多酚-蛋白質(zhì)共價(jià)作用及其對(duì)食品體系的影響研究進(jìn)展

闞茗銘，葉發(fā)銀，趙國(guó)華 *

（西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715）

多酚-蛋白質(zhì)共價(jià)作用及其對(duì)食品體系的影響研究進(jìn)展

闞茗銘，葉發(fā)銀，趙國(guó)華 *

（西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715）

近年來多酚與蛋白質(zhì)間的相互作用及其對(duì)食品體系的影響受到人們的極大關(guān)注。按作用方式可將多酚與蛋白質(zhì)之間的相互作用分為非共價(jià)作用和共價(jià)作用。有關(guān)非共價(jià)作用的研究較完善，相比之下共價(jià)作用的研究報(bào)道非常少。為推動(dòng)對(duì)食品體系中多酚與蛋白質(zhì)共價(jià)作用的研究，在廣泛查閱文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，本文綜述了多酚與蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)合的機(jī)理、影響因素以及這種結(jié)合對(duì)食品體系感官特性、功能與營(yíng)養(yǎng)特性、安全性的影響，并進(jìn)一步提出了有關(guān)食品體系中多酚與蛋白質(zhì)共價(jià)作用今后的研究方向。

多酚；蛋白質(zhì)；共價(jià)作用；營(yíng)養(yǎng)；食品

大多數(shù)食品是多成分共存的復(fù)雜體系。在生產(chǎn)、加工、包裝、流通等過程中，食品中的不同成分之間可能發(fā)生相互作用進(jìn)而影響到食品的營(yíng)養(yǎng)、質(zhì)地、安全性等。近年來，針對(duì)食品成分之間的相互作用并據(jù)此調(diào)控食品品質(zhì)的研究已成為食品科學(xué)新的研究熱點(diǎn)。食品成分之間相互作用的研究能對(duì)復(fù)雜食品體系和現(xiàn)象做出合理的解釋。如對(duì)食品多糖與蛋白質(zhì)相互作用的研究能揭示食品體系的流動(dòng)性、穩(wěn)定性、質(zhì)地與口感形成的內(nèi)在原因[1]。作為食品體系常見的兩類物質(zhì)，研究表明多酚與蛋白質(zhì)能以非共價(jià)或共價(jià)方式在食品體系中發(fā)生相互作用。多酚與蛋白質(zhì)分子通過氫鍵、疏水相互作用和范德華力等分子間作用力發(fā)生可逆的非共價(jià)相互作用并對(duì)食品體系產(chǎn)生明顯的影響。如多酚與淀粉酶的非共價(jià)復(fù)合作用直接導(dǎo)致了淀粉消化速率的降低[2]。對(duì)多酚蛋白質(zhì)非共價(jià)作用的研究已有大量的報(bào)道和綜述，本文不再贅述。而有關(guān)多酚與蛋白質(zhì)之間的共價(jià)作用的研究相對(duì)較薄弱，其作用規(guī)律及對(duì)食品體系的影響還鮮為人知。為快速推動(dòng)這方面的研究，在廣泛調(diào)研文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，本文對(duì)食品體系中多酚與蛋白質(zhì)共價(jià)作用的機(jī)理、影響因素及其對(duì)食品體系的影響進(jìn)行了全面綜述，旨在為含有蛋白質(zhì)和多酚的食品加工提供有益幫助，以提升這類產(chǎn)品的質(zhì)量。

