閆婉君，馬興聰，高曉燕，薛興歡，張淑群

(西安交通大學第二附屬醫(yī)院腫瘤病院腫瘤科，西安 710004)

乳腺癌(breast cancer)是女性最常見的惡性腫瘤之一，近年來有發(fā)病年輕及發(fā)病率上升的趨勢，嚴重威脅著女性的身心健康，轉(zhuǎn)移是晚期患者的最終階段和導致乳腺癌患者死亡的主要原因。由于傳統(tǒng)術后放化療普遍存在嚴重的不良反應，因此從天然物質(zhì)中尋找毒副作用小、安全有效的抗乳腺癌藥物成為近些年的研究熱點。黃芩素是一種廣泛使用的中草藥，具有廣泛的藥理作用，如抗菌，抗氧化，體內(nèi)外抗腫瘤，抗血栓形成，保護肝臟、心腦血管等。近年來研究表明黃芩素具有廣譜的抗腫瘤作用。近幾年研究核基質(zhì)結合蛋白(special AT rich sequence binding protein1，SATB1)在大多數(shù)實體腫瘤組織中的含量都有增加，尤其在浸潤性乳腺癌細胞中高表達。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化 (Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT)是上皮細胞獲得間質(zhì)細胞的特征，大量研究表明，EMT的發(fā)生過程和腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移特征有著密切的聯(lián)系。Wnt/β-catenin信號通路也參與乳腺癌的遠處轉(zhuǎn)移。先前的實驗已驗證黃芩素抑制SATB1蛋白的表達，阻止EMT的形成，影響Wnt/β-catenin信號通路。本研究旨在探討黃芩素(Baicalein)對人乳腺癌MDA-MB-231細胞肺轉(zhuǎn)移的影響及相關的作用機制是否與SATB1蛋白，EMT的發(fā)生Wnt/β-catenin信號通路有關?這將為黃芩素抗腫瘤的研究增添新的基礎理論依據(jù)，為尋找安全有效的抗癌藥物提供新的思路。

1 材料與方法

1．1 藥品與試劑

黃芩素購于美國Sigma公司，溶于DMSO(美國Sigma公司)并避光保存于-20℃;羥甲基纖維素鈉購于美國 Sigma公司;RPMI-1640購于美國 Hyclone;胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購自美國Gibco公司;胰蛋白酶購自Amresco公司;雙抗購于西安依科生物公司。SATB1單抗、E-cadherin單抗、Snail單抗購于美國Abacom公司;Wnt1多克隆抗體、β-catenin單抗、Vimentin單抗購于美國Cell Signaling Technology(CST)公司。山羊抗兔、抗鼠購于康為公司。SP試劑盒、DAB顯色劑購于北京中杉金橋公司。PVDF膜購于美國Millipore公司。

1．2 細胞系和實驗動物

人乳腺癌細胞系MD-MB-231購于American Type Culture Collection公司(ATCC，美國)。BALB/c雌性小鼠24只，購于西安交通大學動物實驗中心，4～8周齡，體重為16～20g;裸鼠飼養(yǎng)在SPF級環(huán)境下，恒溫22～25℃，恒濕55%～56%，應用水、飼料及實驗用品均經(jīng)滅菌、消毒處理，實驗室操作嚴格遵守無菌操作原則。

1．3 藥品配制

Baicalein用二甲基亞砜(DMSO)稀釋成100mmol/L，0．22μm 微孔濾膜過濾，分裝，-20℃保存，使用前解凍。羥甲基纖維素鈉用蒸餾水稀釋成0．5%的溶液，4℃保存。灌胃前將溶解的黃芩素懸浮于羥甲基纖維素鈉溶液里。

1．4 細胞培養(yǎng)

MDA-MB-231細胞在 RPMI1640培養(yǎng)基(含10%小牛血清及100U/L青霉素和100μg/L鏈霉素)，37℃，5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3天更換培養(yǎng)液，0．25%胰蛋白酶消化傳代。取對數(shù)生長的細胞用于后續(xù)試驗。

