韋 康， 王麗鴛， 王新超， 陳建興， 胡惜麗， 楊廣誼， 成 浩*

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 茶葉研究所，浙江 杭州 310008；2.縉云縣農(nóng)業(yè)局，浙江 縉云 323000）

“中黃2號(hào)”是由縉云農(nóng)家茶園中發(fā)現(xiàn)的黃化單株選育而來(lái)。由它制成的黃茶具有三黃透三綠的特點(diǎn)，即外觀色澤，金黃透綠，光潤(rùn)勻凈；湯色，鵝黃隱綠，清澈明亮；葉底，玉黃含綠，鮮亮舒展[1]。這些性狀都與中黃2號(hào)在芽葉萌發(fā)階段葉色發(fā)黃有關(guān)，見(jiàn)圖1。經(jīng)過(guò)近8年的無(wú)性繁育觀察及3年多的品比試驗(yàn)，中黃2號(hào)的葉色及品質(zhì)性狀一直表現(xiàn)穩(wěn)定，其特有的滋味及香氣深受消費(fèi)者的喜愛(ài)[2]。目前，中黃2號(hào)已發(fā)展4 000余畝，不僅在浙江縉云種植，在四川、貴州等省也開始大力發(fā)展，是中茶所近年來(lái)重點(diǎn)推廣的幾個(gè)優(yōu)質(zhì)品種之一。

圖1 中黃2號(hào)芽葉萌發(fā)照片F(xiàn)ig.1 Germinating leaves and buds of yellow tea cultivar“Zhonghuang 2”

中黃2號(hào)的優(yōu)異品質(zhì)來(lái)源于芽葉的黃化。經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期觀察發(fā)現(xiàn)，中黃2號(hào)在芽葉萌發(fā)初期葉色最黃，隨著成熟度的提高，葉片逐漸返綠，而其成熟葉葉色與普通綠茶無(wú)異。那么，中黃2號(hào)黃化的機(jī)理是什么，在其萌發(fā)過(guò)程中哪些亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，這些變化與普通綠茶有哪些差異？這些問(wèn)題目前還不得而知。對(duì)于其他植物的研究發(fā)現(xiàn)，芽葉的黃化或白化通常與葉綠素合成受阻有關(guān)[3-8]。而通過(guò)透射電鏡對(duì)茶樹白化品種亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)觀察也發(fā)現(xiàn)，葉綠體結(jié)構(gòu)變化與白化性狀息息相關(guān)[9-10]。作者利用透射電鏡技術(shù)系統(tǒng)分析了中黃2號(hào)第2（黃化）、6葉（返綠），龍井43第2、6葉亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的異同。通過(guò)亞細(xì)胞水平觀察不同細(xì)胞器形態(tài)、構(gòu)成的差異，初步推斷中黃2號(hào)黃化的機(jī)制，為深入研究茶葉黃化對(duì)品質(zhì)、香氣等產(chǎn)生的影響打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料及取樣

2012年6月20日在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所茶園內(nèi)分別取10個(gè)中黃2號(hào)與龍井43穗條，采用葉綠素儀（SPAD）分別測(cè)定其第2葉與第6葉葉綠素含量（n=10）。

取上述測(cè)定完成的中黃2號(hào)和龍井43穗條第2、6葉葉片用刀片分別切成小塊，放入1.5 mL離心管，加入2.5%戊二醛溶液，抽真空后放入4℃冰箱過(guò)夜。

另一方面，2012年6月20日在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所中黃2號(hào)茶園內(nèi)設(shè)置遮蔭處理。處理1周后取遮蔭處理及大田對(duì)照未遮蔭處理中黃2號(hào)第2葉用于透射電鏡研究。將樣品用刀片分別切成小塊后放入1.5 mL離心管，加入2.5%戊二醛溶液，抽真空后放入4℃冰箱過(guò)夜。

1.2 透射電鏡觀察

樣品前處理參照陳常頌等的研究方法[11]。待樣品包埋好后，用Reichert超薄切片機(jī)切成70～90 nm的切片，用檸檬酸鉛溶液處理切片15 min，用醋酸雙氧鈾50%乙醇飽和溶液再染色15 min，染色后的樣品即可通過(guò)JEM-1230型透射電鏡進(jìn)行觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 中黃2號(hào)與龍井43葉綠素相對(duì)含量比較

通過(guò)SPAD儀測(cè)定得到中黃2號(hào)、龍井43第2、6葉葉綠素相對(duì)含量的比較見(jiàn)圖2。發(fā)現(xiàn)中黃2號(hào)第2、6葉的葉綠素相對(duì)含量都明顯低于對(duì)照品種龍井43。特別是對(duì)第2葉的比較發(fā)現(xiàn)，中黃2號(hào)的葉綠素相對(duì)含量?jī)H為龍井43的21.8%，這說(shuō)明中黃2號(hào)在芽葉萌發(fā)初期葉綠素合成受阻。

圖2 中黃2號(hào)與龍井43第2、6葉葉綠素相對(duì)含量比較Fig.2 Chlorophyll contents of the second and sixth leaves in tea cultivar Zhonghuang 2 and Longjing 43

2.2 透射電鏡比較中黃2號(hào)與龍井43亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)

進(jìn)一步通過(guò)透射電鏡對(duì)中黃2號(hào)及龍井43亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)比較發(fā)現(xiàn)，中黃2號(hào)第2葉葉綠體較龍井43小，僅是后者的50%左右（圖3A、C）。通過(guò)進(jìn)一步放大透射電鏡觀察倍數(shù)可以發(fā)現(xiàn)，中黃2號(hào)葉綠體內(nèi)基粒片層少且簡(jiǎn)單，沒(méi)有形成片層堆疊（圖3B）。而龍井43葉綠體內(nèi)的基粒片層則極為發(fā)達(dá)，具有復(fù)雜的片層堆疊結(jié)構(gòu)（圖3D）。