1 多酚與蛋白質(zhì)的共價(jià)結(jié)合機(jī)理

當(dāng)前的研究表明，多酚與蛋白質(zhì)的共價(jià)結(jié)合機(jī)理主要包括鄰醌機(jī)制[3-4]與碳正離子機(jī)制[5]。

1.1 鄰醌機(jī)制

多酚與蛋白質(zhì)的鄰醌結(jié)合機(jī)制主要分兩步完成。第一步是多酚被氧化形成鄰醌或半醌。多酚的氧化途徑主要有3 個(gè)：首先，在諸如酪氨酸酶或漆酶[4,6]的催化下，多酚發(fā)生酶促氧化生成鄰苯醌，酶促氧化的發(fā)生它需要同時(shí)出現(xiàn)3 個(gè)因素：氧、酚類化合物和多酚氧化酶；再者，食品體系中的活性氧可直接使多酚發(fā)生自動(dòng)氧化形成鄰苯半醌，pH值的增加會(huì)促進(jìn)自動(dòng)氧化的發(fā)生，在堿性或中性pH值時(shí)酚類物質(zhì)會(huì)以酚鹽形式存在，很容易由活性氧氧化形成鄰苯醌或鄰苯半醌[7]；另外，某些金屬陽離子如Fe3+，也能誘導(dǎo)多酚氧化形成鄰苯醌或鄰苯半醌,特別是溫度的增加，熱導(dǎo)會(huì)使酚類化合物氧化形成鄰苯醌、鄰苯半醌或降解酚類化合物的結(jié)構(gòu)[8-9]。多酚與蛋白質(zhì)的共價(jià)結(jié)合的第二步是通過鄰醌或半醌與蛋白質(zhì)分子中的巰基、氨基、亞氨基等發(fā)生親核加成反應(yīng)使多酚和蛋白質(zhì)之間形成C—N或C—S共價(jià)鍵[10-11]。圖1以咖啡酸為例給出了多酚與蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)合的鄰醌機(jī)制。

圖1 多酚與蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)合鄰醌機(jī)制示意圖（以咖啡酸為例）Fig.1 O-Quinone mechanism of the polyphenol-protein covalent interaction (caffeic acid as an example)

1.2 碳正離子機(jī)制

圖2 多酚與蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)合的碳正離子機(jī)制示意圖Fig.2 Carbocation mechanism of the polyphenol-protein covalent interaction

多酚與蛋白質(zhì)的碳正離子結(jié)合機(jī)制也主要分兩步完成。第一步是食品體系中的原花青素-黃烷復(fù)合物在酸性介質(zhì)中相對(duì)不穩(wěn)定，結(jié)構(gòu)相對(duì)脆弱，容易發(fā)生裂解，導(dǎo)致高聚的黃烷-3-醇的C4位有碳正離子的生成以及低聚黃烷-3-醇會(huì)釋放出黃烷-3-醇單體[12-14]。第二步是裂解形成的碳正離子與蛋白質(zhì)的親核基團(tuán)如巰基、氨基等發(fā)生加成反應(yīng)使多酚和蛋白質(zhì)之間形成C—N或C—S共價(jià)鍵，或者與外源性多肽鏈發(fā)生交聯(lián)[12]。圖2給出了多酚與蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)合的碳正離子機(jī)制。

2 影響多酚與蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)合的因素

影響食品體系中多酚與蛋白質(zhì)共價(jià)作用的因素主要包括多酚的濃度與性質(zhì)、蛋白質(zhì)的濃度與性質(zhì)以及食品體系的環(huán)境條件。

2.1 多酚的影響

多酚與蛋白質(zhì)的共價(jià)相互作用會(huì)受到多酚類型、濃度、分子質(zhì)量等因素的影響。Rawel等[15]研究發(fā)現(xiàn)在相同條件下槲皮素比蘆丁更容易與乳清蛋白（whey protein，WP）發(fā)生共價(jià)結(jié)合。與沒食子酸相比，蘆丁能以更高的強(qiáng)度與來自鱈魚皮的明膠共價(jià)結(jié)合從而形成更高強(qiáng)度的多酚交聯(lián)明膠凝膠[16]。Prodpran等[17]發(fā)現(xiàn)在相同濃度下單寧酸與魚肌纖維蛋白的共價(jià)作用明顯比咖啡酸、兒茶素和阿魏酸強(qiáng)。這些多酚的加入可使魚肌纖維蛋白膜具有更好的機(jī)械性能，而單寧酸的效果最佳。Dubeau等[18]發(fā)現(xiàn)紅茶中分子質(zhì)量較高的多酚（如茶黃素、茶紅素）更容易與牛奶蛋白結(jié)合。但Bartolome等[19]的結(jié)果則表明分子質(zhì)量較低的多酚（如對(duì)香豆酸、原兒茶酸、咖啡酸和肉桂酸等）與牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）有強(qiáng)的結(jié)合親和力，而對(duì)羥基苯甲酸與牛血清白蛋白之間沒有顯著的結(jié)合作用。有關(guān)多酚結(jié)構(gòu)對(duì)其與蛋白質(zhì)共價(jià)作用的影響規(guī)律還需完善。

