段巍鶴，鄭宏亮，陸美林，萬家余，何秀霞

（1.長(zhǎng)春理工大學(xué) 校醫(yī)院，長(zhǎng)春 130022，2.長(zhǎng)春理工大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)春 130022，3.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 軍事獸醫(yī)研究所，長(zhǎng)春 130122）

細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳遞通過中心轉(zhuǎn)換站接收、調(diào)節(jié)和傳遞信號(hào)。小分子量G蛋白家族構(gòu)成了對(duì)生長(zhǎng)、分化、形態(tài)發(fā)生、囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)和細(xì)胞骨架形成極其重要的膜相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)站。Ras蛋白是一個(gè)分子質(zhì)量為21kD左右的單體GTP酶，參與典型的G蛋白激活和失活循環(huán)。Ras突變常見于人類許多癌癥中。突變后持續(xù)活化的生長(zhǎng)信號(hào)導(dǎo)致細(xì)胞的惡性增殖。并且，Ras蛋白大量存在于神經(jīng)中樞中。因此，Ras蛋白在細(xì)胞的生長(zhǎng)分化、細(xì)胞的癌變、信號(hào)的的傳遞等方面扮演著重要的作用，其在癌癥的預(yù)防、診斷、治療方面的研究越來越深入，而在學(xué)習(xí)記憶功能方面的研究同樣受到了國(guó)內(nèi)外的關(guān)注［1，2］。為此，對(duì)Ras基因和蛋白的細(xì)致研究可以產(chǎn)生巨大經(jīng)濟(jì)價(jià)值和醫(yī)療價(jià)值，將會(huì)對(duì)人類腫瘤的治療和學(xué)習(xí)記憶功能的發(fā)展帶來突破性的進(jìn)展［3-7］。

本實(shí)驗(yàn)利用敲除Ras-GRF1基因的雌性小鼠（Ras-GRF10/0）進(jìn)行自主活動(dòng)實(shí)驗(yàn)以檢測(cè)機(jī)體運(yùn)動(dòng)狀態(tài)；通過莫里斯水迷宮實(shí)驗(yàn)評(píng)估轉(zhuǎn)基因和敲除小鼠學(xué)習(xí)與記憶能力［8-12］；通過避暗穿梭實(shí)驗(yàn)、跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)等判斷小鼠學(xué)習(xí)和記憶功能是否受到影響［13］。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)小鼠

Ras-GRF10/0基因敲除小鼠由美國(guó)公司構(gòu)建，野生型老鼠由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院獸醫(yī)研究所提供。各品系老鼠均有十四只。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

伯樂高電壓電泳儀Biorad Powerpac HV 164-5056，伯樂小型電泳槽，伯樂C1000 PCR儀均為伯樂公司生產(chǎn)；Morris水迷宮視頻分析系統(tǒng)，避暗穿梭測(cè)試儀XR-YLS-17B，自主活動(dòng)箱，跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)設(shè)備均為北京眾實(shí)迪創(chuàng)科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 Ras-GRF10/0純合敲除鼠的擴(kuò)繁

將成年（大于6周齡）首建的雜合敲除鼠按每籠3只雌鼠1只雄鼠合籠，養(yǎng)殖房需要溫度可控（22℃），采取等晝夜長(zhǎng)，水和食物可以供小鼠自由食用的方式來飼養(yǎng)。待母鼠產(chǎn)的子代小鼠長(zhǎng)到5周大的時(shí)候，打耳號(hào)區(qū)分每一只鼠。

1.2.2 Ras-GRF10/0基因敲除小鼠的鑒定

利用Axygen公司提供的AxyPrep基因組DNA小量試劑盒提取小鼠的基因組。將提取DNA進(jìn)行PCR以鑒定所用Ras-GRF10/0老鼠是否為純合老鼠。

1.2.3 自主活動(dòng)箱

自主活動(dòng)箱由長(zhǎng)方體不透光的封閉空間組成。內(nèi)壁含有4個(gè)光電管，可以測(cè)定小鼠的自主活動(dòng)次數(shù)。將小鼠輕輕放進(jìn)自主活動(dòng)箱，然后將蓋子蓋上。以5min為測(cè)試時(shí)間，連續(xù)五天。第一次實(shí)驗(yàn)時(shí)需給予小鼠3min適應(yīng)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 Morris水迷宮

