陳 軍，左華江，李和平，李思學(xué)，楊福全

（1.桂林理工大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，廣西桂林 541004；2.廣西科技大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，廣西柳州 545006）

隨著消費(fèi)者對(duì)健康衛(wèi)生衣著的需求與日俱增，織物的抗菌應(yīng)用成為織物市場(chǎng)發(fā)展最快的方向之一，如何進(jìn)行織物的抗菌改性從而殺滅或抑制有害微生物在織物上生長(zhǎng)的研究也日漸增加。蠶絲作為高級(jí)紡織材料，穿著柔軟舒適，兼有養(yǎng)生健體功能，但其結(jié)構(gòu)多孔疏松，在加工成織品的過(guò)程中，纖維經(jīng)多重疊加后會(huì)形成無(wú)數(shù)空隙的多層體，易吸附菌類，且其天然蛋白質(zhì)組成還利于有害微生物滋生繁殖。為了使生絲具備衛(wèi)生自潔功能，抑制有害微生物在其表面滋生繁殖，本研究考慮使用偶聯(lián)接枝法在脫膠生絲表面接入季胺鹽類抗菌聚合物PTDM。季胺鹽類抗菌聚合物被廣泛認(rèn)為具有良好且持久的抗菌性能，穿透微生物細(xì)胞膜能力強(qiáng)，穩(wěn)定性好，對(duì)皮膚刺激小，殘余毒性低等優(yōu)點(diǎn)。抗菌聚合物PTDM由馬來(lái)酸酐、甲基丙烯酸二甲基氨基乙酯、甲基丙烯酸叔丁基氨基乙酯通過(guò)自由基聚合物法合成而得，其中馬來(lái)酸酐與脫膠生絲表面含氧官能團(tuán)反應(yīng)，將三元共聚物PTDM牢固接枝在脫膠生絲表面，制備出具有高效安全的抗菌生絲。該抗菌生絲對(duì)大腸桿菌有良好的抑菌殺菌能力，是高效低毒、對(duì)環(huán)境友好的抗菌材料。

1 實(shí)驗(yàn)藥品及儀器

表1示出了實(shí)驗(yàn)藥品及生產(chǎn)廠家。

表1 實(shí)驗(yàn)藥品及生產(chǎn)廠家

本實(shí)驗(yàn)所用水均為去離子水。

DMAEMA和TBAEMA由于其結(jié)構(gòu)的特殊性易發(fā)生均聚，在存貯過(guò)程中添加了阻聚劑，實(shí)驗(yàn)時(shí)通過(guò)減壓蒸餾的方法加以提純。在減壓蒸餾時(shí)需加入CaH2，馬來(lái)酸酐提純時(shí)加入AIBN。既可除去體系中的H2O，還可防止單體在提純過(guò)程中自聚，并防止爆沸。收集餾分后密封冷藏保存待用。其他試劑均可直接使用。

表2示出了實(shí)驗(yàn)儀器及生產(chǎn)廠家。

表2 實(shí)驗(yàn)儀器及生產(chǎn)廠家

2 實(shí)驗(yàn)機(jī)理

從分子結(jié)構(gòu)上看，甲基丙烯酸二甲氨基乙酯（DMAEMA）和甲基丙烯酸叔丁基氨基乙酯（TBAEMA）都是重要的丙烯酸酯單體，二者都含有高活性的叔氨基/仲氨基，酯基和聚合性的乙烯基等可反應(yīng)性官能團(tuán)，而順丁烯二酸酐（即馬來(lái)酸酐MAH）除了具備聚合性的雙鍵外，還獨(dú)有高活性的酸酐結(jié)構(gòu)，本實(shí)驗(yàn)嘗試將這3種單體進(jìn)行共聚，制備目標(biāo)產(chǎn)品抗菌聚合物PTDM。

引發(fā)劑能使3個(gè)單體甲基丙烯酸二甲基氨基乙酯（DMAEMA）、甲基丙烯酸叔丁基氨基乙酯(TBAEMA)與馬來(lái)酸酐（MAH）產(chǎn)生自由基，單體之間再發(fā)生共聚反應(yīng)。下面反應(yīng)式中，引發(fā)劑為2,2-偶氮二異丁腈（AIBN）。引發(fā)原理如下：

