蘆葦葉黃酮類提取物體內(nèi)體外抗氧化性研究

余曉紅，朱雪梅，李鳳偉，薛 鋒，彭英云

（鹽城工學院化學與生物工程學院，江蘇 鹽城 224003）

蘆葦葉黃酮類提取物體內(nèi)體外抗氧化性研究

余曉紅，朱雪梅*，李鳳偉，薛 鋒，彭英云

（鹽城工學院化學與生物工程學院，江蘇 鹽城 224003）

研究醇提蘆葦葉黃酮類提取物的體內(nèi)體外抗氧化性。通過測定蘆葦葉黃酮類提取物對體外大鼠肝組織勻漿、肝線粒體丙二醛（malondialdehyde，MDA）生成量及大鼠紅細胞溶血的影響。結(jié)果表明：蘆葦葉黃酮類提取物在0.5～10 mg/mL范圍內(nèi)能抑制大鼠肝組織勻漿及肝線粒體MDA的生成，抑制大鼠紅細胞溶血，具有量效關(guān)系，表明蘆葦葉黃酮類提取物具有體外抗氧化效果。隨著劑量的增加，蘆葦葉黃酮類提取物可提高S180荷瘤小鼠血清中谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性，降低MDA含量，從而提高其體內(nèi)抗氧化活性，當劑量達到300 mg/（kg·d）時，蘆葦葉黃酮類提取物與10 mL/（kg·d）的氟尿嘧啶均可促進荷瘤小鼠體內(nèi)抗氧化能力的提高，且二者間沒有顯著性差異。

蘆葦葉；黃酮；抗氧化；體內(nèi)體外

蘆葦（Phragmites communis Trin.）為禾本科蘆葦屬植物，具有生長能力強、分布面積廣等特點，在世界范圍內(nèi)起著極重要的生態(tài)作用，因而有“第二森林”之稱[1]。蘆葦?shù)慕?jīng)濟價值主要是用做編織、造紙和建材，其根和葉均可入藥[2]。有研究表明，蘆葦保健產(chǎn)品具有降低血糖、去除脂肪、調(diào)節(jié)血壓、軟化血管等作用[3-4]。而蘆葦葉含有黃酮類化合物，使其具有較好的保鮮和抗氧化作用[5]。郭慶彬等[6]研究了蘆葦葉黃酮的提取方法，戴軍等[7]發(fā)現(xiàn)蘆葦葉中含有8 種黃酮化合物；余曉紅[8]和李瑞光[5]等分別從抗油脂氧化和對羥自由基（·OH）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基、2,2’-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽自由基（2,2’-azino bis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate），ABTS+·）清除能力方面研究了蘆葦葉的體外 抗氧化活性，并證實蘆葦葉有較好的體外抗氧化能力，但有關(guān)蘆葦葉的體內(nèi)抗氧化活性鮮見報道。

本實驗以蘆 葦葉為原料，研究其乙醇提取所得黃酮類提取物在體外實驗中對大鼠肝組織勻漿、肝線粒體丙二醛（malondialdehyde，MDA）生成量及大鼠紅細胞溶血的影響，以及在體內(nèi)實驗中對S180荷瘤小鼠血清谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性及MDA含量的影響，對蘆葦葉黃酮類提取物的體內(nèi)體外抗氧化活性進行研究，以期為蘆葦黃酮藥物及功能性食品的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

雌性清潔級ICR小鼠，揚州大學比較醫(yī)學中心提供，許可證號：SCXK（蘇）2007-0001；體質(zhì)量18～22 g；飼料：顆粒飼料，由江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責任公司提供；飼養(yǎng)條件：空調(diào)房間，溫度18～24 ℃，相對濕度70%。S180細胞，江蘇省腫瘤藥物研究所提供。

蘆葦葉黃酮類提取物為自制。

陽性藥物氟尿嘧啶注射液（5-fl uorouracil，5-FU），批號：1111262；規(guī)格：10 mL，0.25 g，購自江蘇恒瑞醫(yī)藥有限公司。

牛血清白蛋白（生化試劑） 上海藍季科技發(fā)展有限公司；MDA試劑盒、SOD試劑盒、GSH-Px試劑盒南京建成生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HYG-A全溫搖瓶柜 太倉市實驗設(shè)備廠；PYXDHS-50X65-BS-II隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海躍進醫(yī)療器械廠；Model 550多孔自動酶標儀 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 蘆葦葉黃酮類提取物的制備

