認為FM1-43通過胞吞作用在內(nèi)細胞頂端快速出現(xiàn)是通過內(nèi)毛細胞基底部快速Ca2+依賴介導遞質(zhì)釋放所控制的，在內(nèi)毛細胞頂端快速內(nèi)吞作用后，驅(qū)動蛋白起著由頂端向基底部傳遞運輸?shù)淖饔肹8]。在內(nèi)毛細胞的帶狀突觸區(qū)域FM1-43熒光信號增強，表明胞吞作用可能參與了神經(jīng)遞質(zhì)囊泡的循環(huán)與釋放過程。

有研究發(fā)現(xiàn)，Clarin-1蛋白參與毛細胞頂部和基底部以及帶狀突觸的形成，敲除Clarin-1基因會影響帶狀突觸的發(fā)育成熟及穩(wěn)定，進而在突觸區(qū)域的細胞胞吞活動也受到影響在本實驗中，內(nèi)毛細胞基底部高強度的熒光信號似乎表明了內(nèi)吞作用參與了突觸囊泡的形成及維持過程[9]。而在外毛細胞中，細胞基底部的囊泡數(shù)量比內(nèi)毛細胞少[10]。這種囊泡的數(shù)量差別和分布和內(nèi)外毛細胞功能是一致的。內(nèi)毛細胞功能與聲音信號編碼和神經(jīng)遞質(zhì)釋放有關(guān)[8]。外毛細胞功能涉及聲音的主動放大和調(diào)節(jié)作用[10]。我們的實驗顯示，外毛細胞的內(nèi)吞作用主要發(fā)生在外毛細胞的頂部和側(cè)壁?？赡艿慕忉屖峭饷毎陧敳靠焖賰?nèi)吞是由Ca2+依賴所引發(fā)的，而在基底外側(cè)部是由胞外Ca2+引內(nèi)流引發(fā)的[11，12]。有報道表明，在細胞核區(qū)域胞吞轉(zhuǎn)運與機械力信號處理有關(guān)，在基底外側(cè)區(qū)域與機械信號傳導有關(guān)[13]，有研究表明：熒光染料FM1-43進入外毛細胞是通過機械力轉(zhuǎn)導通道進入細胞內(nèi)的，意味著這些染料是通過毛細胞纖毛進入細胞漿的[13]。另外一個途徑是通過TRPV1和P2X2離子通道[14]。耳毒性藥物（如氨基糖甙類藥物）進入外毛細胞的途徑較多，其中之一是通過非選擇性陽離子通道TRPA1，多途徑進入的耳毒性藥物在外毛細胞中累積從而損害外毛細胞而影響聽力[15,16,17]。研究表明，F(xiàn)M1-43與氨基糖甙類藥物可能共用了一些機械力通道進入了毛細胞[18]。也有研究表明：當FM1-43染料與氨基糖甙類藥物共同存在則可能導致耳毒性作用在一定程度上的減弱。這類研究似乎表明了細胞內(nèi)吞作用也可以作為耳毒性藥物損傷毛細胞一個重要途徑。還有研究表明:外毛細胞胞吞的信號先出現(xiàn)在外毛細胞的頂部，而溶酶體只限在外毛細胞頂部，而后轉(zhuǎn)送到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和外側(cè)壁，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是參與合成和運輸?shù)鞍鬃饔玫腫19]，說明在外毛細胞的胞吞作用也可能參與了膜和膜成分循環(huán)與補充活動，特別是一些蛋白質(zhì)，比如溶酶體轉(zhuǎn)運膜成分的補充等，這與膜蛋白生命周期短暫以及需要持續(xù)不斷的補充等特點十分吻合[13，20]。當然，上述結(jié)論在很大程度上仍然是推斷性的，更加確鑿的證據(jù)還需要今后更多的實驗加以證實。至于外毛細胞的胞吞作用是否和分布在外毛細胞頂部及外側(cè)壁的動力蛋白prestin密切相關(guān)，目前尚缺乏相關(guān)的文獻報道，兩者之間關(guān)聯(lián)性也有待進一步的研究來證明。

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Different patternsof endocytosis identified inmurine cochlear inner and outer hair cells

LISijun1，LIUKe2，TANGSiquan1，Yang Shiming2
1.DepartmentofOtolaryngology-Head and Neck Surgery,Affiliated HospitalofNorth Sichuan MedicalCollege, 63Wenhua,Road,Nanchong,Sichuan,China
2.DepartmentofOtolaryngology-Head and Neck Surgery,PLAGeneralHospital,PLA InstituteofOtolaryngology; 28 Fuxing Road,Beijing,China
Corresponding author:TANGSiquan Email:tangsiqu@126.com

Objective To report different patterns of endocytosis inmurine cochlear inner and outer hair cells(ⅠHCs&OHCs).Methods Normal C57BL/6Jmice(1month old)were used to observe different patterns of endocytosis inⅠHCsand OHCs in vitro using live cell imaging of FM 1-43.ResultsⅠntense fluorescence density of FM 1-43 indicating massive endocytosis activities was identified at the base and blow the nucleus inⅠHCs.Ⅰn contrast,major endocytosis activities in OHCs were found at or near the lateral cellular wall and above thenucleus.FM 1-43 uptake inⅠHCswashigher than that in OHCs(P<0.05).Conclusion Activeendocytosis ator near the basolateral area of theⅠHC suggests that endocytosis inⅠHCsmay involve ribbon synapse plasticity.Endocytosisactivitiesnear the lateralwalland in the supranuclear area in OHC indicate thatendocytosis in OHC involves tip-linksor iron channels.Higher levelsof FM 1-43 uptake byⅠHCsmay indicateⅠHC’s key roles in hearing developmentandmaintenance.

Endocytosis;Ⅰnnerand outerhair cell;FM 1-43;Ribbon Synapse

R764.35

A

1672-2922（2015）03-545-04

10.3969/j.issn.1672-2922.2015.03.038

國家重大基礎(chǔ)研究項目（2012CB967900;2012CB967901)；國家自然科學基金項目（31040038）；北京市自然科學基金項目（5122040）；中國博士后科學基金項目（201003779，20100470103）和四川省教育廳基金（11ZA185）

李四軍，在讀碩士研究生，研究方向：內(nèi)耳神經(jīng)生物學

李四軍和柳柯為本文并列第一作者

唐嗣泉:tangsiqu@126.com

2015-8-11 審核人：郭維維)