葛 杰，張 樺，姚正培，李 月

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，烏魯木齊 830052)

大豆是新疆的主栽農(nóng)作物之一。大豆蛋白含有多種氨基酸成分，除了含有人體所必需的8種氨基酸，還是一類優(yōu)質(zhì)植物蛋白資源［1－3］。超高產(chǎn)大豆“中黃35”于2006年和2007年在新疆連續(xù)創(chuàng)造了5197 kg/hm2和5577 kg/hm2的高產(chǎn)量，2010年在兵團(tuán)農(nóng)八師148團(tuán)試驗(yàn)田更是達(dá)到了6088.35 kg/hm2的超高產(chǎn)指標(biāo)［4－5］。有研究表明，大豆產(chǎn)量與其生殖生長的持續(xù)時間正相關(guān)，大豆籽粒重的絕大部分來源于開花后的光合產(chǎn)物，如果能延緩其開花后葉片的衰老，提高其生理功能，則有利于增加植物的粒重［6］。目前，在小麥、棉花等經(jīng)濟(jì)作物上進(jìn)行了較多的葉片衰老規(guī)律研究，而關(guān)于大豆開花后葉片衰老規(guī)律的研究特別是葉片衰老對籽粒影響的報道還較少，且前期報道多集中于環(huán)境因素對大豆葉片衰老的影響方面［7－11］。本實(shí)驗(yàn)采用超高產(chǎn)大豆“中黃35號”和一般產(chǎn)量大豆品種新大豆“10號”為材料，研究其開花后籽粒產(chǎn)量形成的關(guān)鍵時期的葉片衰老機(jī)制，對新疆大豆高產(chǎn)栽培和育種研究具有一定的理論價值和實(shí)踐意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)以超高產(chǎn)大豆“中黃35號”和新大豆“10號”為材料。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

選用伊犁地區(qū)伊寧縣吉里于孜鎮(zhèn)種植推廣的“中黃35號”和新大豆“10號”大豆品種，于2013年5月6日播種。每公頃施用155 kg氮磷鉀復(fù)合肥作為種肥，初花期每公頃追施155 kg尿素。初花期(7月15日)時，選取具有代表性的植株20株，在剛展開的葉片上掛牌。分別于7月15日(葉片展開當(dāng)天)、7月25日(展開后10 d)、8月4日(展開后20 d)、8月14日(展開后30 d)和8月24日(展開后40 d)，每次取3～5株初花期已掛牌的葉片。植物葉片取樣后立即放入液氮中速凍，返回實(shí)驗(yàn)室后在－40℃低溫下保存。于2013年7—8月在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)統(tǒng)一測定過氧化氫酶(CAT)活性、超氧化物歧化酶(SOD)活性、過氧化物酶(POD)活性、丙二醛(MAD)濃度、葉綠素(總)含量和可溶性蛋白質(zhì)含量。

1.3 測定方法

取1 g樣品，加入5 mL pH值為7.8的磷酸緩沖液，采用冰浴研磨，冷凍離心10000 r/min，上清液保留用于上述項(xiàng)目的測定。SOD活性測定用改進(jìn)的NBT光化還原法，MDA含量測定參照王曉峰等提出的方法;CAT活性測定采用改進(jìn)的碘量法;可溶性蛋白質(zhì)含量測定采用考馬斯亮藍(lán)法;測定POX活性采用愈創(chuàng)木酚法;丙二醛(MDA)變化使用硫代巴比妥酸(TBA)測定;葉綠素含量用丙酮法來測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆葉片的過氧化氫酶(CAT)活性

由圖1可知:大豆葉片剛展開時(7月15日)其CAT活性非常低，新大豆“10號”CAT活性僅為338 μmol H2O2·min－1·g－1FW，“中黃35 號”大豆CAT 活性為324 μmol H2O2·min－1·g－1FW。之后兩者CAT活性迅速增加，至8月14日(葉片展開后30 d)達(dá)到高峰，新大豆“10號”和“中黃35號”大豆CAT 活性數(shù)值分別為 2142 μ mol H2O2·min－1·g－1FW 和1876 μmol H2O2·min－1·g－1FW。之后“中黃35號”大豆CAT活性繼續(xù)升高，在葉片展后40 d，“中黃35號”大豆CAT活性遠(yuǎn)大于新大豆“10號”CAT活性，其峰值達(dá)到 2488 μmol H2O2·min－1·g－1FW 左右。過氧化氫酶(CAT)是自由基清除酶之一，是過氧化物酶體的標(biāo)志性酶，約占過氧化物酶體酶總量的40%，主要作用是催化H2O2分解為H2O與 O2，避免 H2O2與O2在鐵螯合物作用下反應(yīng)生成有害的－OH，其活性可衡量植物葉片衰老狀況。