1．5 建立裸鼠模型與動物分組及給藥

取處于對數(shù)生長體外培養(yǎng)的MDA-MB-231高轉(zhuǎn)移乳腺癌細胞，細胞濃度調(diào)整至2×106/ml，無菌條件下，每只裸鼠經(jīng)尾靜脈注射2×105個細胞［1］。每隔一周觀察裸鼠的體重和健康狀況。將裸鼠隨機分為4組:1．空白對照組;2．黃芩素實驗組;3．黃芩素低劑量預防組;4．高劑量預防組，每組6只。按體重計算裸鼠給藥劑量，對照組、低劑量預防組和高劑量預防組于注射細胞次日開始給藥。實驗組于注射細胞一個月后給藥。實驗組100mg·(kg·d)-1，低劑量預防組50mg·(kg·d)-1，高劑量預防組100mg·(kg·d)-1。確定灌胃給藥，1次/d，對照組給予等體積生理鹽水灌飼，連續(xù)15天［2］(表1)。接種細胞8周后，將各組裸鼠脫頸處死，取肺組織，分別稱其質(zhì)量。將肺組織固定于4%的多聚甲醛，48h后在解剖顯微鏡下觀察肺組織表面灰白色結節(jié)即轉(zhuǎn)移灶和其數(shù)目(經(jīng)驗豐富的乳腺病理醫(yī)師獨立觀察標本)。

表1 動物分組及藥物干預

1．6 H-E 染色

石蠟包埋的肺組織蠟塊，切成5μm厚。經(jīng)二甲苯脫蠟和各級酒精水化后，蘇木素液染色，鹽酸乙醇水化流水沖洗，1%伊紅酒精溶液染色，蒸餾水稍洗，再經(jīng)過脫水和透明后。中性樹膠封片，進行圖像采集和分析。

1．7 免疫組化法

載玻片經(jīng)二甲苯脫蠟和各級酒精水化后，檸檬酸抗原修復液進行抗原修復，然后每張載玻片上組織滴加H2O2，37℃孵育20 min;滴加試劑 A，37℃孵育15 min;然后滴加抗體SATB1(1∶100)，Wnt1(1∶200)，β-catenin(1 ∶100)，E-cadherin(1 ∶100)，Vimentin(1 ∶50)和 Snail(1 ∶80)，4℃過夜;滴加辣根過氧化物酶標記的二抗，37℃孵育30 min;滴加試劑B，37℃孵育15 min;滴加試劑 C，37℃孵育15 min;滴加DAB，室溫顯色2 min，自來水沖洗3～5 min，蘇木素復染3 min，自來水沖洗10 min，酒精脫水二甲苯透明，中性樹膠封片，使用顯微鏡和圖像采集系統(tǒng)軟件分析。主要檢測各組裸鼠肺組織中SATB1，Wnt1，β-catenin，E-cadherin，Vimentin，Snail蛋白表達。判斷指標為:用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對照。

結果判斷:由經(jīng)驗豐富的乳腺病理醫(yī)師獨立觀察切片。SATB1，Snail蛋白的陽性表達顯示胞漿或胞核染為淡黃色至黃棕色為陽性細胞。Wnt1，β-catenin，E-cadherin，Vimentin陽性表達在細胞膜和細胞漿中，呈棕黃色顆粒．主要定位于細胞膜和細胞漿染為淡黃色至棕色為陽性細胞。表達水平按照半定量法分為3級:(-)，無表達，染色強度與背景無明顯差別;(+)，陽性細胞率＜50%，染色強度介于兩者之間;(++)，陽性細胞率＞50%，染色強多數(shù)細胞呈黃色至棕黃色［3-8］。