蘆葦葉黃酮類提取物采用如下工藝制備得到：采用75%乙醇提取蘆葦葉黃酮，控制料液比為1∶25（m/V），微波功率750 W條件下提取8 min，得到蘆葦葉黃酮類物質(zhì)粗提液；粗提液經(jīng)AB-8大孔吸附樹脂和聚酰胺樹脂分離純化后，采用75%乙醇液洗脫，洗脫液冷凍干燥后，備用；經(jīng)高效液相色譜法分析確定蘆葦葉黃酮類提取物中含有蘆丁、野黃芩苷、橙皮苷、木犀草素、槲皮素、橙皮素、異甘草素和黃芩素等物質(zhì)。

1.3.2 蘆葦葉黃酮類提取物體外抗氧化實驗

1.3.2.1 蘆葦葉黃酮類提取物對大鼠肝組織勻漿體外生成MDA的影響

參照文獻[9]的方法，并進行適當修改。取新鮮的大鼠肝組織，采用冷生理鹽水洗凈血漬、吸干水分后稱質(zhì)量，于勻漿器中與冷生理鹽水以1∶9（V/V）制成勻漿液，10 000 r/min離心10 min，取上清液即為10%肝組織勻漿液，備用。

蘆葦葉黃酮類提取物（樣品）對大鼠肝勻漿MDA生成量的影響：取10%肝組織勻漿液0.4 m L與0.2 mL蘆葦葉黃酮類提取物混勻，于37 ℃溫育l h后，冰浴冷卻，按MDA測定試劑盒說明書方法測定OD532nm，計算MDA含量/（nmol/mg pro）。以牛血清白蛋白為標準蛋白，考馬斯亮藍法測定肝組織勻漿蛋白質(zhì)含量。對照組則以等體積的生理鹽水代替樣品溶液，其他操作相同。

樣品對誘導體系大鼠肝組織勻漿MDA生成量的影響：分別加 0.2 mL 1 mmol/L FeSO4和H2O2于不同試管中，再分別加入0. 2 mL 10%肝組織勻漿液及相應(yīng)樣品溶液于各管中，混勻后于37 ℃溫育l h，其余步驟同前所述。

1.3.2.2 蘆葦葉黃酮類提取物對大鼠肝線粒體脂質(zhì)過氧化的影響

參照文獻[10-11]的方法，并進行適當修改。取新鮮的大鼠肝組織，采用冷生理鹽水洗凈血漬、吸干水分后，于勻漿器中以1∶9（V/V）與5 mmol/L pH 7.4的等滲磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）混合制成10%勻漿液，經(jīng)10 000 r/min冷凍離心10 min后，取上清液，再以10 000 r/min離心10 min，收集沉淀并用等滲PBS洗滌2 次，分散于等滲PBS中制備成蛋白質(zhì)含量為0.5 mg/mL的線粒體懸浮液，備用。

大鼠肝線粒體脂質(zhì)過氧化MDA生成量的測定：樣品組：將線粒體懸浮液1.0 mL、樣品液0.4 mL、0.5 mmol/L FeSO4溶液0.4 mL及0.5 mmol/L VC溶液0.4 mL混勻，于37 ℃溫育l h，取出0.1 mL，按MDA試劑盒說明書方法測定OD532nm，計算MDA含量；對照組：以等體積PBS代替樣品溶液，其他操作相同。

1.3.2.3 蘆葦葉黃酮類提取物對大鼠紅細胞（red blood cell，RBC）氧化溶血的影響

蘆葦葉黃酮類提取物對大鼠RBC自氧化溶血的影響：將大鼠斷頭取血，加入Alsever抗凝劑后，1 000～2 000 r/min離心10 min制備紅細胞，以冷生理鹽水洗滌3 次，再以生理鹽水制備成0.5%大鼠紅細胞懸浮液，備用。參照文獻[12]的方法稍作修改，取5 mL新配的大鼠紅細胞懸浮液與0.2 mL一定質(zhì)量濃度的樣品溶液混合，37 ℃溫育24 h后，1 000～2 000 r/min離心10 min，測定上清液OD540nm值。正常對照組以等體積生理鹽水代替樣品溶液，其余步驟相同。根據(jù)公式（1）、（2）以光密度值分別計算溶血率和抑制率。

