趙良元，陶晶祥，劉 敏

(長(zhǎng)江科學(xué)院a.流域水環(huán)境研究所;b.流域水資源與生態(tài)環(huán)境科學(xué)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430010)

1 研究背景

根際環(huán)境是指植物根周圍幾微米到幾毫米的微觀界面，是植物根系－環(huán)境－根際微生物相互作用的場(chǎng)所［1－2］。植物根系可為微生物提供大量繁殖的附著環(huán)境，根際釋放的氧氣可提高微生物的新陳代謝［3－4］，根系向外界環(huán)境(土壤、水體、沉積物)中分泌根系分泌物可為根際微生物提供豐富的營(yíng)養(yǎng)及碳源，不同的根系分泌物又會(huì)產(chǎn)生不同的根際微生物群落結(jié)構(gòu)［5］。因此，在植物根際環(huán)境中有著較為豐富的微生物數(shù)量，較強(qiáng)的微生物活力以及與非根際環(huán)境相比顯著差異的微生物群落結(jié)構(gòu)［2，4］。

以植物根際微生物降解為主要機(jī)制的植物修復(fù)技術(shù)以其綠色、原位、可持續(xù)的修復(fù)特點(diǎn)成為近年來(lái)環(huán)境修復(fù)領(lǐng)域的熱點(diǎn)技術(shù)［6］。目前，大量研究報(bào)道了有機(jī)污染土壤或沉積物植物修復(fù)過(guò)程中根際微生物發(fā)揮的重要作用，如在多環(huán)芳烴、石油類污染物、多氯聯(lián)苯等有機(jī)污染物的修復(fù)過(guò)程中，修復(fù)植物根際微生物數(shù)量及活力提高了數(shù)倍至數(shù)十倍，根際效應(yīng)明顯［7－9］。同時(shí)，植物可改變土壤或沉積物中的微生物群落結(jié)構(gòu)，使得可以降解有機(jī)污染物的特定微生物類群大量繁殖。因此，研究植物根際微生物群落多樣性對(duì)于揭示植物根際效應(yīng)機(jī)制尤為重要。

目前，關(guān)于微生物群落多樣性研究多集中在有機(jī)及無(wú)機(jī)污染物對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響方面［10－11］，而關(guān)于植物修復(fù)過(guò)程中微生物的研究主要集中在微生物數(shù)量及活力研究［6－9］，對(duì)于有機(jī)及無(wú)機(jī)污染土壤/沉積物的植物修復(fù)過(guò)程中植物對(duì)土壤或沉積物微生物群落多樣性的研究較少。本試驗(yàn)采用可用于分析整個(gè)微生物群落、表征微生物群落的功能潛力的方法——Biolog分析技術(shù)［12］，以挺水植物菖蒲(Acorus calamus L.)為對(duì)象，研究了水生植物對(duì)沉積物微生物群落功能多樣性的影響，為揭示水生植物對(duì)水環(huán)境沉積物的根際效應(yīng)機(jī)制提供一定的科學(xué)依據(jù)。

2 材料與方法

2.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)所用沉積物采自本地湖泊，為砂質(zhì)沉積物。水生植物為野外湖泊采回并馴化后的菖蒲(Acorus calamus L.)，選取15～30 cm的幼株作為試供植物。試驗(yàn)所使用的儀器為美國(guó)Biolog公司生產(chǎn)的GEN III MicroStation自動(dòng)快速微生物鑒定系統(tǒng)，微生物碳源測(cè)定板為Biolog Eco板(生態(tài)板)。

2.2 根際效應(yīng)試驗(yàn)

沉積物經(jīng)預(yù)風(fēng)干、研磨、過(guò)篩后，選取0.3～0.5 mm的粒度沉積物作為試驗(yàn)用沉積物，定量稱取15 kg試驗(yàn)用沉積物至水生植物培養(yǎng)箱內(nèi)(0.5 m×0.4 m ×0.6 m)，加入自來(lái)水后放置 3～4 d，待沉積物有一定的硬度后再將初始株高一致(約30 cm)的菖蒲移栽入試驗(yàn)的培養(yǎng)箱中，每個(gè)培養(yǎng)箱中種植10株。本試驗(yàn)設(shè)置2種處理:非根際沉積物不栽培菖蒲;根際沉積物栽培水生植物菖蒲，每種處理設(shè)置3個(gè)平行。水生植物栽培時(shí)間為90 d，從2014年7月開(kāi)始至2014年10月結(jié)束，在水生植物栽培期間，維持培養(yǎng)箱中水層高于沉積物層3～5 cm［13］。菖蒲栽培過(guò)程中生長(zhǎng)良好。栽培試驗(yàn)結(jié)束后取非根際及菖蒲根際沉積物，將各處理的3個(gè)平行樣品混合后進(jìn)行微生物群落多樣性分析。