M1表示甲基丙烯酸二甲基氨基乙酯，M2表示甲基丙烯酸叔丁基氨基乙酯，M3表示馬來(lái)酸酐，M1、M2、M3分子式分別為：

M1·表示M1被AIBN引發(fā)后產(chǎn)生的自由基。

M2·表示M2被AIBN引發(fā)后產(chǎn)生的自由基。

M3·表示M3被AIBN引發(fā)后產(chǎn)生的自由基。

其他反應(yīng)過(guò)長(zhǎng)過(guò)于復(fù)雜，在此不展開(kāi)討論。

3 實(shí)驗(yàn)過(guò)程

3.1 抗菌聚合物PTDM的合成

將雙頸圓底燒瓶接上導(dǎo)氣管和冷凝管后，分別加入三單體、有機(jī)溶劑（乙醇、丙酮等）和引發(fā)劑2，2-偶氮二異丁腈（AIBN），單體總濃度取0.5 mol/L，三單體DMAEMA∶TBAEMA∶MAH的摩爾比為3∶3∶2，引發(fā)劑AIBN和單體的摩爾比為0.3∶100。攪拌均勻后，通入保護(hù)氣氮?dú)?0min排除體系中的氧氣，升溫至65℃，在N2氣流中回流反應(yīng)20h。冷卻至室溫后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去部分多余溶劑，將反應(yīng)液緩緩倒入含少量阻聚劑的蒸餾水中，靜置沉淀，過(guò)濾洗滌，先在60℃普通烘箱中初步干燥24 h，再在60℃真空烘箱中干燥24h，即得抗菌聚合物PTDM，稱重，得透明略顯黃色固體23.0755g。計(jì)算PTDM產(chǎn)率，將其放入干燥器中保存。

3.2 生絲脫膠

脫膠：取適量桑蠶絲與0.05 g/L的碳酸鈉溶液混合煮沸，精煉0.5 h，再用去離子水洗滌2次，以除去殘留離子及生絲表面脫去的絲膠蛋白，得到脫膠蠶絲。重復(fù)3次脫膠操作，生絲表面的絲膠蛋白基本除盡，只剩絲素。

3.3 生絲接枝

取適量聚合物PTDM放入20mL西林瓶中，倒入20mL有機(jī)溶劑將其完全溶解，再加入1g脫膠生絲纖維，浸泡20min后將西林瓶封口,恒溫加熱一段時(shí)間。取出生絲纖維，用丙酮浸泡洗滌3次，保持80～90℃烘干3min，再置于160～170℃下反應(yīng)3 min。經(jīng)過(guò)丙酮漂洗，二浸二軋（快速浸漬，快速擠軋）后，在70℃恒溫烘干5h。計(jì)算接枝率。

式中：W0為原高聚物質(zhì)量；W1為織物抗菌整理后的質(zhì)量。

3.4 實(shí)驗(yàn)菌株、菌懸液、培養(yǎng)基的準(zhǔn)備

使用大腸桿菌（Escherichia coliATCC 25922）作為實(shí)驗(yàn)菌株。大腸桿菌無(wú)芽孢，常作為革蘭氏陰性短桿菌的代表性菌種用于各類實(shí)驗(yàn)。

營(yíng)養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基：用適量營(yíng)養(yǎng)肉湯粉末和去離子水配成濃度為18 g/L的營(yíng)養(yǎng)肉湯。在120℃滅菌20min后，存放在4℃的冰箱中備用。