2.2 蛋白質(zhì)的影響

蛋白質(zhì)的疏水性、溶解度、等電點(diǎn)、濃度、氨基酸組成以及多酚與蛋白質(zhì)的物質(zhì)的量比對(duì)多酚與蛋白質(zhì)的共價(jià)作用有明顯影響。Prigent等[20]發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)分子中賴氨酸殘基側(cè)鏈上的氨基（—NH2）比組氨酸和色氨酸殘基上的亞氨基（—NH—）更容易與鄰苯醌發(fā)生加成反應(yīng)，所以酪氨酸含量越高的蛋白質(zhì)與多酚發(fā)生共價(jià)結(jié)合作用的強(qiáng)度也越高。Rohn等[21]的研究則表明當(dāng)牛血清白蛋白與槲皮素的物質(zhì)的量比為2∶1時(shí)兩者的共價(jià)結(jié)合程度最高。

2.3 環(huán)境條件的影響

多酚與蛋白質(zhì)的相互作用對(duì)pH值、溫度等環(huán)境條件敏感。Wang Xiaoya等[22]發(fā)現(xiàn)pH值對(duì)α-乳清蛋白與表沒食子兒茶素沒食子酸酯（（－）-epigallocatechin gallate，EGCG）共價(jià)結(jié)合作用影響顯著。當(dāng)pH值為8.0時(shí)，α-乳清蛋白與EGCG的共價(jià)結(jié)合程度最高，pH值降低對(duì)此共價(jià)結(jié)合作用有負(fù)面影響，其主要原因是EGCG在堿性條件下更容易被氧化形成醌。更有意思的是，環(huán)境pH值甚至?xí)绊懙蕉喾优c蛋白質(zhì)的作用方式。有研究發(fā)現(xiàn)綠原酸在中性或酸性條件下（pH≤7）與牛血清白蛋白、溶菌酶和α-乳清蛋白以非共價(jià)作用結(jié)合，而在堿性條件下這種作用轉(zhuǎn)變?yōu)楣矁r(jià)方式，其根本原因仍然是多酚在堿性條件下更易被氧化形成醌。溫度對(duì)多酚蛋白質(zhì)共價(jià)作用的發(fā)生與強(qiáng)度有明顯影響。Prigent等[23]研究發(fā)現(xiàn)5-O-咖啡?？鼘幩崤c牛血清白蛋白在低溫下（如5、25 ℃）以非共價(jià)作用結(jié)合而在高溫下（60 ℃）會(huì)產(chǎn)生共價(jià)鍵，這是由于多酚在高溫容易發(fā)生氧化而生成醌類物質(zhì)。

3 多酚與蛋白質(zhì)共價(jià)作用對(duì)食品體系的影響

多酚與蛋白質(zhì)的共價(jià)相互作用對(duì)食品體系的感官特性、安全性以及多酚與蛋白質(zhì)的生物學(xué)與營(yíng)養(yǎng)學(xué)特性能產(chǎn)生影響。表1總結(jié)了多酚與蛋白質(zhì)相互作用對(duì)食品體系的影響。