蘆葦葉黃酮類提取物對H2O2誘導大鼠RBC氧化溶血的影響：參考文獻[13]的方法稍作修改。大鼠紅細胞懸浮液的制備同上。樣品組：取1 mL紅細胞懸浮液，加入0.2 mL樣品溶液混勻后，再加入100 mmol/L H2O2溶液0.1 mL混勻，37 ℃溫育1 h后，以生理鹽水稀釋6 倍，10 000 r/min離心10 min，取上清液測定OD415nm值，以生理鹽水調(diào)零。正常對照組：以等體積生理鹽水代替樣品溶液和H2O2溶液，其余步驟相同。誘導對照組：以等體積生理鹽水代替樣品，其余步驟相同。按照公式（3）、（4）分別計算溶血率和抑制率。

1.3.3 蘆葦葉黃酮類提取物體內(nèi)抗氧化實驗

1.3.3.1 S180腫瘤小鼠模型建立

按照移植性腫瘤研究法[14]為ICR小鼠接種實體型瘤，接種后24 h稱體質(zhì)量，隨機分為6 組，給藥組每組8 只。

1.3.3.2 動物分組及處理

取ICR小鼠和S180腫瘤小鼠，分為正常對照組、模型對照組、陽性對照組、樣品組（蘆葦葉黃酮類提取物），每組8 只。正常對照組、模型對照組：均采用灌胃給藥生理鹽水，0.4 mL/（20 g·d）；陽性對照組：靜脈注射給藥5-FU，隔天給藥1 次，共給藥5 次，給藥體積均為20 mL/kg；樣品組：分別灌胃給藥100、200、300 mg/（kg·d），第1次給藥于接種S180腫瘤24 h后，每天給藥1 次，共給藥10 次；于接種后第11天眼眶取血，備用。

1.3.3.3 體內(nèi)抗氧化活性檢測

小鼠血液于2 000 r/min離心15 min得血清，按試劑盒說明書方法測定血清中SOD、GSH-Px活力和MDA含量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

實驗設(shè)3 次重復(fù)，結(jié)果取平均值。數(shù)據(jù)用SPSS 12.0軟件分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆葦葉黃酮類提取物的體外抗氧化效果

2.1.1 蘆葦葉黃酮類提取物對大鼠肝組織勻漿體外生成MDA的影響

表1 蘆葦葉黃酮類提取物對大鼠肝組織勻漿MDA生成的影響Table 1 Effect of PCF extract on MDA generation in rat liver homogenate

如表1所示，在這3 種體系中，與對照組相比，蘆葦葉黃酮類提取物劑量在0.5～10.0 mg/mL范圍內(nèi)，對大鼠組織肝勻漿中MDA的生成量均具有顯著的抑制作用，且呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系；當蘆葦葉黃酮類提取物劑量達到5.0 mg/mL時，無誘導劑體系中抑制率達到30.47%，H2O2誘導體系中達35.70%，F(xiàn)eSO4誘導體系中達39.52%，抑制率均顯著高于相同體系的0.5 mg/mL劑量組?？傮w對比而言，蘆葦葉黃酮類提取物對誘導氧化體系中大鼠肝組織勻漿的MDA生成量抑制率高于無誘導劑體系。

2.1.2 蘆葦葉黃酮類提取物對大鼠肝線粒體脂質(zhì)過氧化的影響

表2 蘆葦葉黃酮類提取物對大鼠肝線粒體MDA生成量的影響Table 2 Effect of PCF extract on MDA generation in rat liver mitoehondria

蘆葦葉黃酮類提取物對大鼠肝線粒體MDA生成量的影響見表2。結(jié)果表明，與對照組相比，蘆葦葉黃酮類提取物作用后，可使大鼠肝線粒體MDA的生成量顯著下降，有效抑制了MDA的生成，并呈劑量-效應(yīng)關(guān)系；當蘆葦葉黃酮類提取物劑量達到5.0 mg/mL時，抑制率達到28.47 %，較0.5 mg/mL劑量組的抑制率顯著提高。

2.1.3 蘆葦葉黃酮類提取物對大鼠紅細胞氧化溶血的影響

2.1.3.1 蘆葦葉黃酮類提取物對大鼠紅細胞自氧化溶血的影響

表3 蘆葦葉黃酮類提取物對大鼠紅細胞自氧化溶血的影響Table 3 Effect of PCF extract on the hemolysis of rat RBCsTable 3