TTC營(yíng)養(yǎng)瓊脂：將已滅菌的營(yíng)養(yǎng)瓊脂溶化，冷卻至60℃后，在無(wú)菌條件下將5%的TTC溶液加至營(yíng)養(yǎng)瓊脂中，使培養(yǎng)基中TTC濃度為0.05%，即得TTC營(yíng)養(yǎng)瓊脂。TTC瓊脂上的菌落計(jì)數(shù)按GB4789.28/94中7.2規(guī)定，TTC瓊脂組的菌落以呈紅色或淡紅色的點(diǎn)狀、圓狀或不規(guī)則形狀的顆?；驘o(wú)色但具有菌落特征的菌落為計(jì)數(shù)對(duì)象。

大腸桿菌菌株復(fù)蘇活化后，挑一環(huán)菌體接種至已滅菌的營(yíng)養(yǎng)肉湯中，置于轉(zhuǎn)速為150 rpm、溫度為37℃的氣浴恒溫振蕩器中培養(yǎng)18～20h，此時(shí)大腸桿菌濃度約為109CFU(colony formingunits)/mL。將菌懸液置于4℃的冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

4 共聚物PTDM的紅外譜圖分析

我們用紅外光譜儀表征了單體和共聚物的結(jié)構(gòu)，結(jié)果分別列于圖1 和圖2。這些譜圖中均檢測(cè)到DMAEMA和TBAEMA的特征吸收峰，如圖1有DMAEMA中—N(CH3)的—C—H伸縮振動(dòng)峰（2 825cm-1）和TBAEMA中—C(CH3)3骨架的振動(dòng)峰（1 230 cm-1）；而圖2中也有DMAEMA的—C—H伸縮振動(dòng)峰（2 775 cm-1）和TBAEMA中—C(CH3)3骨架的振動(dòng)峰（1 210 cm-1）。這些結(jié)果充分證明，DMAEMA和TBAEMA已成功共聚。

另外，由圖2可知，聚合后，—C——O的伸縮振動(dòng)峰由1 721 cm-1向高波數(shù)方向移動(dòng)到1 736 cm-1，而—C—O—的對(duì)稱及非對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰則分別由1 300和1 166 cm-1向低波數(shù)方向移動(dòng)到1 274和1 237 cm-1，這正與反應(yīng)相符。當(dāng)—C——C—聚合后，—C——C—與—C——O—的共軛效應(yīng)消失，使得—C——O—處的電子云密度增大，吸收峰隨之向高波數(shù)方向偏移；而—C—O—的電子云密度減小，吸收峰向低波數(shù)方向偏移。

圖1 單體D MAEMA 和TBAEMA 紅外光譜圖

圖2 共聚物PT D M 的紅外光譜圖

5 抗菌性能表征

5.1 表征方法

取0.5 g需測(cè)定的樣品與9mL濃度為4.6×106CFU/mL的菌懸液混合浸泡，在37℃、150 rmp下振蕩培養(yǎng)1 h、3 h，分別檢測(cè)1 h、3 h后菌落的生長(zhǎng)情況，采用活菌計(jì)數(shù)法測(cè)定菌濃度，與初始菌濃度對(duì)比，計(jì)算抑菌率。

代入下述公式進(jìn)行計(jì)算：

殺菌率η=（N0-N）/N0×100%

資源是圖書(shū)館提供信息服務(wù)的基石。在新媒體環(huán)境下，為了高質(zhì)量地開(kāi)展信息服務(wù)，滿足讀者多元化的信息需求，高校圖書(shū)館應(yīng)在進(jìn)行讀者調(diào)研的基礎(chǔ)上制定內(nèi)容豐富、結(jié)構(gòu)合理、載體形式多樣的館藏資源建設(shè)方案，實(shí)現(xiàn)館藏結(jié)構(gòu)、不同載體文獻(xiàn)的和諧統(tǒng)一。而民族高校圖書(shū)館也擔(dān)負(fù)著文化傳承的使命，因此在資源建設(shè)方面除了常規(guī)資源建設(shè)意外，還應(yīng)根據(jù)學(xué)校學(xué)科建設(shè)需求和民族特色文化，重點(diǎn)加強(qiáng)一批具有民族性、地域性的綜合性特色數(shù)據(jù)庫(kù)的建設(shè)，以便更好地服務(wù)于民族高校師生讀者的科研需求。并在資源構(gòu)建的基礎(chǔ)上重點(diǎn)打造知識(shí)服務(wù)產(chǎn)品，基于資源進(jìn)行知識(shí)內(nèi)容的整合和有效的關(guān)聯(lián)，以實(shí)現(xiàn)多層次、多方位、多形式的資源傳播和信息服務(wù)。