1．8 Western blot

按照RIPA裂解液組提取組織蛋白，測定蛋白濃度，加入4×蛋白上樣緩沖液混勻，沸水煮5min，快速降至室溫后上樣，進行SDS-PAGE電泳。濃縮膠濃度 5%，電壓 80V，分離膠濃度 10%，電壓120V。溴酚藍剛跑至凝膠最低端即可終止電泳，轉(zhuǎn)膜，PVDF膜激活后使用5%的脫脂奶粉或者5%BSA的TBST溶液中室溫封閉2h后，TBST洗膜一次15 min，孵育一抗 SATB1(1 ∶1000)，Wnt1(1 ∶1000)，β-catenin(1 ∶1000)，E-cadherin(1 ∶1000)，Vimentin(1 ∶1000)，Snail(1 ∶1000)，β-actin(1 ∶1000)4℃過夜，TBST洗膜3次，每次15 min，孵育二抗(1 ∶5000)，室溫1h，TBST 洗膜3 次，每次15 min。ECL發(fā)光液A∶B=1∶1混合，化學發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)(Syngene英國)曝光。實驗重復三次。用Image-Pro Plus 6．0軟件凝膠圖象處理系統(tǒng)分析目的條帶光密度值，其比值表示蛋白的相對表達量。

1．9 統(tǒng)計學方法

應用SSPS18．0軟件進行統(tǒng)計分析。兩組計量資料的比較采用t檢驗，多組計量資料的比較采用單因素方差分析。檢驗水準α=0．05。

2 結果

2．1 肺組織的大體標本和H-E染色

經(jīng)尾靜脈注射腫瘤細胞后，小鼠體質(zhì)穩(wěn)定，狀態(tài)良好。4%多聚甲醛固定48h后肺組織的大體標本，于體視顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)對照組的肺組織有極少量的轉(zhuǎn)移灶(短黑色箭頭)(見圖1)，實驗組和預防組未發(fā)現(xiàn)肉眼可見的轉(zhuǎn)移灶;H-E染色結果(見圖2)，對照組可見微小轉(zhuǎn)移灶，在實驗組和預防組未見明顯的微小轉(zhuǎn)移灶。

圖1 小鼠肺大體標本(A-C):對照組-A有極少量的轉(zhuǎn)移灶(短白色箭頭)，實驗組-B和預防組-C未發(fā)現(xiàn)肉眼可見的轉(zhuǎn)移灶

圖2 小鼠肺標本切片H-E染色對照組-A的H-E染色可見少量小轉(zhuǎn)移灶(黑色箭頭)(×400)，實驗組-B和預防組-C未發(fā)現(xiàn)肉眼可見的轉(zhuǎn)移灶

2．2 免疫組化結果

SATB1，Wnt1，β-catenin，Vimentin，Snail在對照組的肺組織中顯著表達(P＜0．05)，在實驗組和預防組表達降低;E-cadherin在對照組肺組織中表達降低，而在實驗組和預防組表達升高(圖3)。各抗體的表達抑制率在對照組，實驗組，低劑量和高劑量預防組的陽性細胞表達率(陽性細胞數(shù)/細胞總數(shù))具體結果見表2。各組經(jīng)統(tǒng)計學檢驗(P＜0．05)，差異具有統(tǒng)計學意義。防組高劑量(-);E-cadherin(D1-4)在實驗組和對照組肺組織中的表達(×400):在對照組表達(-)，實驗組表達(+)，預防組低劑量(+)預防組高劑量(++)。(橫向四行各代表1-對照組，2-實驗組，3-低劑量預防組，4-高劑量預防組;縱行六列各代表ASATB1，B-Wnt1，C-β-catenin，D-E-cadherin，E-Vimentin，F(xiàn)-Snail)

表2 各組蛋白的表達抑制率

圖3 免疫組化染色檢測SATB1(A1-4)，Wnt1(B1-4)，β-catenin(C1-4)，Vimentin(E1-4)，Snail(F1-4)在對照組、實驗組和預防組(低劑量和高劑量組)肺組織中的表達(×400):在對照組表達(++/+)，實驗組表達(-/+-)，預防組低劑量(+)，預