2.3 微生物碳源測(cè)定板碳源的分類

試驗(yàn)使用美國(guó)Biolog公司生產(chǎn)的Biolog-Eco測(cè)試板，Eco板上一共分布96個(gè)孔，測(cè)試板上除了不含任何碳源的對(duì)照(水)以外，共31種碳源，每一種碳源有3個(gè)平行［14］。Biolog-Eco除對(duì)照以外的碳源孔中含有1種碳源和四氮唑藍(lán)，當(dāng)微生物利用Eco板碳源進(jìn)行生長(zhǎng)呼吸可將四氮唑藍(lán)從無(wú)色還原成紫色，顏色深淺代表微生物對(duì)這種碳源的利用程度高低［15］。通過(guò)測(cè)定各板孔的吸光值及其變化來(lái)反映微生物群落代謝功能的多樣性［12］。

2.4 微生物群落對(duì)碳源代謝的測(cè)定

取水生植物根際及非根際新鮮沉積物約10 g，放入含90 mL滅菌生理鹽水的三角瓶中，在于空氣浴恒溫振蕩器振蕩30 min(25℃，200 rpm)，靜置15 min，取上清液稀釋到1/10濃度，稀釋液經(jīng)3 500 rpm離心去除殘留的沉積物后(盡量減少沉積物原有碳源干擾)，吸取150μL上清液接入Biolog-Eco板中25℃下恒溫培養(yǎng)6 d，分別在24，48，72，96，120，144 h，用Biolog微生物鑒定系統(tǒng)在波長(zhǎng)為750 nm 及 590 nm 下測(cè)定吸光值［16－17］。

2.5 沉積物微生物群落多樣性計(jì)算

微生物群落功能多樣性指數(shù)計(jì)算公式參照文獻(xiàn)［18－20］:

(1)沉積物微生物群落總活性(AWCD)計(jì)算公式為AWCD=Σ(Ci－R)/n。

(2)豐富度指數(shù)S為每孔中(C－R)的值大于0.25的孔個(gè)數(shù)。

(3)Shannon-Wiener指數(shù) H'=－Σ(Pi·log Pi)。

(4)Simpson指數(shù)D=1－ΣPi2。

(5)Pielou均勻度指數(shù)E=H'/ln S。

其中，Ci為31個(gè)碳源孔的吸光值;R為對(duì)照孔的吸光值;n為31;Pi為有培養(yǎng)基的孔和對(duì)照孔的光密度值差與整板總差的比值，即Pi=(Ci－R)/Σ(Ci－R);S為被利用的碳源總數(shù)。

2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

使用數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析軟件 SPSS v16.0及Graph-Pad Prism 5進(jìn)行繪圖及數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。用單因素方差分析(One-way ANOVA，Tukey’s Multiple Comparison Test)比較各大類碳源之間的差異，t檢驗(yàn)比較各處理組與對(duì)照之間的差異，p＜0.05為差異顯著，p＜0.01為差異極顯著［13］，文中所有數(shù)據(jù)用 3 個(gè)平行的平均值表示。

3 結(jié)果與分析

3.1 沉積物微生物總活性

沉積物微生物總活性可用AWCD(Average Well Color Development)，即Biolog-Eco測(cè)試板孔中溶液吸光值平均變化率表征，是沉積物微生物群落利用單一碳源能力的一個(gè)重要指標(biāo)［21－22］。從圖1可以看出，在168 h的培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，根際及非根際微生物活性的總體變化趨勢(shì)為在前120 h內(nèi)AWCD逐漸增大，120 h后AWCD緩慢降低。對(duì)于非根際來(lái)講，其AWCD在開(kāi)始的24 h變化不大(p＞0.05)，而在第24～72 h內(nèi)快速升高，在隨后的96～120 h內(nèi)快速升高，然后緩慢降低(120～144 h)。根際AWCD表現(xiàn)出了0～48 h內(nèi)快速升高，48～120 h內(nèi)變化速度明顯減慢，隨后緩慢降低直到試驗(yàn)結(jié)束。以120 h的AWCD值作為衡量微生物活性在根際及非根際環(huán)境下的變化情況，根際AWCD較非根際AWCD的變化速度(斜率)和最終AWCD均有較大程度的提高，而根際微生物群落的酶聯(lián)反應(yīng)速度和最終能達(dá)到的程度，與群落能利用單一碳底物的微生物的數(shù)目和種類有關(guān)［23］。上述結(jié)果說(shuō)明水生植物的種植可顯著提高沉積物中微生物的活力及功能多樣性。