其中：η 為殺菌率（%）；N為抗菌處理后的菌濃度（CFU/mL）；N0為初始菌濃度（CFU/mL）。

5.2 聚合物PTDM抗菌能力的表征

取合成產(chǎn)率分別為76%、48%、45%和50%的聚合物PTDM（編號(hào)為①～④），研究聚合物PTDM不同濃度時(shí)對(duì)大腸桿菌的抑菌能力差異，如表3和表4所示。

表3 產(chǎn)品①～④的抗菌測(cè)試數(shù)據(jù)對(duì)比

表4 產(chǎn)品①～④的抗菌測(cè)試圖片對(duì)比

前3個(gè)產(chǎn)品①②③的濃度取0.01 g/mL和0.001 g/mL時(shí)，對(duì)應(yīng)培養(yǎng)皿上肉眼觀察不到菌落，抗菌率可達(dá)100%；第4個(gè)產(chǎn)品④的濃度取0.01 g/mL時(shí)，肉眼也觀察不到菌落，和前3個(gè)產(chǎn)品取同濃度時(shí)的抗菌率相同，但當(dāng)濃度稀釋到0.001 g/mL時(shí)肉眼可見(jiàn)70個(gè)菌落，說(shuō)明④的抗菌性低于①②③。

4個(gè)產(chǎn)品和空白試驗(yàn)進(jìn)行對(duì)照，呈現(xiàn)出抗菌性能隨濃度下降而減弱的趨勢(shì)。

4個(gè)產(chǎn)品的濃度范圍在0.01～0.001 g/mL時(shí)，對(duì)大腸桿菌顯現(xiàn)出良好的殺菌性，甚至可高達(dá)100%的殺菌率。當(dāng)濃度更低時(shí)（0.0001 g/mL），PTDM仍具有一定殺菌能力，體現(xiàn)出其低濃度殺菌性強(qiáng)的優(yōu)越性。

5.3 接枝生絲抗菌能力的表征

5.3.1 不同接枝率的抗菌生絲1 h、3 h抗菌能力的差異

抽取接枝率分別為16.8%、11.1%、5.8%、4.2%和1.4%的抗菌生絲與按上述操作準(zhǔn)備的大腸桿菌懸液浸泡（分別編號(hào)為①～⑤），經(jīng)過(guò)1 h后將反應(yīng)液稀釋若干梯度，稀釋梯度為10倍，用涂布棒均勻涂抹于按上述操作準(zhǔn)備的營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，恒溫培養(yǎng)大腸桿菌過(guò)夜，觀察菌落生長(zhǎng)情況，如圖3。

圖3 ①～⑤號(hào)樣品反應(yīng)1 h 稀釋培養(yǎng)過(guò)夜后菌落生長(zhǎng)情況

菌落數(shù)量可直接反映對(duì)應(yīng)接枝率的樣品抗菌情況，肉眼所見(jiàn)菌落越多，表明抗菌效果越差，反之亦然。圖3表明，①號(hào)、②號(hào)的平板菌落數(shù)較少，③號(hào)、④號(hào)次之，⑤號(hào)平板上長(zhǎng)滿菌落。初步判定①號(hào)和②號(hào)殺菌能力較強(qiáng)。

依然選取接枝率分別為16.8%、11.1%、5.8%、4.2%和1.4%的抗菌生絲與按上述操作準(zhǔn)備的大腸桿菌懸液浸泡（分別編號(hào)為①～⑤），經(jīng)過(guò)3 h后將反應(yīng)液稀釋若干梯度，用涂布棒均勻涂抹于按上述操作準(zhǔn)備的營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，恒溫培養(yǎng)大腸桿菌過(guò)夜，觀察菌落生長(zhǎng)情況，如圖4。