2．3 Western blot結果

結果分析(圖4)肺組織 SATB1，Wnt1，β-catenin，E-cadherin，Vimentin，Snail蛋白的表達水平，膠片掃描儀采集圖片。Image-Pro Plus 6．0測量蛋白條帶灰度值，并分別以SATB1，Wnt1，β-catenin，E-cadherin，Vimentin，Snail的目的條帶與內(nèi)參 βactin條帶灰度值得比值作為蛋白的相對表達量(表3)。結果顯示實驗組與對照組;預防組低劑量和預防組高劑量 SATB1，Wnt1，β-catenin，E-cadherin，Vimentin，Snail各蛋白表達水平與對照組比較均有顯著性差異，其中實驗組和預防組中SATB1，Wnt1，β-catenin，E-cadherin，Vimentin，Snail蛋白表達水平與對照組相比降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0．05);E-cadherin蛋白表達水平與對照組相比升高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0．05)。

表3 各組蛋白的相對表達量

注:1:對照組;2:實驗組;3:預防組低劑量組;4:預防組高劑量組

圖4 Western blot檢測對照組與實驗組;對照組，預防組低劑量和預防組高劑量肺組織中 SATB1，Wnt1，β-catenin，E-cadherin，Vimentin，Snail蛋白分析結果(A)。Western blot法檢測黃芩素下調(diào)肺組織SATB1，Wnt1，β-catenin，Vimentin，Snail和上調(diào) E-cadherin蛋白的的表達;(B，C)Western blot結果進行半定量分析 *P＜0．05，＊＊P＜0．01，采用單因素方差分析，組間兩兩依次比較所得。

3 討論

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一［9-10］，而轉(zhuǎn)移是乳腺癌進展的最后階段，同時也是乳腺癌患者高死亡率的主要原因［11-12］，導致超過90%癌癥患者死亡［13］。正常的乳腺上皮細胞通過一系列連續(xù)的變化包括細胞基因和遺傳表觀的改變與微環(huán)境的相互作用而發(fā)生惡變、侵襲、轉(zhuǎn)移［14-18］。目前對于轉(zhuǎn)移的相關機制尚未完全清楚。尋找有效的毒副作用小的抗腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移藥物，對提高乳腺癌療效、改善預后、提高生存質(zhì)量，具有重要的理論意義和臨床應用價值。中藥黃芩素是一種廣泛使用的中草藥，研究發(fā)現(xiàn)黃芩素在體內(nèi)外有廣泛的抗腫瘤的作用［15-23］，因此本研究主要在于發(fā)現(xiàn)黃芩素抑制乳腺癌細胞肺轉(zhuǎn)移的的影響機制。