連續(xù)進(jìn)行7天定位航行試驗(yàn)；第八天撤去隱藏平臺(tái)，即空間搜索實(shí)驗(yàn)。將小鼠輕輕地放置在隱藏的平臺(tái)，小鼠在隨后會(huì)逃離平臺(tái)，允許小鼠在池內(nèi)游泳，以適應(yīng)環(huán)境，然后用手，引導(dǎo)小鼠慢慢游向隱藏平臺(tái)，并保證小鼠在平臺(tái)上至少停留15s。在水迷宮分析系統(tǒng)中人為地將水池分為4個(gè)象限，分后隨機(jī)在4個(gè)象限中選取入水點(diǎn)。入水時(shí)，小鼠面向水池壁，防止其觀察到隱藏平臺(tái)，然后讓小鼠在四個(gè)象限中自由游泳，時(shí)間規(guī)定為120s。若在120s內(nèi)小鼠找到隱藏平臺(tái)并在平臺(tái)停留至少5s，則結(jié)束實(shí)驗(yàn)，時(shí)間即為該小鼠的逃避潛伏期；若沒有找到，則需要人為地誘導(dǎo)小鼠尋找隱藏平臺(tái)，然后讓其停留至少15s，逃避潛伏期記作120s。同時(shí)記錄每次小鼠的游泳軌跡。第八天進(jìn)行空間搜索實(shí)驗(yàn)，在沒有隱藏平臺(tái)的情況下，記錄小鼠第一次穿越平臺(tái)的時(shí)間，游泳軌跡以及在120s內(nèi)穿越平臺(tái)的次數(shù)。

1.2.5 避暗穿梭

實(shí)驗(yàn)設(shè)備是由長(zhǎng)寬各為20cm，高為15cm的四個(gè)不透光的封閉空間組成，分為A、B、C、D四個(gè)區(qū)域，A和C作為一組測(cè)量?jī)x器，B與D作為一組。其底部均由可通電的電柵組成。每個(gè)空間內(nèi)有均有自動(dòng)傳感器可以測(cè)量小數(shù)的活動(dòng)。實(shí)驗(yàn)時(shí)，將小鼠輕輕的放進(jìn)A、B兩室中，然后將蓋子蓋上，通電后，A、B兩室將閃爍燈光，C、D兩室會(huì)以限壓30V，限流0.5mA的電流持續(xù)通電。以5min為測(cè)試時(shí)間，連續(xù)三天。同樣第一次實(shí)驗(yàn)時(shí)需給小鼠3min的適應(yīng)時(shí)間。

1.2.6 跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)

將小鼠放置到實(shí)驗(yàn)設(shè)備的圓柱體平臺(tái)中，將蓋子蓋上。將會(huì)有限壓30V，限流0.5mA的電流通過底部的電柵。以5分鐘為測(cè)試時(shí)間，連續(xù)兩天。在第一天的實(shí)驗(yàn)中，給予小鼠三分鐘的適應(yīng)時(shí)間。

每批小鼠在完成上述實(shí)驗(yàn)后，都要及時(shí)的用清水清理實(shí)驗(yàn)儀器，防止有氣味等因素干擾小鼠的判斷。實(shí)驗(yàn)前后保持安靜，溫度為21℃恒定。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 Ras-GRF10/0純合老鼠的鑒定

為了得到足夠數(shù)量的純合Ras-GRF10/0小鼠，進(jìn)行種內(nèi)自交，在F1代群體中，通過PCR技術(shù)鑒定雜合型和純合型后代。通過圖1PCR的鑒定結(jié)果可以看出，雜合型小鼠電泳結(jié)果中有兩條電泳條帶如5、7、8、9、10、11、12泳道，有清晰單一條帶的為Ras-GRF10/0純合小鼠如3、4泳道，2、6泳道則為野生型小鼠。以PCR檢測(cè)為純合的小鼠進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 Ras-GRF10/0PCR鑒定結(jié)果

圖1中，1為DL2000 Marker；2和6：野生型小鼠PCR結(jié)果；3和4：Ras-GRF10/0純合小鼠的PCR結(jié)果；5，7，8，9，10，11，12：為Ras-GRF10/0雜合小鼠的鑒定結(jié)果.