圖1 168 h內(nèi)培養(yǎng)過(guò)程中的AWCD變化Fig.1 Variation of AWCD in 168 h

3.2 沉積物微生物碳源利用特征

Biolog-Eco板含有31種不同種類的碳源，本文將這些碳源分為糖類、氨基酸類、酸類、醇類、胺類及酯類共6大類，每一大類的碳源數(shù)量及種類見(jiàn)表1所示。

表1 Biolog-Eco測(cè)試板31種碳源分類Table 1 Classification of 31 carbon sources in Biolog-Eco test plate

圖2為非根際及菖蒲根際沉積物微生物對(duì)Biolog-Eco板上6大類碳源的利用特征。非根際沉積物微生物對(duì)酯類碳源的利用程度最高(54.25%)，其次是胺類(15.27%)，對(duì)氨基酸類及羧酸類的利用程度較低(9.67%及9.93%)，對(duì)糖類及醇類利用程度最低(6.28% 及4.59%)，這說(shuō)明非根際沉積物中優(yōu)勢(shì)微生物是一些以酯類及胺類為主要碳源的微生物。

水生植物菖蒲的種植大大促進(jìn)了沉積物中微生物的生長(zhǎng)，其對(duì)6大類碳源的利用程度除了酯類以外，其他5類具有較大幅度的提高，比非根際沉積物微生物對(duì)糖類、氨基酸類、羧酸類、醇類及胺類提高了110%～698%。根際沉積物微生物對(duì)酯類及糖類的利用程度最高，分別達(dá)到22.03% 及20.22%，其次是氨基酸類(16.02%)及 醇 類 (15.96%)，對(duì) 胺 類(12.93%)及羧酸類(12.82%)的利用程度最低。

以上結(jié)果說(shuō)明，水生植物菖蒲可通過(guò)根系向沉積物分泌如碳水化合物、有機(jī)酸、氨基酸類等物質(zhì)，促進(jìn)能利用這些碳源的微生物大量繁殖，從而使得根際沉積物微生物對(duì)這幾類碳源的利用程度大大提高，整體提高了根際沉積物微生物的總活性。

圖2 非根際沉積物及菖蒲根際沉積物微生物對(duì)6大類碳源的利用程度Fig.2 Relative use efficiency of 6 carbon sources by microbial community in non-rhizosphere sediment and rhizosphere sediment of Acorus calamus L.

圖3 非根際沉積物中微生物對(duì)31種碳源的利用情況Fig.3 Relative use efficiency of 31 carbon sources by microbial community in non-rhizosphere sediment

3.3 沉積物微生物對(duì)31種碳源的利用情況

從圖3及圖4可以看出，對(duì)于糖類碳源來(lái)講，菖蒲根際沉積物微生物主要利用 D-纖維二糖、a-D-乳糖、β-甲基 D-葡萄糖苷及葡萄糖-1-磷酸，而非根際沉積物對(duì)于這些糖類基本不利用，只對(duì)a-D-乳糖有較少程度的利用，這說(shuō)明菖蒲根際可能產(chǎn)生了新的微生物種類［24］，這些新的微生物可利用D-纖維二糖、a-D-乳糖、β-甲基D-葡萄糖苷、葡萄糖-1-磷酸作為碳源。

對(duì)于氨基酸類碳源來(lái)講，L-天冬酰胺酸、L-精氨酸及甘氨酰-L-谷氨酸對(duì)非根際沉積物的貢獻(xiàn)最大，但是利用程度不高;菖蒲根際氨基酸類總效應(yīng)顯著提高主要是由L-天冬酰胺酸、L-絲氨酸及甘氨酰-L-谷氨酸這3類碳源引起，這幾類碳源利用效率比非根際沉積物提高了4～13倍。

對(duì)于酸類碳源來(lái)講，非根際對(duì)衣康酸、a-丁酮酸有較少程度的利用，而菖蒲根際則完全沒(méi)有利用，說(shuō)明根際對(duì)利用衣康酸、a-丁酮酸的微生物產(chǎn)生了抑制。根際的酸類碳源利用主要由D-半乳糖醛酸及D-葡萄胺酸貢獻(xiàn)，而這2類碳源在非根際基本沒(méi)有利用，說(shuō)明根際有促進(jìn)該2類羧酸為碳源的微生物生長(zhǎng)的作用。