國外大量的研究已經(jīng)表明，SATB1作為“基因組組織者”調(diào)控大量轉(zhuǎn)移相關基因并且在浸潤性乳腺癌高表達和促進肺骨等遠處轉(zhuǎn)移［24-26］，與Han等［1］研究結果一致。Wnt/β-catenin信號通路也參與乳腺癌的遠處轉(zhuǎn)移［27］。研究發(fā)現(xiàn)SATB1調(diào)控轉(zhuǎn)移相關基因如 c-myc［28］和 bcl-2［29］同時也被 Wnt/β-catenin 信號通路調(diào)控［30］，表明 Wnt/β-catenin 信號通路和SATB1中間有功能上的重疊。此外，在乳腺癌中SATB1調(diào)節(jié)β-catenin和Tcf-4，SATB1和βcatenin相互作用并且β-catenin結合到SATB1的靶位點［31］。同時也與 EMT 的發(fā)生密切相關［32-33］。越來越多的證據(jù)表明，EMT是許多腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移早期的一個重要的過程［34-35］。因此，我們可以假設黃芩素使通過下調(diào) SATB1的表達，阻止 Wnt/βcatenin的信號通路，從而阻止EMT的發(fā)生，進而阻止乳腺癌的轉(zhuǎn)移的發(fā)生。Gao等［36］研究發(fā)現(xiàn)黃芩素可顯著降低人乳腺癌MDA-MB-231細胞中SATB1蛋白的表達，且呈濃度依賴性，因此黃芩素可通過抑制SATB1蛋白的表達而發(fā)揮抗乳腺癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移作用。Chung等［37］的研究發(fā)現(xiàn)黃芩素在乳腺癌細胞中抑制EMT形成的發(fā)生。并且Yoshida等［38］研究也發(fā)現(xiàn)上皮的標志物如:E-cadherin和catenin的減少或者丟失可能與乳腺癌的遠處器官和淋巴結的轉(zhuǎn)移相關。Matsuda等［39］研究發(fā)現(xiàn)Wnt信號通路影響乳腺癌細胞MDA-MB-231的多個生物學性質(zhì)。Smith等［40］研究發(fā)現(xiàn)在浸潤性乳腺癌細胞 (MDA-MB-231)中ERK2通過Snail的同種型激活導致EMT的發(fā)生與細胞的遷移增加和黏附減少相關。Vimentin被稱為EMT的標志物，高表達反應了晚期乳腺癌的高浸潤性和耐藥性［41-42］。E-cadherin作為上皮的重要標志物，ElMoneim等［43］研究發(fā)現(xiàn)浸潤性導管癌病人的病情的進展和預后的重要的特點即E-cadherin的減少。E-cadherin減少可能的機制為與染色質(zhì)重組，甲基化及改建相關［44-45］。在浸潤性導管癌和各類乳腺癌細胞中，轉(zhuǎn)錄水平中CDH1啟動子的甲基化和5 CpG區(qū)的重疊被驗證與E-cadherin表達的丟失相關［46］。因其缺乏動物實驗的數(shù)據(jù)的驗證，只能在體外發(fā)揮其作用，因此本實驗通過黃芩素體內(nèi)實驗的驗證，通過建立乳腺癌動物模型，實驗免疫組化結果為 SATB1，Wnt1，β-catenin，Vimentin，Snail蛋白的表達在對照組表達(++/+)，實驗組表達(-/+-)，預防組低劑量(+)和預防組高劑量(+/+-);E-cadherin在對照組表達(-)，實驗組表達(+)，預防組低劑量(+)預防組高劑量(++)。Western blot結果為黃芩素下調(diào) SATB1，Wnt1，β-catenin，Vimentin，Snail蛋白的表達和上調(diào)E-cadherin蛋白的表達，各組蛋白表達水平差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0．05)。本實驗研究發(fā)現(xiàn)黃芩素下調(diào)乳腺癌轉(zhuǎn)移相關蛋白如SATB1，Wnt1，β-catenin，Vimentin，Snail和上調(diào) E-cadherin的表達的影響。因此結論為黃芩素抑制乳腺癌的轉(zhuǎn)移可能通過抑制 SATB1的表達，阻止Wnt/β-catenin信號通路，從而抑制 EMT的發(fā)生。進一步的驗證還需在其他乳腺癌轉(zhuǎn)移相關信號通路和基因的水平驗證SATB1、Wnt/β-catenin信號通路和EMT三者相互關系與作用在乳腺癌遠處轉(zhuǎn)移的研究。本研究設計的不足之處是未設立陽性對照，希望后續(xù)實驗設計研究中考慮并進一步的驗證本實驗的結果。乳腺癌晚期轉(zhuǎn)移的器官為肺、肝、腦、骨轉(zhuǎn)移和轉(zhuǎn)移的信號通路多種多樣，本文僅研究了乳腺癌肺轉(zhuǎn)移模型和一種信號通路，還需進一步的研究其他轉(zhuǎn)移的模型和信號通路，為黃芩素抑制乳腺癌轉(zhuǎn)移增添的理論基礎。

目前的相關研究表明，中藥黃芩素的研究僅停留在基礎研究階段，尚未開展與臨床相關的研究。本研究為黃芩素抗腫瘤轉(zhuǎn)移的研究和開展臨床試驗增添了新的基礎理論依據(jù)，為尋找安全有效的抗癌藥物提供了新的思路。

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