2.2 自主活動(dòng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在自主活動(dòng)的實(shí)驗(yàn)中，野生型小鼠和Ras-GRF10/0小鼠在活動(dòng)性上隨著時(shí)間的推移均有所下降，但下降的幅度不大，且Ras-GRF10/0小鼠活動(dòng)次數(shù)整體少于野生型小鼠。但是沒有顯著性差異。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見表1。

表1 野生型小鼠和Ras-GRF10/0型小鼠自主活動(dòng)次數(shù)（單位：次）

表2 野生型小鼠與Ras-GRF10/0型小鼠逃避潛伏期（單位：秒）

2.3 水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 定位航行試驗(yàn)結(jié)果

由Morris水迷宮得出兩種小鼠的平均逃避潛伏期見表2，野生型小鼠逃避潛伏期有逐漸降低的趨勢(shì)，實(shí)驗(yàn)的5～7天逃避潛伏期有平穩(wěn)的趨勢(shì)。而Ras-GRF10/0小鼠的逃避潛伏期在實(shí)驗(yàn)的前兩天幾乎沒有變化，從實(shí)驗(yàn)的第三天開始，有逐漸降低的趨勢(shì)。對(duì)比野生型小鼠和Ras-GRF10/0小鼠，可以明確發(fā)現(xiàn)兩者在逃避潛伏期的第1天沒有顯著差異，第2天則表現(xiàn)差異顯著（P＜0.05），第3～7天則差異極顯著（P＜0.01）。從游泳軌跡（見圖2）也證實(shí)了這一點(diǎn)，即隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，野生鼠目的性更強(qiáng)，游泳軌跡更直接。

2.3.2 空間探索實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)的第八天，撤去水下的隱藏平臺(tái)。通過對(duì)比野生型小鼠和Ras-GRF10/0小鼠在120s內(nèi)穿越平臺(tái)的平均次數(shù)，可以發(fā)現(xiàn)野生型平均穿越次數(shù)為6.1要大于Ras-GRF1基因敲除小鼠的5次穿越次數(shù)。雖然在統(tǒng)計(jì)學(xué)上沒有顯著差異，但從兩者空間探索軌跡可以看出野生鼠的探索次數(shù)多于Ras-GRF10/0小鼠，搜索性更強(qiáng)（圖3）。

2.4 避暗穿梭實(shí)驗(yàn)結(jié)果

從表3避暗實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，5min內(nèi)兩種小鼠被電擊次數(shù)在第一天有顯著差異，之后則沒有表現(xiàn)出差異，但Ras-GRF10/0型小鼠被電擊次數(shù)多于野生型小鼠。對(duì)比野生型小鼠和Ras-GRF10/0型小鼠主動(dòng)回避潛伏時(shí)間可以看出（如表4）在實(shí)驗(yàn)的第一天潛伏期都很短，但Ras-GRF10/0型小鼠第一天和第二天的潛伏期均遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于野生型小鼠，在實(shí)驗(yàn)的第三天，即最后一天中，這兩種小鼠的差異變得很小。

2.5 跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖2 野生型小鼠與Ras-GRF10/0型小鼠游泳軌跡

圖3 野生型小鼠和Ras-GRF1小鼠空間探索軌跡

通過分析對(duì)比跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖4）可以看出兩者在跳下平臺(tái)的時(shí)間沒有顯著差異，但Ras-GRF10/0型小鼠的潛伏期小于野生型小鼠。在第一天的實(shí)驗(yàn)中，Ras-GRF10/0型小鼠跳臺(tái)次數(shù)大于野生型小鼠差異顯著。在第二天的實(shí)驗(yàn)中兩種小鼠的跳臺(tái)次數(shù)略有差距（見圖5）。

