胡松梅

摘 ? ?要：以鐵皮石斛抗寒品種莖段為外植體，運用組織培養(yǎng)技術(shù)建立鐵皮石斛無性快繁體系，篩選出鐵皮石斛快繁的最佳培養(yǎng)基。結(jié)果顯示，以鐵皮石斛莖段為外植體誘導(dǎo)原球莖，最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS + 6-BA 2 mg·L-1 + NAA 0.2 mg·L-1 + IBA 0.2 mg·L-1，誘導(dǎo)率為66.67%。原球莖最佳分化培養(yǎng)基為MS + 6-BA 0.5mg·L-1 + NAA 0.2 mg·L-1 + IBA 0.1 mg·L-1 ，苗整齊健壯，葉片大而濃綠。試管苗生根的最佳培養(yǎng)基為1/2 MS + IBA 0.2 mg·L-1 + NAA 0.3 mg·L-1，生根率為100%。馴化移栽基質(zhì)為碎磚瓦15%+松樹皮50%+刨花25%+羊屎10% 。

關(guān)鍵詞：鐵皮石斛;快速繁殖;最佳培養(yǎng)基

中圖分類號：S567.23+9 ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A ? ? ? ? DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2015.12.026

Rapid Propagation of ?Dendrobium officinale Kimura et Migo

HU Song-mei

（Loudi Vocational and Technical College， Loudi， Hunan ?417000 ，China）

Abstract： Using tender stem as explant，tissue culture and plant regeneration of Dendrobium officinale Kimura et Migo have been studied. The results indicated that the protocorm could be induced from tender stem， and differentiated to regeneration plants in the proper medium. The most appropriate medium for the induction was MS + 6-BA 2 mg·L-1 + NAA 0.2 mg·L-1 + + IBA 0.2 mg·L-1 and the most appropriate medium for the differentiation of protocorm was MS + 6-BA0.5 mg·L-1 + NAA 0.2 mg·L-1 ?+ IBA0.1 mg·L-1 . ?In addition， the optimum medium for rooting was 1/2MS + IBA0.2 mg·L-1 + NAA0.3 mg·L-1. The inducing percentage of protocorm reached 66.67%and the rooting rate reached 100%.The resulted also showed that the optimum culture medium was broken tiles 15% + pine bark50% + wood shavings25% + goat dung 10%.

Key words： Dendrobium officinale Kimura et Migo; rapid propagation; proper medium

鐵皮石斛為蘭科石斛屬多年生草本植物[1]，史稱“中華九大仙草之首”，具有抗衰老、抗腫瘤、增強機體免疫力和擴張血管等作用，在臨床與中藥復(fù)方中被廣泛應(yīng)用[2]。野生鐵皮石斛主要在云南、浙江、廣東、廣西等地[3]，在湖南省新寧縣也有分布。鐵皮石斛對生境要求苛刻，一般生長在高溫多濕的熱帶、亞熱帶的高山峻嶺、懸崖峭壁及巖石縫隙之間，生長速度緩慢、自然繁殖力極低。通過組織培養(yǎng)快速繁殖鐵皮石斛是解決種苗缺乏的有效途徑[4]。

1 材料和方法

1.1 材 料

本試驗用鐵皮石斛引種自浙江雁蕩山，采用DES誘變與離體培養(yǎng)低溫脅迫相結(jié)合篩選出抗寒品種，將抗寒品種栽種于湖南省湘鄉(xiāng)縣試驗基地。

1.2 方 法

取鐵皮石斛母株1年生莖段為外植體，去葉后放入低濃度的洗衣粉水中漂洗3～5 min，用流水沖洗1 h。在超靜工作臺內(nèi)，用75%酒精浸泡30 s，放入0.1%的HgCl2溶液滅菌8 min，無菌水沖洗5～6次。將消毒好的莖段切段長約1.5～2 cm，接種于原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基，40 d時記錄誘導(dǎo)率。將原球莖增殖3次后轉(zhuǎn)接到分化培養(yǎng)基中，40 d時記錄分化率。選取高1 cm以上、長勢較一致的壯苗，轉(zhuǎn)入1/2 MS 生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根，40 d后觀察統(tǒng)計苗的生根率、平均生根數(shù)和生長狀況。將有3～4個節(jié)間、根長在3 cm以上的鐵皮石斛試管苗移入栽培基質(zhì)中，40 d后統(tǒng)計成活率。

原球莖誘導(dǎo)、增殖和分化基本培養(yǎng)基為MS，生根基本培養(yǎng)基為1/2 MS，所有培養(yǎng)基均附加10%香蕉汁、蔗糖 30 g·L-1 ，瓊脂7 g·L-1 ， pH值 5.8，培養(yǎng)溫度為24～28 ℃，光照時間為 16 h·d-1，光照強度為2 000 lx 。