在大鼠紅細胞體外溫育過程中，添加不同劑量的蘆葦葉黃酮類提取物，考察其對紅細胞溶血的影響。由表3可 知，當劑量高于2.5 mg/mL時，蘆葦葉黃酮類提取物各劑量組的光密度值與正常對照組間差異顯著，表明其對紅細胞體外自氧化溶血反應(yīng)均具有抑制作用，且呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系，但隨著劑量的進一步增加，抑制率提高并不顯著；當劑量達到10.0 mg/mL時，蘆葦葉黃酮類提取物對大鼠紅細胞的溶血抑制率達到47.317%。

2.1.3.2 蘆葦葉黃酮類提取物對H2O2誘導大鼠紅細胞氧化溶血的影響

表4 蘆葦葉黃酮類提取物對H2O2誘導大鼠紅細胞氧化溶血的影響Table 4 Effect of PCF extract on the hemolysis induced byH2O2of rat RBCs

蘆葦葉黃酮類提取物對H2O2誘導大鼠紅細胞氧化溶血的影響如表4所示。蘆葦葉黃酮類提取物各劑量組光密度值與正常對照組和誘導對照組間均具有顯著差異，且均隨著蘆葦葉黃酮類提取物劑量的增加，氧化溶血現(xiàn)象逐步得到抑制，表現(xiàn)為溶血率逐漸下降，抑制率逐步上升。當蘆葦葉黃酮類提取物劑量達到0.5 mg/mL時，與誘導對照組相比即表現(xiàn)出顯著性差異，表現(xiàn)為一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系；蘆葦葉黃酮類提取物劑量為10 mg/mL時，溶血抑制率達到47.732%，顯著高于其他各劑量組。

2.2 蘆葦葉黃酮類提取物對S180荷瘤小鼠體內(nèi)抗氧化活性的影響

表5 蘆葦葉黃酮類提取物對S180小鼠血清SOD、GSH-Px活力和MDA含量的影響Table 5 Effect of PCF extract on SOD and GSH-Px activities and MDA content in serum of S180-bearing mice

由表5可知，S180荷瘤小鼠血清的MDA生成量均隨著蘆葦葉黃酮類提取物劑量的增加而逐漸下降。蘆葦葉黃酮類提取物組的MDA生成量與正常對照組、模型對照組相比均具有顯著差異；蘆葦葉黃酮類提取物劑量達到300 mg/（kg·d）時，S180荷瘤小鼠血清中的MDA生成量顯著低于5-FU陽性對照組，為3.65 nmol/mL。

隨著蘆葦葉黃酮類提取物劑量的增加，各劑量組小鼠血清的SOD活力隨之上升，在蘆葦葉黃酮類提取物劑量達到300 mg/（kg·d）時，與模型對照組的SOD活力具有顯著差異，蘆葦葉黃酮類提取物劑量達到200 mg/（kg·d）時，SOD活力與5-FU陽性對照組即無顯著差異。

對小鼠血清中GSH-Px活性的研究表明，蘆葦葉黃酮類提取物各劑量組之間的GSH-Px活力差異顯著，并呈劑量-效應(yīng)關(guān)系，但與正常對照組相比仍具有顯著差異；蘆葦葉黃酮類提取物各劑量組的GSH-Px活力與模型對照組相比都具有顯著差異，表明蘆葦葉黃酮類提取物可以提高S180荷瘤小鼠體內(nèi)的GSH-Px活性；蘆葦葉黃酮類提取物在劑量達到300 mg/（kg·d）時，S180荷瘤小鼠的GSH-Px活力達到511.42 U/mL，而5-FU陽性對照組為517.61 U/mL，兩組間的差異不顯著，表明蘆葦葉黃酮類提取物具有較好的體內(nèi)抗氧化效果。

3 討 論

在一定劑量范圍內(nèi)，蘆葦葉黃酮類提取物能抑制大鼠肝組織勻漿及肝線粒體MDA的生成，可以抑制大鼠紅細胞氧化溶血，并具有量效關(guān)系，表現(xiàn)出一定的體外抗氧化活性。隨著劑量的增加，蘆葦葉黃酮類提取物可降低S180荷瘤小鼠血清中MDA的含量，提高SOD和 GSH-Px活性，從而提高荷瘤小鼠體內(nèi)抗氧化活性；而在促進荷瘤小鼠體內(nèi)抗氧化能力方面，300 mg/（kg·d）的蘆葦葉黃酮類提取物與10 mL/（kg·d）的5-FU沒有顯著差異。