表3 野生型小鼠和Ras-GRF10/0小鼠5min被電擊次數(shù)（單位：次）

表4 野生型小鼠和Ras-GRF10/0小鼠主動(dòng)回避潛伏時(shí)間（單位：秒）

圖4 野生型小鼠和Ras-GRF10/0小鼠第一次跳下平臺(tái)的時(shí)間

圖5 野生型小鼠和Ras-GRF10/0小鼠5min內(nèi)跳臺(tái)次數(shù)

3 討論

自主活動(dòng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，在自主活動(dòng)能力上、在體力上，野生型小鼠與Ras-GRF10/0型小鼠沒有較大的區(qū)別。跳臺(tái)試驗(yàn)說明Ras-GRF10/0型小鼠的平均潛伏期與野生型大致相同，但跳臺(tái)次數(shù)Ras-GRF10/0型小鼠多于野生型。Morris水迷宮的空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明Ras-GRF10/0型小鼠對(duì)平臺(tái)所在位置并沒有顯著的記憶。避暗穿梭實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步說明Ras-GRF10/0型小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力不如野生型小鼠。

［1］郭瑞珍，胡成久.20例皮膚瘢痕癌中Ras蛋白表達(dá)及意義［J］.臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志，2011，27（11）：1237-1239.

［2］張玉，謝丙炎，馮東昕，等.Ras蛋白信號(hào)途徑及其對(duì)線蟲生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控作用［J］.生物技術(shù)通報(bào)，2009，8（1）：32-37.

［3］Karl Peter Giese，Eugenia Friedman，Nikolai B.Fedorov，etal.Hippocampus-dependentlearningand memory is impaired in mice lacking the Ras-guanine-nucleotide releasing factor 1（Ras-GRF1）［J］.Neuropharmacology，2001，6（41）：791-800.

［4］Zhuravliova E，Barbakadze T，Narman N，et al.Hypoinsulinemia alleviates the Grf1/Ras/Akt anti-apoptotic pathway and induces alterations of mitochondrial ras trafficking in neuronal cells［J］.Neurochem，2009（34）：1076-1082.

［5］Jaime Font de Mora，Luis Miguel Esteban，Deborah J Burks，et al.Ras-GRF1 signaling is required for normalβ-cell development and glucose homeostasis［J］.The EMBO Journal，2003，22（12）：3039-3049.

［6］Huibin Yang，Raymond R Mattingly.The ras-GRF1 exchange factor coordinates activation ofH-Ras and rac1 to control neuronal morphology［J］.Molecular Biology of the Cell，2006（17）：2177–2189.

［7］Rachel J Buchsbaum，Beth A Connolly，Larry A Feig，et al.Interaction of rac exchange factors tiam1 and Ras-GRF1 with a scaffold for the p38 mitogen-activated protein kinase cascade［J］.Molecular and cellular biology，2002（6）：4073-4085.

［8］薛丹，徐淑萍，劉進(jìn)修，等.水迷宮實(shí)驗(yàn)中三種品系小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的比較［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)，2010，l8（2）：149-152.

［9］封敏，盧圣鋒，張承舜，等.國(guó)內(nèi)大鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)現(xiàn)狀與分析［J］.遼寧中醫(yī)雜志，2011，38（11）：2170-2172.

［10］劉艷霞，胡晉紅，朱全剛，等.水迷宮水域調(diào)節(jié)方法的改良［J］.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與比較醫(yī)學(xué)，2008，28（4）：243-245.

［11］武文芳，吳兵.水迷宮實(shí)驗(yàn)動(dòng)物游動(dòng)的圖像軌跡采集分析系統(tǒng)設(shè)計(jì)［J］.醫(yī)療設(shè)備信息，2002（6）：24-25.

［12］王維剛，周嘉斌，朱明莉，等.小鼠動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法系列專題（一）Morri水迷宮實(shí)驗(yàn)在小鼠表型分析中的應(yīng)用［J］.中國(guó)細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào)，2011，33（1）：8-14.

［13］袁力勇，戴體俊，蘇珍，等.跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)訓(xùn)練后小鼠自然遺忘時(shí)間的觀察［J］.徐州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2007，27（2）：84-85.