在不同培養(yǎng)基中添加不同激素，各處理的濃度設(shè)計分別如下（單位為mg·L-1 ，以下皆同）。

原球莖的誘導(dǎo)培養(yǎng)基分為4個處理組合：① 6-BA 3 +NAA 1+ IBA 0.2;② 6-BA 2 + NAA 0.5 + IBA 0.2;③ 6-BA1.5 + NAA 0.2 + IBA 0.2;④ 6-BA 1 + NAA 0.2 + IBA 0.2。

原球莖的繼代培養(yǎng)基分為3個處理組合：① 6-BA 2 + NAA 0.2;② 6-BA 1 + NAA 0.2;③ 6-BA 0.5 + NAA 0.2。

原球莖的分化培養(yǎng)基分為3個處理組合：① 6-BA 2 + NAA 0.2 + IBA0.1+多效唑1;② 6-BA 1 + NAA 0.2 + IBA 0.1+多效唑1;③ 6-BA 0.5 + NAA 0.2 + IBA0.1+多效唑1;④ 6-BA 0.5 + NAA 0.2 + IBA 0.1。

生根培養(yǎng)基為3個處理組合：① IBA0.5+ NAA 0.5;② IBA0.2+ NAA 0.3;③ IBA0.1+ NAA 0.2。

馴化移栽基質(zhì)為3個處理組合：① 碎磚瓦25%+松樹皮50%+刨花15%+羊屎10%;② 碎磚瓦15%+松樹皮50%+刨花25%+羊屎10%;③ 碎磚瓦5%+松樹皮60%+刨花25%+羊屎10%。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同激素組合對鐵皮石斛原球莖誘導(dǎo)影響

以鐵皮石斛莖段為外植體，將已滅菌的外植體接種于原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基，采取不同濃度的6-BA和NAA+IBA 進(jìn)行比較試驗。不同激素組合對鐵皮石斛原球莖誘導(dǎo)的影響見表1。

表1表明，含有6-BA和NAA+IBA的激素組合中均能誘導(dǎo)出原球莖，但6-BA濃度為1 mg·L-1時，誘導(dǎo)率急劇下降。相對高濃度的6-BA對誘導(dǎo)原球莖起著關(guān)鍵作用。①號培養(yǎng)基誘導(dǎo)出的原球莖呈淡綠色，玻璃化現(xiàn)象嚴(yán)重。分析其原因，認(rèn)為細(xì)胞分裂素濃度過高時鐵皮石斛原球莖易導(dǎo)致玻璃化，在繼代增殖中生長速度快，分化時成苗率不高。③號和④號培養(yǎng)基誘導(dǎo)出的原球莖顏色鮮綠，生長狀況良好。在此培養(yǎng)基中原球莖既可以大量增殖，又可以分化成芽，能實現(xiàn)一步成苗的目的。

試驗結(jié)果表明，以鐵皮石斛莖段為外植體誘導(dǎo)原球莖，最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS + 6-BA 0.5 mg·L-1 + NAA 0.2 mg·L-1 ，誘導(dǎo)率為66.67%。

2.2 不同激素組合對鐵皮石斛原球莖繼代培養(yǎng)的影響

在誘導(dǎo)出的原球莖中，挑選長勢均一、生長狀態(tài)良好、無分化、顏色嫩綠的進(jìn)行繼代增殖培養(yǎng)，增殖控制在10代以內(nèi)。4種培養(yǎng)基均能使原球莖增殖。①號培養(yǎng)基中的原球莖呈淡綠色，玻璃化現(xiàn)象較嚴(yán)重，而且隨著繼代次數(shù)的增加，原球莖開始水漬化，玻璃化現(xiàn)象日益嚴(yán)重。③號培養(yǎng)基誘導(dǎo)出的原球莖顏色鮮綠，生長狀況良好。但繼代至5代以后，也會產(chǎn)生玻璃化，原因為6-BA有累積效應(yīng)，故應(yīng)逐步降低6-BA的含量，以減免原球莖的玻璃化。根據(jù)原球莖的生長狀況調(diào)節(jié)6-BA的含量，最低使用量為0.2 mg·L-1。40～50 d繼代1次，每次增殖倍數(shù)控制在7～8倍左右為宜。在③號培養(yǎng)基中如果繼代時間過長，會形成分化，但分化苗不能整齊一致，影響生根培養(yǎng)。

試驗結(jié)果表明，在5代之內(nèi)，鐵皮石斛原球莖繼代培養(yǎng)最佳養(yǎng)基為MS + 6-BA 0.5 mg·L-1 + NAA 0.2 mg·L-1 。5代之后要逐步降低6-BA的含量。