圖4 ①～⑤號(hào)樣品反應(yīng)3 h 稀釋培養(yǎng)過(guò)夜后菌落生長(zhǎng)情況

從菌落數(shù)目來(lái)看，①、④號(hào)的平板菌落數(shù)最少，②、③號(hào)平板菌落數(shù)較少，⑤號(hào)的菌落數(shù)最多。表明：①、④號(hào)抑菌效果最強(qiáng)，⑤號(hào)抑菌效果最差。

比較圖3和圖4，發(fā)現(xiàn)④號(hào)樣品浸泡3 h時(shí)比浸泡1 h時(shí)的抗菌表現(xiàn)有很大變化，前者菌落數(shù)遠(yuǎn)小于后者菌落數(shù)，表明浸泡時(shí)間增加后，滅菌能力得到更好發(fā)揮，抗菌能力增強(qiáng)，①號(hào)與④號(hào)表現(xiàn)相似，平板菌落數(shù)也隨時(shí)間增加而減少。②、③號(hào)1 h和3 h的平板菌落數(shù)基本不變，表明浸泡時(shí)間增加并沒(méi)有直接導(dǎo)致抗菌能力變化，生絲的抗菌效果有待觀察。⑤號(hào)1 h和3 h的平板菌落數(shù)均非常多，無(wú)法肉眼計(jì)數(shù)。以①號(hào)與④號(hào)樣品為代表，1 h和3 h的菌落數(shù)變化表明：接枝了聚合物PTDM的生絲接枝率與殺菌率有直接關(guān)系，當(dāng)接枝率增大時(shí)，對(duì)大腸桿菌的殺菌率也隨之上升。原因在于接枝率上升時(shí)，生絲上具有滅菌能力的N+密度也對(duì)應(yīng)增大，抗菌基團(tuán)與大腸桿菌接觸幾率增大，與菌體結(jié)合能力越強(qiáng)，季銨基團(tuán)更易穿透細(xì)胞，對(duì)大腸桿菌的殺菌能力越強(qiáng)，殺菌率越高。

5.3.2 不同接枝率的抗菌生絲抑菌率的差異

使用移液槍吸取已配制好的大腸桿菌懸液1 mL與已滅菌的9mL蛋白胨混合，梯度稀釋菌懸液，稀釋倍數(shù)為10，選取適當(dāng)濃度菌懸液0.1mL稀釋液均勻涂布在無(wú)菌瓊脂平板上，將無(wú)菌瓊脂平板置于37℃的恒溫恒濕箱中培養(yǎng)過(guò)夜，代入相應(yīng)公式：

每毫升原菌液中活菌濃度/（cfu·mL-1）=同一稀釋度菌落平均數(shù)×稀釋倍數(shù)×10

計(jì)算得：

每毫升原菌液活菌數(shù)=45.5×104×10=4550000

仍取接枝率分別為16.8%、11.1%、5.8%、4.2%、1.4%和未接枝（接枝率為0%）的抗菌生絲與配制好的大腸桿菌懸液混合浸泡，編號(hào)為①～⑥號(hào)，置于恒溫氣浴振蕩器中反應(yīng)20 h，稀釋若干倍數(shù)后，用移液槍吸取0.1mL反應(yīng)液涂在已滅菌的營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，置于37℃恒溫生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜，待長(zhǎng)出菌落后，計(jì)數(shù)及計(jì)算抗菌率，得到表4數(shù)據(jù)。

表4 不同接枝率的抗菌生絲抑菌率的差異

圖5 接枝率與抑菌率關(guān)系圖

由圖5可知，抗菌生絲的接枝率與抑菌率呈正相關(guān)。接枝率越高，對(duì)應(yīng)抗菌生絲對(duì)大腸桿菌的抑菌率越高。當(dāng)接枝率大于5.8%時(shí)，對(duì)應(yīng)抗菌生絲樣品的抑菌率可高達(dá)90%，當(dāng)接枝率在1.4%以下時(shí)，抑菌率為0。