圖1 “中黃35號”和新大豆“10號”葉片的過氧化氫酶(CAT)活性比較

2.2 大豆葉片超氧化物歧化酶(SOD)活性

SOD也是自由基清除酶之一，是一種源于生命體的活性物質(zhì)，能消除生物體在新陳代謝過程中產(chǎn)生的有害物質(zhì)。SOD活性可標(biāo)志植物的衰老狀態(tài)，它在生物體內(nèi)的水平高低直觀地反映了衰老與死亡。由圖2可知:2個品種的大豆葉片SOD活性變化趨勢不同。在植物葉片展開初期，大豆葉片SOD活性較高，峰值分別為241 unit·g－1FW和230 unit·g－1FW，且“中黃35號”大豆略高于新大豆“10號”SOD活性。之后兩者SOD活性都下降。在葉片展開20 d后出現(xiàn)拐點(diǎn)，“中黃35號”SOD活性先升高再降低，數(shù)值為188 unit·g－1FW，葉片展開30 d后迅速下降;而新大豆“10號”SOD活性在8月4號之后出現(xiàn)了慢慢升高現(xiàn)象。

圖2 “中黃35號”和新大豆“10號”葉片的超氧化物歧化酶(SOD)活性比較

2.3 大豆葉片過氧化物酶(POD)活性

氧化酶和過氧化氫酶都存在于過氧化物酶體中。在植物生長發(fā)育過程中過氧化物酶(POD)活性在不斷地發(fā)生變化，它的作用是將對細(xì)胞有毒性物質(zhì)的過氧化氫水解，保護(hù)細(xì)胞，一般在老化組織中POD活性較高，在幼嫩組織中活性較弱。過氧化物酶能使組織中所含的某些碳水化合物轉(zhuǎn)化成木質(zhì)素，增加植物木質(zhì)化程度，因此過氧化物酶可作為組織老化的一種生理指標(biāo)［12－13］。從圖3可以看出:2個品種的大豆葉片剛展開時(7月15日)，“中黃35號”POD活性較低，為457 D470·mol·min－1·g－1FW，其葉片展開 10 d 內(nèi)逐漸增加，7月25號后迅速降低，葉片展開后20 d再次出現(xiàn)谷底，之后又升高，在葉片展開后25 d達(dá)到高峰，峰值為 1475 D470·mol·min－1·－1FW，再出現(xiàn)緩慢下降。從葉片展開到展開10 d，新大豆“10號”POD活性降到最低，7月25號后數(shù)峰值緩慢升高，在葉片展開后30 d到達(dá)峰值953 D470·mol·min－1·g－1FW，明顯低于“中黃 35 號”POD活性。

圖3 “中黃35號”和新大豆“10號”葉片的過氧化物酶(POD)活性比較

2.4 大豆葉片的丙二醛(MAD)濃度

丙二醛(MDA)是脂質(zhì)氧化終產(chǎn)物，在體外影響線粒體呼吸鏈復(fù)合物及線粒體內(nèi)關(guān)鍵酶活性。在植物體內(nèi)，自由基作用于脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)，氧化終產(chǎn)物為丙二醛，會引起蛋白質(zhì)、核酸等生命大分子的交聯(lián)聚合，具有細(xì)胞毒性，是反映膜質(zhì)過氧化程度的重要指標(biāo)［14］。在植物葉片衰老的過程中MDA積累越多，表明植物組織的保護(hù)能力越弱。由圖4可知:“中黃35號”大豆MDA濃度在葉片展開后10 d內(nèi)迅速上升，達(dá)到峰值3.55 μmol/g FW，然后緩慢下降;而新大豆“10號”大豆MDA濃度變化不大，一直呈下降趨勢。

圖4 “中黃35號”和新大豆“10號”葉片的丙二醛(MAD)濃度比較

2.5 大豆葉片葉綠素含量

光合作用通過合成一些有機(jī)化合物將光能轉(zhuǎn)變?yōu)榛瘜W(xué)能，葉綠素是參與植物葉片光合作用的重要物質(zhì)。植物葉片逐漸衰老時，葉綠素降解速度大于合成速度，含量下降，因此葉綠素含量高低可衡量大豆葉片的衰老狀況。自大豆葉片展開0～10 d，2種大豆品種的葉綠素總量變化趨勢基本一致，均緩慢下降?！爸悬S35號”葉片在剛展開時葉綠素總含量較低，之后逐漸增加，至20 d達(dá)到高峰，峰值為298 mg·g－1FW，然后又逐漸下降，8月14號后再次升高。新大豆“10號”和“中黃35號”品種之間的葉綠素總含量存在差異，新大豆“10號”的葉綠素總含量一直在下降，大豆葉片展開后40 d數(shù)值為207 mg·g－1FW，其葉綠素含量一直低于“中黃35號”大豆品種。