李瑞光等[5]對蘆葦葉總黃酮清除超氧陰離子自由基（O2－·）、·OH、DPPH自由基及ABTS+·的作用研究表明蘆葦葉總黃酮具有很高的自由基清除活性，具有一定的體外抗氧化活性，但純化物較其粗提物清除O2－·、·OH、DPPH自由基及ABTS+·的能力有所下降。余曉紅等[8]用碘量法研究了蘆葦提取物對花生油的抗氧化作用，結(jié)果表明，蘆葦提取物具有較明顯的抗氧化作用，且抗氧化性隨著蘆葦提取物添加劑量的增大而提高。本實驗對蘆葦葉黃酮類提取物抑制大鼠肝組織勻漿、肝線粒體MDA的生成及抑制大鼠紅細胞氧化溶血作用進行了研究，結(jié)果表明其具有很好的體外抗氧化活性；對S180荷瘤小鼠血清MDA含量、SOD和GSH-Px活性影響的研究表明，蘆葦葉黃酮類提取物同樣具有一定的體內(nèi)抗氧化活性。大量研究表明，紅細胞（RBC）膜容易受到自由基的攻擊而引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，導致紅細胞膜的脆性提高， 甚至會改變細胞的完整性而導致溶血[15]。RBC在體外溫育條件下會發(fā)生自氧化反應(yīng)，易產(chǎn)生MDA，MDA是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物，不僅常用來評判脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的強弱，還能間接反映細胞損傷的程度[15]。本實驗的結(jié)果表明蘆葦葉總黃酮類提取物對肝組織勻漿、肝線粒體及紅細胞膜的氧化損傷有保護作用，揭示蘆葦葉黃酮類提取物可用于防止生物膜的氧化損傷，且其對MDA的含量的降低、SOD和GSH-Px活性的提高作用可能是保護生物膜的機制之一。本研究為豐富蘆葦葉黃酮類提取物的生理活性提供了理論依據(jù)，可為開發(fā)蘆葦黃酮藥物和功能性食品奠定基礎(chǔ)。

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Antioxidant Properties of Flavonoids Extracted from Leaves of Phragmites communis Trin. in vivo and in vitro

YU Xiaohong, ZHU Xuemei*, LI Fengwei, XUE Feng, PENG Yingyun
(School of Chemical and Biological Engineering, Yancheng Institute of Technology, Yancheng 224003, China)

The in vivo and in vitro antioxidant properties of flavonoids extracted with ethanol from the dry leaves of Phragmites communis Trin. (PCF) were studied by measuring the effects on hemolysis of rat red blood cells (RBCs) and MDA generation in liver homogenate and mitochondria in vitro. Results indicated that PCF in the concentration range of 0.5–10 mg/mL could inhibit the hemolysis of rat RBCs and the generation of MDA in rat liver homogenate and mitochondria in a dose-dependent manner, suggesting obvious antioxidant activity in vitro. Increased concentrations of PCF could enhance the activities of GSH-Px and SOD and reduce MDA levels in the serum of S180 tumor-bearing mice so as to have elevated antioxidant activity. PCF at the dose of 300 mg/(kg·d) had antioxidant activity comparable to that of 5-FU at 10 mL/(kg·d) for tumor-bearing mice in vivo.

Phragmites communis Trin. leaves; fl avonoids; antioxidant activity; i n vivo and in vitro

Q819

A

1002-6630（2015）01-0209-05

10.7506/spkx1002-6630-201501040

2014-07-06

江蘇省科技廳省產(chǎn)學研前瞻性聯(lián)合研究項目（BY2013057-03）；江蘇省教育廳江蘇省高?？蒲谐晒a(chǎn)業(yè)化推進項目（JHB2012-52）；江蘇省社會發(fā)展科技支撐基金資助項目（BE2011728）

余曉紅（1976—），女，副教授，博士，研究方向為食品微生物、天然產(chǎn)物分離及應(yīng)用。E-mail：yxh1127@163.com

*通信作者：朱雪梅（1965—），女，副教授，碩士，研究方向為應(yīng)用化學、天然產(chǎn)物分離及應(yīng)用。E-mail：zxm-yc@163.com