非根際沉積物對(duì)苯乙基胺的利用程度最高，而可利用苯乙基胺的微生物在菖蒲根際受到了抑制。根際及非根際對(duì)腐胺的利用程度相當(dāng)，利用程度較低;根際沉積物的胺類利用程度明顯高于非根際主要是由 N-乙?；?D-葡萄胺引起的，其在根際的AWCD達(dá)到1.0，而在非根際卻沒(méi)有利用。胺類碳源利用結(jié)果說(shuō)明苯乙基胺及N-乙?；?D-葡萄胺是造成非根際及根際沉積物利用胺類差異的主要原因。

非根際與根際沉積物微生物對(duì)于酯類碳源的利用程度及規(guī)律相似，即吐溫80＞吐溫40＞丙酮酸甲酯，二者對(duì)D-半乳糖內(nèi)酯基本不利用，這說(shuō)明可利用D-半乳糖內(nèi)酯的微生物在根際及非根際均受到抑制。

非根際沉積物對(duì)醇類碳源基本不利用，而菖蒲根際對(duì)I-赤藻糖醇不利用，對(duì)D-甘露醇及D，L-a-甘油的利用程度明顯增強(qiáng)，說(shuō)明菖蒲根際中能利用D-甘露醇及D，L-a-甘油的微生物增加或者是活性明顯增強(qiáng)，醇類總效應(yīng)中根際與非根際的差異主要由D-甘露醇及D，L-a-甘油的利用引起。

圖4 菖蒲根際沉積物微生物對(duì)31種碳源的利用情況Fig.4 Relative use efficiency of 31 carbon sources by microbial community in rhizosphere sediment of Acorus calamus L.

3.4 沉積物微生物多樣性指數(shù)比較分析

沉積物微生物群落利用碳源類型的多少可用多樣性指數(shù)表示［25］，不同的微生物多樣性指數(shù)反映了沉積物微生物群落功能多樣性的不同側(cè)面。Shannon指數(shù)用于評(píng)價(jià)群落的豐富度，從表2可以看出，菖蒲的根際環(huán)境中存在較為豐富的微生物群落種類，該指標(biāo)與豐富度指數(shù)是相一致的。豐富度指數(shù)S則可直觀地體現(xiàn)微生物群落種類的多少，根際沉積物中的微生物種類顯著高于非根際;Simpson指數(shù)反映群落中某些常見(jiàn)種的優(yōu)勢(shì)度，根際及非根際沉積物的微生物優(yōu)勢(shì)度指數(shù)差異不大，這可能和二者中都存在以酯類為主要碳源的微生物類群有關(guān)系。Pielou指數(shù)是群落物種均一性的度量，菖蒲的根際改變了沉積物中微生物的群落結(jié)構(gòu)從而使得均一性較好。從總體上看，根際沉積物微生物功能多樣性處于較高水平，這些指數(shù)的大小總體上與2種不同沉積物AWCD是相一致的。

表2 根際及非根際沉積物微生物功能多樣性指數(shù)Table 2 Functional diversity indices of microbial communities in non-rhizosphere sediment and rhizosphere sediment

4 結(jié)論

(1)水生植物菖蒲的種植可顯著提高沉積物中微生物的總活性，相比于未種植植物的沉積物，120 h內(nèi)AWCD的變化速度和最終AWCD值均有較大程度的提高。

(2)糖類、氨基酸類、酸類、醇類、胺類及酯類這6大類碳源中，非根際沉積物微生物對(duì)酯類碳源的利用程度最高，其次是胺類，對(duì)氨基酸類及羧酸類的利用程度較低，對(duì)糖類及醇類利用程度最低;菖蒲根際沉積物微生物對(duì)酯類及糖類的利用程度最高，其次是氨基酸類及醇類，對(duì)胺類及羧酸類的利用程度最低。

(3)根際及非根際微生物利用的氨基酸類、酸類、醇類、胺類及酯類碳源的總效應(yīng)由不同的碳源造成，菖蒲根際改變了沉積物原有的微生物群落結(jié)構(gòu)。

(4)菖蒲的種植可顯著增加沉積物微生物多樣性，表征微生物多樣性的Shannon-Wiener指數(shù)、豐富度指數(shù)及Pielou均勻度指數(shù)均要顯著高于非根際沉積物。

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