圖5 “中黃35號”和新大豆“10號”葉片的葉綠素含量比較

2.6 大豆葉片可溶性蛋白質(zhì)含量

可溶性蛋白質(zhì)是指以小分子狀態(tài)溶于水或其他溶劑的蛋白，通常是植物生理實(shí)驗(yàn)的重要指標(biāo)，其含量與葉片光合速率密切相關(guān)，是植物葉片衰老的重要指標(biāo)。葉片展開10 d時(7月25日)，“中黃35號”和新大豆“10號”的可溶性蛋白質(zhì)含量較高，分別為573 mg·g－1FW 和571 mg·g－1FW;至8月4日，“中黃35號”達(dá)到最低值，為343 mg·g－1FW，之后先增加再緩慢下降。新大豆“10號”的可溶性蛋白質(zhì)含量先降低后升高，在7月25日(展開后10 d)蛋白質(zhì)含量達(dá)到317 mg·g－1FW，到葉片展開40 d，其數(shù)值最小為190 mg·g－1FW?？偟目磥?，在葉片展開后0～40 d，“中黃35號”可溶性蛋白質(zhì)含量高于新大豆“10號”，是大豆葉片功能較強(qiáng)、可溶性蛋白質(zhì)含量積累較多的時期。

圖6 “中黃35號”和新大豆“10號”葉片的可溶性蛋白質(zhì)含量比較

3 討論

植物CAT活性、SOD活性、POD活性、葉綠素和可溶性蛋白質(zhì)含量都可反映大豆葉片的衰老狀況。由本實(shí)驗(yàn)可以看出，大豆葉片展開后10 d(7月25日)和30 d(8月4日)是其變化的2個轉(zhuǎn)折點(diǎn)。葉片展開后10 d，可溶性蛋白質(zhì)含量、CAT活性、SOD活性以及POD活性迅速增加;葉片展開后20 d，“中黃35號”葉綠素含量達(dá)到高峰。超氧化物歧化酶活性、過氧化氫酶活性和過氧化物酶活性在2個大豆品種中的變化趨勢是相似的，在葉片生長后期下降較為緩慢，但2個大豆品種間葉片衰老過程卻有不同。有研究指出，大豆群體葉面積指數(shù)(LAI)是決定光合產(chǎn)物多少的重要指標(biāo)，和植物產(chǎn)量密切相關(guān)。也有人認(rèn)為，大豆在始花期之前，葉面積指數(shù)逐步增大，在其結(jié)莢期前后可達(dá)最大值，在大豆鼓粒期直至成熟前保持植物較大的葉面積指數(shù)能保證大豆的高產(chǎn)。因此，植物的光合生產(chǎn)率與其生物籽粒產(chǎn)量相關(guān)，生育后期光合生產(chǎn)率較高，更利于大豆籽粒產(chǎn)量的增加。本實(shí)驗(yàn)認(rèn)為，超高產(chǎn)“中黃35號”大豆品種葉片展開后10～30 d是植物大豆的功能最強(qiáng)的時期，這時大豆葉片存在較強(qiáng)的活性氧清除能力，全生育期的總光合勢較高，后期光合生產(chǎn)率高，對“中黃35號”大豆籽粒形成非常有利。超高產(chǎn)大豆“中黃35”號可溶性蛋白質(zhì)含量、CAT活性、SOD活性、POD活性、葉綠素含量一般高于一般產(chǎn)量大豆——新大豆“10號”。

4 結(jié)束語

本研究首次取超高產(chǎn)“中黃35號”和新大豆“10號”2個材料，在大豆鼓粒期(葉片展開后)，采用田間實(shí)驗(yàn)結(jié)合室內(nèi)生理生化指標(biāo)測定的方法，對超高產(chǎn)和一般產(chǎn)量大豆的不同品種群體冠層葉片過氧化氫酶(CAT)活性、超氧化物歧化酶(SOD)活性、過氧化物酶(POD)活性、丙二醛(MAD)濃度、葉綠素(總)含量和可溶性蛋白質(zhì)含量等生化指標(biāo)進(jìn)行了初步分析測定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:超高產(chǎn)大豆“中黃35”號可溶性蛋白質(zhì)含量、CAT活性、SOD活性、POD活性、葉綠素含量一般情況下高于新大豆“10號”。這說明中黃35號”光合能力和細(xì)胞防御活性氧毒害的能力更強(qiáng)，其產(chǎn)量也更高。通過觀察大豆籽粒產(chǎn)量形成關(guān)鍵時期(鼓粒期直至成熟前)葉片衰老規(guī)律，為新疆大豆的高產(chǎn)栽培和大面積豐產(chǎn)提供一定的理論指導(dǎo)和現(xiàn)實(shí)意義。

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