5.3.3 接枝率不同的抗菌生絲與TTC瓊脂混合抗菌試驗(yàn)

仍取接枝率分別為16.8%、11.1%、5.8%、4.2%、1.4%和未接枝（接枝率為0%）的抗菌生絲與配制好的大腸桿菌懸液混合浸泡后，一起倒入TTC瓊脂中，編號(hào)為①～⑥號(hào)，置于37℃生化培養(yǎng)箱中過(guò)夜，待菌落產(chǎn)生后進(jìn)行觀察比較，如圖6。

圖6 ①～⑥號(hào)樣品與TT C 瓊脂混合培養(yǎng)過(guò)夜后菌落生長(zhǎng)情況

數(shù)據(jù)表明：①、②號(hào)生絲抗菌能力最強(qiáng)，在瓊脂上無(wú)菌落形成，抑菌率高達(dá)100%，表明經(jīng)接枝改性后的抗菌生絲對(duì)大腸桿菌具有良好的殺菌能力。

③號(hào)生絲對(duì)應(yīng)平板上存在少量菌落，抑菌率可達(dá)99.4%。

④號(hào)生絲對(duì)應(yīng)平板上的菌落比③號(hào)略多，表明當(dāng)接枝率僅為4.2%時(shí)，抑菌率也可達(dá)70%。

⑤號(hào)的接枝率很低，平板上菌落數(shù)比加入⑤號(hào)之前更多，表明大腸桿菌在蛋白胨培養(yǎng)基中繁殖，抑菌率為0%。

⑥號(hào)為空白試驗(yàn)，加入的是未接枝的生絲，大腸桿菌在蛋白胨培養(yǎng)基中繁殖，細(xì)菌濃度增大，無(wú)抑菌能力。

根據(jù)數(shù)據(jù)作出接枝率與抑菌率關(guān)系，如圖5。

如圖6所示：①～⑥號(hào)樣品經(jīng)處理后在瓊脂上均顯紅色。

①、②號(hào)樣品接枝率最大，對(duì)應(yīng)生絲表面略顯紅色，生絲外的平板有少量菌落，表明①、②號(hào)樣品抑菌率最好。

③號(hào)樣品對(duì)應(yīng)生絲表面呈紅色，生絲外的平板上的菌落數(shù)目比①、②號(hào)樣品多，抑菌率也低于①、②號(hào)樣品。

④、⑤、⑥號(hào)樣品對(duì)應(yīng)生絲表面呈明顯紅色，表明對(duì)應(yīng)抗菌生絲樣品抑菌能力較差，大腸桿菌附著在生絲表面不斷滋生。

6 結(jié)論

（1）由圖5可知，抗菌生絲的接枝率與抑菌率呈正相關(guān)。接枝率越高，對(duì)應(yīng)抗菌生絲對(duì)大腸桿菌的抑菌率越高。當(dāng)接枝率大于5.8%時(shí)，對(duì)應(yīng)抗菌生絲樣品的抑菌率可高達(dá)90%，當(dāng)接枝率在1.4%以下時(shí)，抑菌率為0。

（2）抗菌表征試驗(yàn)準(zhǔn)備過(guò)程需在無(wú)菌環(huán)境下培養(yǎng)細(xì)菌，杜絕其他細(xì)菌污染，生化培養(yǎng)箱保持恒溫37℃保存瓊脂平板和培養(yǎng)細(xì)菌，菌懸液和營(yíng)養(yǎng)肉湯需3℃以下保存。

（3）將抗菌劑接枝在生絲上，并進(jìn)行抗洗性實(shí)驗(yàn)，證明此法接枝生絲可獲得更為安全長(zhǎng)效的抗菌效果，有助于減少現(xiàn)代醫(yī)療中對(duì)抗生素過(guò)于依賴的情況，其抗菌過(guò)程中結(jié)構(gòu)不改變，使用一定時(shí)間后只需洗滌即可除去表面吸附的細(xì)菌殘骸，恢復(fù)其抗菌性能，可循環(huán)利用，在成本上有良好優(yōu)勢(shì)。

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