3.1 對(duì)食品感官特性的影響

多酚與蛋白質(zhì)的共價(jià)作用會(huì)引起食品體系混濁度、顏色、風(fēng)味等的變化。Soares等[24]發(fā)現(xiàn)唾液蛋白（尤其是富含脯氨酸的酸性蛋白（acidic prolin e-rich proteins，APRPs））與單寧的共價(jià)相互作用會(huì)形成大量不溶性聚集體而體系的混濁度增加。Wang Xiaoya等[22]發(fā)現(xiàn)60 ℃時(shí)在接近中性條件時(shí)（pH 6～8），EGCG與α-乳清蛋白的共價(jià)作用會(huì)使體系的濁度降低。Xu等[25]發(fā)現(xiàn)來自油菜籽餅粕的蛋白質(zhì)和多酚在水相體系中能形成共價(jià)復(fù)合物，這與油菜籽蛋白產(chǎn)品的顏色變暗和不良風(fēng)味的出現(xiàn)關(guān)系密切。Prodpran等[17]發(fā)現(xiàn)多酚（咖啡酸、兒茶素、阿魏酸和單寧酸）與魚肌纖維蛋白的共價(jià)作用會(huì)導(dǎo)致可食性魚肌纖維蛋白膜的透明度下降、顏色變暗、亮度下降，且這種影響隨多酚用量的增加而更加明顯。

3.2 對(duì)多酚生物學(xué)效應(yīng)的影響

多酚與蛋白質(zhì)的共價(jià)相互作用對(duì)食品體系中的形態(tài)、抗氧化力和生物利用率均有明顯的影響。有多篇有關(guān)添加牛奶對(duì)茶或咖啡多酚抗氧化能力影響的文獻(xiàn)，但研究結(jié)果各不一樣。其主要原因是使用的抗氧化評(píng)價(jià)方法不一致。Niseteo等[27]發(fā)現(xiàn)添加牛奶會(huì)導(dǎo)致速溶咖啡中總酚、綠原酸衍生物、咖啡因含量及其抗氧化力明顯降低?？Х戎锌偡?、綠原酸衍生物、咖啡因含量實(shí)際是由于這些物質(zhì)與蛋白質(zhì)結(jié)合使多酚從游離態(tài)轉(zhuǎn)化為結(jié)合態(tài)而無法被作者所采用的Folin-Ciocalteu法測(cè)定。Dubeau等[18]用3 種抗氧化評(píng)價(jià)方法（ABTS+·清除法、伏安法和脂質(zhì)過氧化抑制法）研究了牛奶對(duì)綠茶、大吉嶺茶和英國(guó)早餐茶中多酚抗氧化能力的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)牛奶會(huì)使由ABTS+·清除法和伏安法測(cè)定的茶的抗氧化能力下降而使由脂質(zhì)過氧化抑制法測(cè)定的茶的抗氧化能力提高。其原因與牛奶蛋白和茶葉中多酚物質(zhì)的共價(jià)作用密切相關(guān)。ABTS+·清除法和伏安法測(cè)定的主要是體相中由游離多酚決定的抗氧化能力，多酚-蛋白質(zhì)的共價(jià)相互作用明顯使這一能力削弱。而脂質(zhì)過氧化抑制法測(cè)定的主要是油水界面上由蛋白質(zhì)決定的抗氧化能力，多酚-蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)合物比游離蛋白質(zhì)具有更好的乳化活性和抗氧化性，使得這一結(jié)果得以提升。Rohn等[21]發(fā)現(xiàn)槲皮素與牛血清白蛋白的共價(jià)結(jié)合物的抗氧化性（Trolox當(dāng)量抗氧化力）明顯低于游離的槲皮素。Duarte等[28]發(fā)現(xiàn)牛奶中的清蛋白和酪蛋白能與咖啡中的綠原酸發(fā)生共價(jià)作用，這是導(dǎo)致牛奶與咖啡同時(shí)攝入時(shí)機(jī)體對(duì)咖啡中綠原酸代謝效率急劇下降的直接原因。巧克力黃酮類化合物與牛奶蛋白的相互作用會(huì)大幅度降低巧克力中黃酮化合物被吸收進(jìn)入血液的數(shù)量[30]，而巧克力在加工時(shí)加入牛奶的影響比巧克力與牛奶同時(shí)攝入的影響要更嚴(yán)重。多酚與蛋白質(zhì)的共價(jià)作用與非共價(jià)作用往往同時(shí)發(fā)生，很難完全區(qū)分開它們對(duì)食品體系的影響，再加上實(shí)驗(yàn)方法、儀器、條件等的不同，導(dǎo)致研究結(jié)果也各不一樣，所以多酚與蛋白質(zhì)相互作用對(duì)多酚生物學(xué)效應(yīng)的影響還需要更深入的研究，希望在以后能在明確區(qū)分是共價(jià)作用還是非共價(jià)作用的情況下更深入的研究對(duì)多酚生物學(xué)效應(yīng)的影響。