2.3 不同激素組合對鐵皮石斛原球莖分化影響

當(dāng)原球莖達(dá)到一定量后接種于分化培養(yǎng)基的3個處理組合中，培養(yǎng)40 d，均能分化成苗。①、②號培養(yǎng)基既能使原球莖增殖，也能誘導(dǎo)它分化，但原球莖增殖大于分化。苗瘦弱，常有玻璃苗。③號培養(yǎng)基成苗率可達(dá)90%以上，原球莖增殖程度低，且苗健壯整齊，葉片大而濃綠，④號培養(yǎng)基與前三種培養(yǎng)基相比苗不整齊，每瓶苗中的分化苗差異顯著，故在鐵皮石斛原球莖分化中，添加適量的多效唑可促使分化苗整齊一致，這對提高生根培養(yǎng)的接種速度至關(guān)重要。

試驗結(jié)果表明，③號培養(yǎng)基MS + 6-BA 0.5 mg·L-1 + NAA 0.2 mg·L-1 ?+ IBA0.1 mg·L-1 + 多效挫1 mg·L-1 為鐵皮石斛原球莖分化的最佳培養(yǎng)基。

2.4 不同激素組合對鐵皮石斛試管苗生根影響

不同激素組合對鐵皮石斛試管苗生根的影響見表2。

表2數(shù)據(jù)表明，鐵皮石斛試管苗較易生根，生根率達(dá)100%，但生根數(shù)量少，平均為3～4根。①號培養(yǎng)基中高濃度的生長素會抑制植物的向上生長，從而導(dǎo)致鐵皮石斛植株生長緩慢，節(jié)間縮短，延長了育苗時間，且移栽成活率相對較低。②號培養(yǎng)基生長素濃度適中，植株粗壯，生長迅速，根粗壯，移栽成活率相對較高。在②號培養(yǎng)基中添加1 mg·L-1的活性炭可以吸附有害物質(zhì)，生根速度更快。

試驗結(jié)果表明：鐵皮石斛組培苗的最佳生根培養(yǎng)基為1/2 MS + NAA 0.3 mg·L-1 + IBA 0.2 mg·L-1，生根率為100%。在此培養(yǎng)基中培養(yǎng)20 d 左右試管苗開始生根，40 d 左右長出3～4 條長約 1.5 cm、粗約0.15 cm的白色肉質(zhì)根。

2.5 試管苗的移栽馴化

試管馴化移栽前將瓶苗移至大棚煉苗3～5周，遮光率為70%，使試管苗莖段肥厚粗壯且莖干稍硬化。這樣試管苗從恒溫高濕的環(huán)境向開放變化的環(huán)境過渡，可以慢慢適應(yīng)自然溫濕度[5-8]。出瓶前，先將瓶蓋打開并在室外放置，讓其適應(yīng)自然溫濕度。2～3 d后將小苗輕輕取出，洗掉組培苗根部的瓊脂，用800倍多菌靈藥液浸泡10～15 min。將組培苗采取架空栽培的方式使用3種移栽基質(zhì)進(jìn)行試驗。①、②、③號移栽基質(zhì)的成活率分別為85.7%，96.2%，94.3%。①號基質(zhì)保水性能較差，根部固定不牢固，噴灌易倒伏。②、③號基質(zhì)成活率差異不顯著，從生產(chǎn)成本考慮，故大規(guī)模移栽時選擇②號移栽基質(zhì)。

3 結(jié)論與討論

鐵皮石斛可通過原球莖和叢生芽進(jìn)行增殖，莖段產(chǎn)生的叢生芽粗壯，成苗率高，移栽成活率也高，但增殖系數(shù)少。原球莖增殖系數(shù)高，但苗易玻璃化。

生根培養(yǎng)基中不放激素時移栽成活率相對較高，但培養(yǎng)時間相應(yīng)延長。生根培養(yǎng)基中可添加5%～10%的土豆、紅薯、香蕉汁，可促進(jìn)壯苗，試管苗更健壯。

參考文獻(xiàn)：

[1] 國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典（2005年版，一部）[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：62.

[2] 張貴君.中藥鑒定學(xué)[M].北京：科學(xué)出版社，2002：9.

[3] 中國科學(xué)院植物志編輯委員會.中國植物志[M].北京：科學(xué)出版社，2006（19）：117.

[4] 斯金平，諸燕，朱玉球.鐵皮石斛人工栽培技術(shù)研究與應(yīng)用進(jìn)展[J].浙江林業(yè)科技，2009（6）： 66-70.

[5] 黃松，劉星華，劉宏源，等.鐵皮石斛野生轉(zhuǎn)家栽規(guī)范化種植（GAP）研究與產(chǎn)業(yè)化基地建設(shè)[J].世界科學(xué)技術(shù)：中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2010（1）：125-139.

[6] 楊小兵，王增利，史昊，等.光強對懸浮培養(yǎng)下鐵皮石斛原球莖生長的影響[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014（1）：116-119.

[7] 侯甲男，王政，尚文倩，等.CCFL光源不同光質(zhì)比對鐵皮石斛原球莖增殖及試管苗生長的影響[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013（1）：86-89，101.

[8] 袁正仿，張?zhí)K鋒，遠(yuǎn)凌威.鐵皮石斛高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)栽培技術(shù)[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2004（2）：49.