中黃2號(hào)第6葉葉綠體明顯增大，同時(shí)合成淀粉粒的能力明顯提高（圖4A）。在多個(gè)葉綠體中都能發(fā)現(xiàn)淀粉粒的存在。而進(jìn)一步放大觀察可以發(fā)現(xiàn)中黃2號(hào)葉綠體中基粒片層明顯增多（圖4B）。但是和龍井43第6葉葉綠體結(jié)構(gòu)相比，其基粒片層還是略少，同時(shí)片層的堆疊仍不如龍井43發(fā)達(dá)（圖4D）。這些葉綠體內(nèi)基粒片層結(jié)構(gòu)的差異與之前樣品葉綠素含量的結(jié)構(gòu)正好吻合，說(shuō)明中黃2號(hào)黃化可能與其葉綠體基粒片層結(jié)構(gòu)合成較慢，無(wú)法有效形成片層堆疊有關(guān)。

2.3 遮蔭對(duì)中黃2號(hào)葉綠體結(jié)構(gòu)的影響

為進(jìn)一步明確中黃2號(hào)黃化是否與其葉綠體基粒片層結(jié)構(gòu)有關(guān)，對(duì)遮蔭及對(duì)照條件下中黃2號(hào)第2葉亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)進(jìn)行了觀察，見(jiàn)圖5。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，遮蔭后中黃2號(hào)葉綠體基粒片層堆疊明顯增多（圖5B）；而對(duì)照葉綠體片層結(jié)構(gòu)則十分松散，數(shù)量也很少（圖5A）。該結(jié)果與之前中黃2號(hào)與龍井43亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的比較一致，說(shuō)明中黃2號(hào)黃化可能主要與葉綠體片層結(jié)構(gòu)變化有關(guān)。

圖3 中黃2號(hào)與龍井43第2葉亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)比較Fig.3 Comparison of subcellular structures in the second leaves of Zhonghuang 2 and Longjing 43

圖4 中黃2號(hào)與龍井43第6葉亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)比較Fig.4 Comparison of subcellular structures in the sixth leaves of Zhonghuang 2 and Longjing 43

圖5 遮蔭與不遮蔭條件下中黃2號(hào)第2葉葉綠體結(jié)構(gòu)比較Fig.5 Effect of shading on chlorophyll structures in the second leaves of Zhonghuang 2

3 結(jié)語(yǔ)

對(duì)于茶葉品質(zhì)而言，黃化或白化品種與普通綠茶相比最大的特點(diǎn)是氨基酸含量高，酚類物質(zhì)含量低[9]。這導(dǎo)致黃化或白化茶滋味更加鮮爽，口感也更容易被更多消費(fèi)者接受。前期通過(guò)采集多個(gè)地區(qū)種植的多個(gè)綠茶品種春茶樣品，來(lái)研究氣候條件和葉綠素相對(duì)含量對(duì)兒茶素組分、茶葉品質(zhì)的影響[12]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，適度低溫、較低的葉綠素相對(duì)含量往往對(duì)應(yīng)于較好的綠茶品質(zhì)。這說(shuō)明培育低葉綠素品種可以作為改良茶葉品質(zhì)的一條途徑。但葉綠素相對(duì)含量過(guò)低往往對(duì)茶樹的生長(zhǎng)造成影響，完全無(wú)法合成葉綠素的茶樹在苗期即死亡。如何平衡品質(zhì)與生長(zhǎng)的關(guān)系是茶樹育種研究的關(guān)鍵。

過(guò)去對(duì)白化茶樹品種的研究較多，如安吉白茶[10]、小雪芽[9]等。結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些品種通常發(fā)生葉綠體退化、解體，葉綠體內(nèi)部含有大量囊狀小泡。對(duì)于黃化茶樹品種的研究則很少。黃化茶是否也與葉綠體合成受阻有關(guān)，如果兩者相關(guān)，為什么白化茶為全白色，而黃茶仍帶有顏色，對(duì)于這些問(wèn)題目前還缺乏相關(guān)報(bào)道，而透射電鏡技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用則為我們解答這些問(wèn)題提供了條件。

作者首次采用透射電鏡技術(shù)比較了中黃2號(hào)、龍井43第2、6葉亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：中黃2號(hào)葉綠體結(jié)構(gòu)完整，沒(méi)有出現(xiàn)解體或大量囊泡，但基粒片層堆疊明顯少于龍井43。這說(shuō)明中黃2號(hào)黃化與基粒片層合成減緩有關(guān)，但葉綠體受損情況沒(méi)有白茶嚴(yán)重[9-10]，這也解釋了中黃2號(hào)為黃色而不是白色的原因。

總之，本研究首次發(fā)現(xiàn)中黃2號(hào)黃化可能與其葉綠體基粒片層堆疊減少有關(guān)。對(duì)于該現(xiàn)象的分子機(jī)制，特別是哪些基因的變化阻礙了基粒片層的合成，它們對(duì)品質(zhì)性狀是否有調(diào)控作用，其機(jī)制是什么，這些還需要通過(guò)二代測(cè)序技術(shù)、轉(zhuǎn)基因等手段進(jìn)一步分析。本研究的完成為后續(xù)深入研究黃茶黃化機(jī)理打下了基礎(chǔ)。

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