3.3 對(duì)蛋白質(zhì)生物學(xué)效應(yīng)的影響

多酚與蛋白質(zhì)共價(jià)作用對(duì)蛋白質(zhì)的影響主要表現(xiàn)在提高蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性、抗氧化活性和乳化活性而降低蛋白質(zhì)的生物利用率和抗原性等。Almajano等[26]認(rèn)為蛋白質(zhì)（酪蛋白等）與EGCG溶液在混合初期主要為非共價(jià)復(fù)合作用而在后期可能發(fā)生共價(jià)加合作用，而這種作用能使蛋白質(zhì)的抗氧化能力明顯得以提升。Wang Xiaoya等[22]的研究也表明，與α-乳白蛋白相比，α-乳白蛋白-EGCG共價(jià)復(fù)合物的抗氧化活性和乳化活性更強(qiáng)。O’Connell等[8]發(fā)現(xiàn)添加5.5 mmol/L的咖啡酸能顯著提升牛奶在高溫（140～150 ℃）下的熱穩(wěn)定性。但多酚對(duì)蛋白質(zhì)的影響與多酚的種類和結(jié)構(gòu)關(guān)系密切。Yan Mingyan等[16]研究發(fā)現(xiàn)用蘆丁交聯(lián)能顯著增加明膠干凝膠的熱穩(wěn)定性，但溶脹率有所降低；而沒食子酸交聯(lián)對(duì)明膠干凝膠的熱穩(wěn)定性和溶脹率均無影響。Strauss等[31]同樣發(fā)現(xiàn)用酚酸、槲皮素、蘆丁交聯(lián)能大幅度提升明膠微粒的熱穩(wěn)定性。Rawel等[32]發(fā)現(xiàn)與酚酸、槲皮素、楊梅酮的共價(jià)作用對(duì)大豆球蛋白熱穩(wěn)定性有益，但與黃酮、芹黃素、山奈酚的共價(jià)作用則對(duì)大豆球蛋白的熱穩(wěn)定性無影響。

多酚與蛋白質(zhì)的共價(jià)作用往往導(dǎo)致蛋白質(zhì)的生物利用率降低但抗原性也明顯減弱。Arimboor等[29]發(fā)現(xiàn)沙棘原花青素與牛血清白蛋白的共價(jià)作用會(huì)導(dǎo)致后者被胃蛋白酶和胰蛋白酶水解的速度顯著下降，損害其生物利用率。Rawel等[33]研究發(fā)現(xiàn)與綠原酸的共價(jià)結(jié)合作用會(huì)極大地降低牛血清白蛋白被胃蛋白酶和胰蛋白酶消化的速率，且降低的幅度隨共價(jià)結(jié)合程度的增大而增大。但必須指出只有與綠原酸的共價(jià)結(jié)合程度較低時(shí)（5.1～7.1 mol綠原酸/mol BSA），牛血清白蛋白被胰凝乳蛋白酶消化的速率才有顯著降低。?wieca等[34]發(fā)現(xiàn)洋蔥皮多酚與小麥粉中蛋白質(zhì)的相互作用直接導(dǎo)致了添加4%的洋蔥皮面包蛋白質(zhì)的消化率（55%）顯著低于未添加者的（78.4%）。Tantoush等[35]發(fā)現(xiàn)與酸櫻桃酚類物質(zhì)的非二硫鍵共價(jià)作用能明顯降低酶交聯(lián)β-乳球蛋白的過敏原性?？Х人釋?duì)酶交聯(lián)β-酪蛋白的過敏原性也有減弱作用[36]，同樣發(fā)現(xiàn)與咖啡酸的共價(jià)作用能使花生蛋白的致敏性降低[37]。常見多酚降低櫻桃過敏原Pru av 1的強(qiáng)弱順序?yàn)榭Х人岷捅韮翰杷兀緝翰杷睾蜎]食子酸＞槲皮素和蘆丁[38]。

4 結(jié) 語

在食品生產(chǎn)與加工過程中，酚類物質(zhì)與蛋白質(zhì)接觸而發(fā)生各種相互作用，常常會(huì)導(dǎo)致感官品質(zhì)變壞，會(huì)降低蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，造成富含多酚食品的營(yíng)養(yǎng)損失等。而且多酚與蛋白質(zhì)的共價(jià)相互作用并非占主導(dǎo)，在一些研究中觀察到并非只有蛋白質(zhì)與酚類化合物的相互作用，食物中的其他物質(zhì)與此同時(shí)也可能發(fā)生作用、產(chǎn)生影響，所以如何有效區(qū)分多酚與蛋白質(zhì)共價(jià)作用與非共價(jià)作用，以及如何區(qū)分多酚與其他物質(zhì)作用對(duì)食品體系的影響還需要更深入的研究；其次，目前很多有關(guān)多酚與蛋白質(zhì)相互作用的研究是在模擬體系中進(jìn)行的，不同的消化酶、不同胃消化模擬模型等都對(duì)體外消化率的測(cè)定結(jié)果等有影響，從而還需要加強(qiáng)在真實(shí)食品體系中多酚與蛋白質(zhì)的共價(jià)作用的研究；再者，我們還應(yīng)進(jìn)一步了解不同種類的多酚與蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)合的確切作用機(jī)制，以及更深入地從化學(xué)反應(yīng)的熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)角度來分析兩者發(fā)生共價(jià)結(jié)合的可能性和反應(yīng)的速度、程度等，從而可利用多酚與蛋白質(zhì)的共價(jià)作用改良含有蛋白質(zhì)和酚類食品的質(zhì)地、加工工藝條件和工藝參數(shù)等，有利于幫助研發(fā)具有更高營(yíng)養(yǎng)和健康價(jià)值的新食品產(chǎn)品；另外，腸道微生物對(duì)抗消化多酚-蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)合物及其部分降解物的代謝機(jī)制還不清楚，有關(guān)這方面的研究也還亟需加強(qiáng)。總之，蛋白質(zhì)和酚類化合物的相互作用是復(fù)雜的，尤其是兩者間的共價(jià)相互作用更需要做進(jìn)一步的研究，以便更好地了解蛋白質(zhì)-酚類化合物的相互作用機(jī)制及其影響因素。

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Advance in Research on Covalent Interactions of Polyphenol and Protein and Their Effects on Food System

KAN Mingming, YE Fayin, ZHAO Guohua*
(College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China)

Recently, the interactions between polyphenols and proteins have attracted increasing scientifi c interest. Based on the mode of their interactions, the interactions between polyphenols and proteins can be divided into two categories known as the non-covalent interaction and the covalent interaction. While extensive studies have been conducted on the non-covalent interactions, little research is available on the covalent interactions. Based on an extensive literature review, this paper overviews the mechanism of covalent interactions between polyphenols and proteins, factors affecting their interactions, and the effects of these interactions on the food system. It has been shown that the covalent interactions of polyphenol and protein are partially responsible for the sensory properties, functional and nutritional properties and safety of the food system. Finally, future research directions in this area are also discussed.

polyphenols; proteins; covalent interactions; nutrition; food

TS201.4

A

1002-6630（2015）01-0245-05

10.7506/spkx1002-6630-201501047

2014-02-09

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31371437）

闞茗銘（1990—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称钒踩c質(zhì)量控制。E-mail：kmm1212@yeah.net

*通信作者：趙國(guó)華（1971—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称坊瘜W(xué)與營(yíng)養(yǎng)學(xué)。E-mail：zhaoguohua1971@163.com